Kanker payudara merupakan kanker dengan prevalensi yang cukup tinggi di dunia yaitu 11,6%, sedangkan di Indonesia prevalensi kanker payudara meningkat dari 1,4% pada tahun 2013 menjadi 1,8% pada tahun 2018. ER, HER2 dan EGFR merupakan biomarker molekuler untuk prognosis spesifik dan tindakan prediktif pada pasien kanker payudara. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antikanker target ekstrak lunasin (ET-Lun) dari biji kedelai secara in silico dan in vitro.
Dalam pengujian silico menggunakan program Autodock Vina, senyawa aktif dalam ekstrak, yaitu genistein, daidzein, coumesterol, carotene, phytoalexin dan lunasin sebagai ligan, diteliti ikatannya dengan protein ER (ERS1 dan ESR2), HER2 dan EGFR. Selanjutnya untuk uji in vitro, aktivitas sitotoksik ekstrak diamati dengan uji MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide terhadap sel kanker payudara MCF-7. Uji in vitro menunjukkan bahwa ET-Lun bersifat sitotoksik terhadap sel kanker payudara dengan nilai CC50 sebesar 103 µg/mL.
KESIMPULAN: Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa ET-Lun memiliki aktivitas antikanker payudara secara in silico dan in vitro.
PENDAHULUAN
- Latar Belakang Masalah
- Masalah Penelitian
- Tujuan Penelitian
- Urgensi Penelitian
ET-Lun merupakan ekstrak kasar yang selain mengandung lunasin, juga mengandung isoflavon dan senyawa aktif lainnya yang diharapkan dapat memberikan efek sinergis antikanker. Beberapa penelitian yang telah dilakukan mengenai aktivitas ET-Lun adalah bahwa ET-Lun dapat menurunkan ekspresi COX-2 secara signifikan pada dosis 150 mg/kg BB dan 200 mg/kg BB mencit dengan p<0,05 dan menurunkan ekspresinya. iNOS dengan dosis 150 mg/kg BB tikus (Wjiasih, et al, 2017). Penelitian selanjutnya pada varietas dan kadar ET-Lun yang sama menunjukkan aktivitas dalam menghambat jumlah sel Goblet dan kepadatan mikrovessel (Putri et al, 2017), menghambat kanker usus besar dengan meningkatkan apoptosis pada dosis 150 mg/kg. Tikus BB dan reduksi displasia pada dosis 200 mg/kg BB tikus (Amalia, 2017).
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menganalisis aktivitas antikanker ekstrak lunasin (ET-Lun) target payudara dari biji kedelai secara in silico dan in vitro. Salah satu langkah awal dalam upaya merancang dan mengembangkan obat antikanker baru adalah pendekatan in silico. Salah satu uji in silico dilakukan dengan menghubungkan molekul calon senyawa obat dengan reseptor yang dipilih.
Untuk uji in vitro, uji sitotoksisitas ET-Lun akan dilakukan pada garis sel MCF7 menggunakan metode MTT dan uji imunositokimianya untuk ekspresi ER, HER2 dan EGFR.
TINJAUAN PUSTAKA
ET-Lun merupakan ekstrak target lunasin yang diperoleh dengan cara mengekstraksi lunasin dari bubuk biji kedelai yang dihilangkan lemaknya kemudian diekstraksi dengan PBS dengan pH kurang lebih 7,4 (Kusmardi, 2019). Pada penelitian ini akan dikembangkan aktivitas ET-Lun pada kanker payudara secara in silico dan in vitro. Salah satu teknik vHTS yang dapat dilakukan adalah uji in silico untuk mengetahui afinitas ligan (senyawa) terhadap protein (reseptor).
Pengujian in silico telah menjadi metode yang digunakan untuk memulai penemuan obat baru dan meningkatkan efisiensi dalam mengoptimalkan aktivitas senyawa induk. Penggunaan uji in silico adalah untuk memprediksi, memberikan hipotesis, memberikan penemuan baru atau kemajuan baru dalam pengobatan dan terapi. Docking adalah upaya menyelaraskan ligan yang merupakan molekul kecil dengan reseptor yang merupakan molekul protein besar.20 Pada penelitian ini dilakukan uji in silico pada beberapa senyawa aktif ET-Lun terhadap ER , HER2 dan EGFR (reseptor) ).
Uji in vitro: Uji sitotoksik ET-Lun terhadap breast cancer cell line (MCF7) dengan metode MTT.
METODE PENELITIAN
- Alur Penelitian
- Lokasi penelitian
- Alat dan Bahan Penelitian
- Prosedur penelitian
- Analisis data
Untuk menghilangkan lemak, supernatan (ekstrak kedelai) dicampur dalam 100 ml heksana dan dikocok selama 2 jam. Larutan standar: Pipet 2 mL larutan timbal standar (20 µg Pb) ke dalam tabung pembanding warna 50 mL dan encerkan dengan air hingga 25 mL. Larutan uji: Tambahkan 25 ml larutan uji ke dalam tabung perbandingan 50 ml, atau larutkan dan encerkan dengan air hingga 25 ml jumlah zat uji dalam g dihitung dengan rumus: 2.0.
Larutan monitor: 25 ml larutan yang sama dengan larutan uji ditempatkan dalam tabung pembanding warna 50 ml dan 2,0 ml larutan timbal standar ditambahkan. Dari hasil homogenisasi pada sediaan sampel, 1 mL pengenceran 10-1 dipipet ke dalam tabung yang berisi pengencer PDF pertama hingga diperoleh pengenceran 10-2 dan dikocok hingga homogen. Dari hasil homogenisasi pada sediaan sampel, 1 mL pengenceran 10-1 dipipet ke dalam tabung PDF pertama untuk mendapatkan suspensi dengan pengenceran 10-2 dan dikocok hingga homogen.
Dari hasil homogenisasi pada preparasi sampel, 1 mL pengenceran 10-1 dipipet ke dalam tabung ASA pertama hingga diperoleh pengenceran 10-2 dan dikocok hingga homogen. Uji alkaloid: 100 mg ekstrak dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi, ditambahkan 1 mL HCL 2N dan 9 mL air suling, dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100°C selama 2 menit, kemudian didinginkan dan disaring. Saponin: 0,5 g ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik.
Uji tanin: 100 mg ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 2 mL akuades, direbus dalam penangas air pada suhu 100oC selama 5 menit, kemudian didinginkan dan disaring. Uji Triterpenoid: 100 mg ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 2 mL etanol, dipanaskan di atas penangas air, kemudian didinginkan dan disaring. Kemudian ditempatkan dalam T-flask yang dibuat Laminar Air Flow (LAF), kemudian disimpan dalam lemari es (CCRC 2013).
Kemudian tambahkan 100 µl larutan uji pada masing-masing well dengan konsentrasi yang ditentukan pada masing-masing well secara rangkap tiga dan tempatkan kembali dalam inkubator CO2 selama 24 jam pada suhu 37oC. IC50 diperoleh dengan memasukkan nilai 5 sebagai probit ke dalam persamaan linier dan kemudian mensubstitusi antilogaritma hasilnya.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Parameter yang diamati pada uji in silico adalah energi bebas ikatan (ΔGbinding), afinitas (konstanta inhibitor), ikatan hidrogen, residu asam amino dan konformasi struktur ligan dengan reseptor ER (ESR1 dan ESR2), HER2 dan EGFR. Hasil uji in silico menunjukkan bahwa semua ligan memiliki afinitas pengikatan terhadap ESR1, ESR2 dan EGFR (ΔG<0). Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental invitro untuk melihat pengaruh pemberian ekstrak target Lunasin (ET-Lun) dibandingkan dengan kontrol positif yaitu 5-Fluorouracil (5-FU), kontrol negatif (sel yang tidak diberi perlakuan) pada sel MCF-7.
Hal ini dapat dilihat dengan penurunan sesuai dengan besarnya konsentrasi kedua senyawa uji yang diberikan terhadap sisa persentase sel MCF-7 yang masih hidup. Pada penelitian ini, parameter yang diamati pada uji in silico adalah energi bebas ikatan (ΔG binding), afinitas (pKi = konstanta inhibitor), ikatan hidrogen, residu asam amino dan konformasi struktur ligan dengan reseptor. Pengikatan ligan pada reseptor HER2 mencegah aktivasi tirosin kinase intraseluler, mencegah transkripsi.8 Hasil interaksi lunasin dengan HER2 (Gambar 3) menunjukkan bahwa ada pengikatan lunasin dengan HER2, tetapi pengikatan ini tidak ada pada yang aktif. , sehingga tidak menunjukkan aktivitas penghambatan tirosin kinase dan tidak bertindak sebagai antagonis HER2.
Hasil persentase sel MCF-7 yang viabel menggunakan metode MTT dengan kadar ekstrak kedelai yang berbeda dapat dilihat pada Gambar 2. Pada sel MCF-7 terlihat kurva bahwa perlakuan ekstrak kedelai mengandung luas dan 5-FU pada sel MCF -7 dapat menginduksi kematian sel. Hal ini terlihat dari penurunan persentase sel MCF-7 dengan peningkatan konsentrasi ekstrak kedelai dan 5-FU.
Korelasi atau hubungan antara konsentrasi ekstrak kedelai yang diberikan dengan persentase sel MCF-7 hidup adalah R2=0,9284 dan korelasi 5-FU adalah R2=0,8599. Nilai R2 yang mendekati 1 menunjukkan nilai yang baik dan terjadi peningkatan hubungan antara kedua variabel10, sehingga terdapat hubungan antara konsentrasi ekstrak kedelai dan 5-FU (senyawa uji) dengan persentase penurunan viabilitas MCF-7 sel. Semakin besar konsentrasi senyawa uji yang diberikan pada sel MCF-7, semakin kecil persentase sel MCF-7 yang layak.
Berdasarkan hasil uji sitotoksik ET-Lun dan 5-FU, terlihat bahwa aktivitas sitotoksik ekstrak kedelai terhadap sel MCF-7 hampir tiga kali lebih besar dibandingkan aktivitas sitotoksik 5-FU. Pada sel MCF-7, ekstrak kedelai juga bersifat sitotoksik dengan menginduksi produksi reactive oxygen species (ROS) untuk fragmentasi DNA, upregulasi p53/p21, menginduksi cell cycle arrest pada fase G1/S, dan mengaktifkan caspases 9/3.13 5- FU yang digunakan sebagai kontrol positif pada sel MCF-7 tidak bersifat sitotoksik terhadap sel. Terlihat bahwa rentang konsentrasi yang digunakan tidak menghambat setengah dari populasi sel MCF-7, sehingga diperlukan kontrol positif lain seperti tamoxifen.
KESIMPULAN DAN SARAN
LUARAN YANG DICAPAI
Impact of soy products on breast cancer development and prognosis of breast cancer patients. Discovery of an acrylic acid-based tetrahydroisoquinoline as an orally bioavailable selective estrogen receptor scavenger for ERα+ breast cancer. Cytotoxic activity of soybean phytoestrogen coumestrol against human breast cancer MCF-7 cells: understanding the molecular mechanism.
Background / Objective: Breast cancer is the most common type of cancer in Indonesia as well as in the world. The aim of this study was to investigate in vitro against breast cancer soybean extract with target lunas (ET-Lun) and bind different ligands of its components to target the protein of ESR1, ESR2, HER2 and EGFFR as biomarkers molecular in the breast. cancer. Method: In vitro assay, the cytotoxic activity of the extract was observed using the MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay against MCF-7 breast cancer cells.
Result: In vitro studies showed ET-Lun to be cytotoxic against breast cancer cells with a CC50 value of 103 µg/mL. Conclusion: These results indicate that ET-Lun has anti-breast cancer activity in vitro. The in silico test showed that all the active compounds from soybean seed were active against ESR2 agonist breast cancer and inhibited ESR1, HER2, and EGFR, except for Lunasin, which did not work on HER2.
The aim of this study was to analyze the action of ET- against breast cancer. The curve showed that ET-Lun treatment of MCF7 breast cancer cell culture could induce cell death. Standardization of medicinal plants is necessary to ensure the effectiveness, safety, stability and quality of phytocomponents in medicinal plants. 4 The soybean plant is one of the plants whose activity is developing as a medicinal plant. 12 In this research, the extraction of soybean seed powder according to the previous research procedure. 28 ,30.
These results indicate that the ET-Lun has an anti-breast cancer activity in vitro. In insilico analysis showed that all active components of the soybean seed had activity as anti-breast cancer by inhibiting ESR1, HER2 and EGFR, and agonist of ESR2, except that Lunasin has no activity for HER2. Impact of soy products on breast cancer development and prognosis of breast cancer patients.
Lunasin suppresses the migration and invasion of breast cancer cells by inhibiting matrix metalloproteinase-2/-9 via the FAK/Akt/ERK and NF-κB signaling pathways.
RENCANA TINDAK LANJUT DAN PROYEKSI
