Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari peran NF-kB dalam kelangsungan hidup CSC melalui regulasi antioksidan dan kelayakan layanan. Kesimpulan: Terdapat peningkatan ekspresi mRNA NF_kB pada CSC payudara, peningkatan aktivitas katalase spesifik dan Gpx baik pada CSC payudara maupun CSC non payudara, serta tidak menurunkan viabilitas CSC-payudara dibandingkan non-CSC.
Latar belakang
Hal ini menunjukkan CSC payudara (CD24-/CD44+) mempunyai mekanisme pertahanan terhadap peningkatan pembentukan O2.- yang menyebabkan resistensi terhadap induksi rotenon, sehingga viabilitas sel tetap terjaga. Pemberian H2O2 pada CSC payudara (CD24-/CD44+) meningkatkan ekspresi NF-kB dan menyebabkan peningkatan aktivitas spesifik enzim antioksidan katalase (CAT) dan glutathione peroksidase (GPx) serta mempengaruhi viabilitas sel?
Pertanyaan penelitian
Oleh karena itu, NF-kB dapat menjadi target pengembangan obat antikanker dengan menghambat NF-kB, yang dapat meningkatkan respons pembunuhan pada kanker kolorektal, kanker pankreas, sarkoma, dan kanker payudara [13]. Dalam penelitian ini, ekspresi NF-kB pada CSC payudara (CD24-/CD44+) yang diobati dengan H2O2 akan dianalisis, serta hubungannya dengan status antioksidan dan viabilitas sel.
Tujuan penelitian 1. Tujuan umum
Tujuan khusus
3 Universitas Indonesia tentang proses inflamasi, imunitas, proliferasi sel dan apoptosis melalui jalur klasik dan non klasik (alternatif) 11 Gangguan NF-kB mengaktifkan kaskade terkait patogenesis beberapa penyakit seperti kanker, aterosklerosis, dan artritis reumatoid 12 Tumor dengan aktivitas NF-κB biasanya menunjukkan peningkatan resistensi terhadap kemoterapi. Dengan menganalisis hubungan antara ekspresi mRNA NF-kB dan aktivitas spesifik CAT, GPx, MnSOD dan viabilitas sel pada CSC payudara (CD24-/CD44+) dan CSC non-payudara (CD24-/CD44-) yang diobati dengan H2O2.
Manfaat penelitian
Analisis aktivitas spesifik CAT dan GPx pada CSC payudara (CD24-/CD44+) dan CSC non-payudara (CD24-/CD44-) yang diobati dengan H2O2.
Kanker payudara
Ada dua jenis operasi kanker payudara, mastektomi (pengangkatan seluruh payudara) dan lumpektomi (pengangkatan sebagian payudara). Pengobatan kanker payudara konvensional masih kurang optimal dalam mengobati pasien kanker payudara, meskipun diberikan terapi tambahan.
Sel punca kanker payudara
Penanda ini membedakan subpopulasi CSC payudara dari subpopulasi lain pada jaringan kanker heterogen. 22 CD44+/CD24- adalah kriteria khusus yang digunakan untuk mengisolasi CSC payudara dari jaringan kanker payudara. Banyak penelitian yang mempelajari karakteristik CSC payudara dan berfokus pada CSC payudara sebagai target pengembangan terapi kanker sejak subpopulasi CSC payudara ditemukan. 15 Terapi yang tidak spesifik atau tidak menargetkan CSC akan menyebabkan penyusutan tumor, sementara CSC dapat diperbarui atau bereplikasi.
ROS dan radikal bebas
Struktur
Faktor transkripsi NF-kB ditemukan pada tahun 1986 sebagai faktor inti yang berikatan dengan elemen penambah rantai ringan imunoglobulin kappa sel B yang teraktivasi.Sebanyak lima anggota keluarga faktor transkripsi telah diidentifikasi, yaitu NF-kB1, NF- kB2 RelA (p65 ), RelB dan c-Rel.
Jalur persinyalan
Meskipun ada beberapa pengecualian di mana NF-κB berkontribusi terhadap kematian sel, dalam banyak kasus ekspresi target gen NF-κB biasanya meningkatkan kelangsungan hidup sel. Crosstalk dari NF-κB ke JNK diketahui mencegah aktivasi JNK yang berkelanjutan, sehingga mencegah kematian sel melalui apoptosis dan nekrosis13.
Antioksidan sebagai target NF-kB
- Mangan Superoxide Dismutase (MnSOD)
- Katalase
- Glutation peroksidase
Salah satu jalur pensinyalan utama yang melintasi NF-kB terkait dengan ROS dan kematian sel adalah cross talk yang terjadi antara NF-kB dan JNK. Glutathione peroksidase (GPx): H2O2 + 2GSH GS-SG + 2H2O Pada sel eukariotik, SOD terdiri dari tiga isoform, yaitu SOD1 (Cu/ZnSOD), SOD2 (MnSOD) dan SOD3 (SOD ekstraseluler/EC-SOD).
Real Time PCR
Selama nilai CT diukur dalam fase eksponensial dengan reagen yang cukup, qPCR waktu nyata dapat digunakan untuk menghitung jumlah templat dalam reaksi secara akurat. Gradien suhu anil 55°C - 72°C. . Reaksi PCR pada suhu 62,2°C menunjukkan nilai CT terendah dan terpilih sebagai suhu optimal.33. Setelah nilai CT diukur, ada beberapa metode yang dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi ekspresi gen target dalam sampel uji, relatif terhadap sampel kalibrator, antara lain: 1) Metode Livak, dikenal juga dengan metode 2-DDCT;
Desain penelitian
Tempat dan waktu penelitian
Sampel penelitian
Alur penelitian
- Bahan penelitian
- Alat penelitian
- Isolasi RNA total dengan Tripure Isolation Kit®
- Penghitungan konsentrasi RNA total
- Penghitungan konsentrasi protein total
- Pengukuran aktivitas spesifik katalase
- Pengukuran aktivitas spesifik glutation peroksidase
- Analisis ekspresi mRNA NF-kB dengan Real Time RT-PCR
- Analisis viabilitas sel dengan MTS Assay Promega®
- Analisis statistik
Tutup tabung, balikkan beberapa kali agar tercampur dan inkubasi selama 2-3 menit pada suhu 15-25ºC untuk mengendapkan DNA. Ke dalam tabung baru yang berisi fenol, etanol dan protein ditambahkan 0,75 ml isopropanol untuk mengendapkan protein, kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu 15-25ºC. Setelah dicuci, ditambahkan 1 ml etanol 100% ke dalam endapan protein, kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu 15-25ºC dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 7500xg pada suhu 2-8ºC.
Analisis aktivitas spesifik katalase 1. Optimasi kinetik katalase
Optimasi sampel
Data aktivitas katalase spesifik untuk CSC payudara (CD24-/CD44+) dan CSC non-mammae (CD24-/CD44-) dinormalisasi ke aktivitas katalase spesifik kelompok kontrol (tanpa perlakuan H2O2). Data aktivitas glutathione peroksidase spesifik dari CSC payudara (CD24-/CD44+) dan CSC non-mammae (CD24-/CD44-) dinormalisasi menjadi aktivitas glutathione peroksidase spesifik dari kelompok kontrol (tanpa perlakuan H2O2). Hubungan antara aktivitas glutathione peroksidase spesifik CSC payudara (CD 24-/CD44+) dan CSC non-mammae (CD24-/CD44-).
Rasio aktivitas spesifik glutathione peroksidase pada CSC payudara (CD 24-/CD44+) dan CSC non-payudara (CD24-/CD44-) terhadap kontrol. Tidak ada perbedaan yang signifikan antar kelompok dalam rasio aktivitas spesifik glutathione peroksidase pada CSC payudara dibandingkan dengan CSC non-payudara (Kruskal Wallis, p=0,073). Terdapat perbedaan yang signifikan pada rasio viabilitas sel antara kelompok rasio CSC payudara dibandingkan dengan rasio CSC non payudara.
Ekspresi mRNA NF-kB melalui Real Time RT-PCR
Konsentrasi RNA total
41 Universitas Indonesia Hasil isolasi RNA total CSC payudara (CD24-/CD44+) dan (CD24-/CD44-) diukur serapan cahayanya dengan sinar UV panjang gelombang 260 nm menggunakan instrumen Varioskan Flash ® dari Thermo Scientific .
Analisis ekspresi mRNA NF-kB dengan Real Time RT-PCR
43 Ekspresi mRNA NF-kB Universitas Indonesia pada CSC payudara (CD24-/CD44+) dan CSC non-payudara (CD24-/CD44-) berdistribusi normal dengan nilai p>0,05. Analisis data ekspresi mRNA NF-kB pada CSC payudara (CD24-/CD44+) dan CSC non-payudara (CD24-/CD44-) dilakukan dengan uji ANOVA yang ditunjukkan pada Gambar 4.6.A, sedangkan analisis data rasio ekspresi NF-kB mRNA pada payudara CSC (CD24-/CD44+) dibandingkan payudara non-CSC (CD24-/CD44-) dilakukan dengan uji Kruskal Wallis karena sebaran data tidak normal p<0,05 seperti terlihat pada Gambar 4.6 .B. Terdapat perbedaan yang signifikan antara kelompok dalam rasio ekspresi mRNA NF-kB pada CSC payudara (CD24-/CD44+) dibandingkan dengan CSC non-payudara (CD24-/CD44-) (Kruskal Wallis, p=0,016).
Analisis hubungan ekspresi NF-kB
Analisis hubungan ekspresi mRNA NF-kB payudara non-CSC (CD24-/CD44-) dengan aktivitas spesifik katalase, aktivitas spesifik GPx, viabilitas sel, dan aktivitas spesifik MnSOD. Fraksi sel (CD24-/CD44-) yang juga menjadi cell line merupakan sampel yang digunakan dalam penelitian ini sebagai CSC non payudara. Pada penelitian ini, H2O2 digunakan untuk diberikan pada CSC payudara (CD24-/CD44+) dan CSC non-payudara (CD24-/CD44+) sehingga menimbulkan stres oksidatif.
Analisis aktivitas spesifik katalase 1. Optimasi kinetik katalase
Hasil optimasi substrat menunjukkan pengenceran substrat 4000 kali lipat menghasilkan nilai laju reaksi per satuan waktu tertinggi yaitu 0,003 seperti terlihat pada Tabel 4.3. Meskipun pengenceran substrat 1000 kali lipat menghasilkan serapan delta tertinggi, namun nilai serapan sebesar 1,4 terletak pada dataran tinggi atau non linier (persamaan Beer Lambert). Pada garis dataran tinggi, substrat sudah jenuh dengan enzim, sehingga walaupun substrat terus ditambahkan tidak akan meningkatkan pengikatan enzim ke substrat.
Aktivitas spesifik katalase
50 payudara Universitas Indonesia (CD24-/CD44-) dilakukan dengan menggunakan rasio aktivitas katalase spesifik yang dinormalisasi pada sel tanpa pengobatan H2O2. Menurunnya aktivitas spesifik katalase yang sebanding dengan peningkatan pemberian H2O2 diduga karena katalase digunakan untuk mengubah H2O2 menjadi H2O dan O2 yang meningkat sesuai dengan konsentrasi H2O2 yang dihasilkan oleh pemberian H2O2. Gambar 4.4.B menunjukkan bahwa rasio aktivitas katalase spesifik CSC payudara (CD24-/CD44+) dan CSC non-payudara (CD24-/CD44-) meningkat ketika diberikan konsentrasi 11 µM H2O2. Hal ini diduga karena rasio ekspresi mRNA NF-kB H2O2 juga meningkat pada saat pemberian.
Analisis aktivitas spesifik glutation peroksidase
Peningkatan aktivitas spesifik katalase dibandingkan kontrol diduga disebabkan oleh meningkatnya kebutuhan katalase untuk mengubah H2O2 menjadi H2O dan O2 yang berasal dari modulasi stres oksidatif oleh H2O2 dan reaksi MnSOD yang mengubah superoksida menjadi H2O2. Peningkatan aktivitas spesifik glutathione peroksidase dibandingkan kontrol diduga disebabkan oleh meningkatnya kebutuhan glutathione peroksidase untuk mengubah H2O2 menjadi H2O dan O2 yang berasal dari modulasi stres oksidatif oleh H2O2 dan reaksi MnSOD yang mengubah superoksida menjadi H2O2. . Penurunan aktivitas spesifik glutathione peroksidase yang sebanding dengan peningkatan pemberian H2O2 diyakini disebabkan oleh penggunaan glutathione peroksidase untuk mengubah H2O2 menjadi H2O dan O2, yang meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi H2O2 yang dihasilkan dari pemberian H2O2.
Penelitian ini menunjukkan bahwa resistensi CSC payudara (CD24-/CD44+) lebih tinggi dibandingkan CSC non-payudara (CD24-/CD44+) pada tingkat viabilitas sel. Penurunan viabilitas sel payudara non-CSC diduga disebabkan oleh penekanan ekspresi NF-kB pada CSC non-payudara. Karena konsentrasi ROS yang rendah berperan dalam menjaga kelangsungan hidup sel, CSC payudara (CD24-/CD44+) cenderung lebih layak dibandingkan.
Analisis ekspresi mRNA NF-kB melalui Real Time RT-PCR
54 Universitas Indonesia Pada Gambar 4.3.A, ekspresi mRNA-kB pada CSC payudara (CD24-/CD44+) yang diberi H2O2 pada konsentrasi berbeda (1,1 μM, 11 μM, dan 110 μM) sedikit meningkat dibandingkan dengan kontrol. Analisis statistik kelompok CSC payudara (CD24-/CD44+) dan kelompok CSC non-payudara (CD24-/CD44-) menggunakan ANOVA menunjukkan perbedaan ekspresi mRNA NFκB yang signifikan (p<0.05; p=0.001) pada uji Games-Howell dari kelompok payudara CSC yang diberi 11µM H2O2 berbeda nyata dengan kelompok payudara non-CSC yang diberi 11µM H2O2 (p<0.05; p=0.000). 55 Universitas Indonesia tergolong tinggi dibandingkan CSC non payudara yang dapat menyebabkan kekambuhan pengobatan kanker karena NF-kB berperan dalam kelangsungan hidup.
Analisis Hubungan Ekspresi NF-kB
Kesimpulan
56 Universitas Indonesia - Pemberian H2O2 meningkatkan aktivitas spesifik katalase dan aktivitas spesifik GPX pada CSC payudara (CD24-/CD44+) dan CSC non-payudara (CD24- /CD44-). Ekspresi mRNA NF-kB pada CSC payudara (CD24-/CD44+) cenderung tetap konstan, namun menurun pada CSC non-payudara (CD24-/CD44-). Ekspresi mRNA NF-kB tidak memiliki hubungan dengan aktivitas spesifik katalase, aktivitas spesifik GPX, aktivitas spesifik MnSOD, dan viabilitas sel.
Saran
Cancer stem cells—Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on Cancer Stem Cells. ALDH1 is a marker of normal and malignant breast stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cancer stem cells: an old idea that's new again: implications for breast cancer diagnosis and treatment.
Kurva Standar BSA
Analisis rasio ekspresi mRNA NF-kB, rasio aktivitas spesifik katalase, dan rasio aktivitas spesifik GPX. 84 Universitas Indonesia Analisis rasio antara CSC payudara (CD24-/CD44+) dan CSC non payudara (CD24-/CD44-) terhadap rasio ekspresi mRNA NF-kB, rasio aktivitas spesifik katalase, rasio aktivitas spesifik GPX dan MnSOD rasio aktivitas spesifik. Uji korelasi antara ekspresi mRNA NF-kB dan aktivitas spesifik MnSOD pada payudara non-CSC.
