ﺷ ﻨ ﯽﻠﮑﺷﺪﻨﭼ ﯽﯾﺎﺳﺎ يﺪﯿﺗﻮﺌﻠﮐﻮﻧ ﮏﺗ
نژ TLR4 يﺮﯿﺷ يﺎﻫوﺎﮔرد
ﻖﯾﺮﻗ يﺮﻔﺻ دواد
يﻮﺠﺸﻧاد ﻊﻄﻘﻣ ﯽﺳﺎﻨﺷرﺎﮐ ﺪﺷرا ﮏﯿﺘﻧژ و حﻼﺻا داﮋﻧ
،ماد هوﺮﮔ مﻮﻠﻋ
،ﯽﻣاد هﺎﮕﺸﻧاد ﻖﻘﺤﻣ ﯽﻠﯿﺑدرا
ﻖﯾرﻮﯾا ﺖﯾاﺪﻫ ﺖﻤﻌﻧ
،رﺎﯿﺸﻧاد هوﺮﮔ مﻮﻠﻋ
،ﯽﻣاد هﺎﮕﺸﻧاد ﻖﻘﺤﻣ ﯽﻠﯿﺑدرا
ﯽﻔﯾﺮﺷ ﺪﯿﺳ ﺎﺿر
،رﺎﯿﺸﻧاد هوﺮﮔ مﻮﻠﻋ
،ﯽﻣاد هﺎﮕﺸﻧاد ﻖﻘﺤﻣ ﯽﻠﯿﺑدرا
يرﻮﮑﺷ شﻮﯾرادﺮﯿﻣ
،رﺎﯿﺸﻧاد هوﺮﮔ مﻮﻠﻋ
،ﯽﻣاد هﺎﮕﺸﻧاد ﻖﻘﺤﻣ ﯽﻠﯿﺑدرا
يﺪﺣاو ﺪﯿﺣو
هوﺮﮔ مﻮﻠﻋ ،ﯽﻣاد هﺪﮑﺸﻧاد يزروﺎﺸﮐ و ﻊﺑﺎﻨﻣ
،ﯽﻌﯿﺒﻃ هﺎﮕﺸﻧاد ﻖﻘﺤﻣ ﯽﻠﯿﺑدرا
ﺪﺳارﻮﭘ يﺮﺒﮐ
ماد ﻪﯾﺬﻐﺗ يﺮﺘﮐد يﻮﺠﺸﻧاد ناﺮﻬﺗ هﺎﮕﺸﻧاد–
هﺪﯿﮑﭼ زا ﯽﮑﯾ نﺎﺘﺴﭘ مرو ﻊﯾﺎﺷ
يرﺎﻤﯿﺑ ﻦﯾﺮﺗ ﯽﯾﺎﺳﺎﻨﺷ ،يرﺎﻤﯿﺑ ﻦﯾا ﻪﺑ ﺖﺒﺴﻧ ﯽﮑﯿﺘﻧژ ﺖﻣوﺎﻘﻣ دﺎﺠﯾا ياﺮﺑ .ﺖﺳا يﺮﯿﺷ يﺎﻫوﺎﮔ رد ﺎﻫ
نژ ﻞﻟا و ﺎﻫ هﺪﻧﺮﯿﮔ .ﺖﺳا يروﺮﺿ نﺎﺘﺴﭘ مرو ﻪﺑ موﺎﻘﻣ يﺎﻫ يﺎﻫ
Toll like Receptor )
(TLRs ژ زا
ن ﺐﺳﺎﻨﻣ ياﺪﯾﺪﻧﺎﮐ يﺎﻫ
يﺎﻫوﺎﮔ رد نﺎﺘﺴﭘ مرو ﻪﺑ ﯽﮑﯿﺘﻧژ ﺖﻣوﺎﻘﻣ ﺶﯾاﺰﻓا ياﺮﺑ يﺮﯿﺷ
نژ ﯽﻠﮑﺷ ﺪﻨﭼ ﺶﻫوﮋﭘ ﻦﯾا رد .ﺪﻨﺘﺴﻫ TLR4
ﺖﯿﻌﻤﺟ ﮏﯾ رد
يﺎﻫوﺎﮔ زا يﺮﯿﺷ
نﺎﻐﻣ ﺖﻌﻨﺻ و ﺖﺸﮐ زا ،رﻮﻈﻨﻣ ﻦﯾا ياﺮﺑ .ﺖﻓﺮﮔ راﺮﻗ ﯽﺳرﺮﺑ درﻮﻣ
100 و ﻪﯿﻬﺗ نﻮﺧ ﻪﻧﻮﻤﻧ ﻦﯾﺎﺘﺸﻠﻫ وﺎﮔ
نژ ياﺮﺑ .ﺪﺷ جاﺮﺨﺘﺳا ﺎﻬﻧآDNA TLR4
ﻪﻌﻄﻗ ﺎﻫﺮﮔزﺎﻏآ ﻦﯾا .ﺪﺷ ﯽﺣاﺮﻃ ﺮﮔزﺎﻏآ ﺖﻔﺟ ﮏﯾ ﻪﺑ يا
لﻮﻃ 499 رد ار زﺎﺑ ﺖﻔﺟ
زاﺮﻤﯿﻠﭘ يﺎﻫﺮﯿﺠﻧز ﺶﻨﮐاو ﺪﻨﯾاﺮﻓ (PCR )
ﺪﻧدﻮﻤﻧ ﺮﯿﺜﮑﺗ رد ﺶﻬﺟ عﻮﻧ ﮏﯾ ﯽﯾﺎﺳﺎﻨﺷ ﻪﺑ ﺮﺠﻨﻣ ﺞﯾﺎﺘﻧ ﺰﯿﻟﺎﻧآ.
ﺮﺠﻨﻣ ﻪﮐ ﺪﺷTLR4
ﯽﻨﯾﺰﮕﯾﺎﺟ ﻪﺑ يﺎﺟ ﻪﺑT
نوﺪﮐ ﺮﯿﯿﻐﺗ ﻪﺑ ﺮﺠﻨﻣ ﻪﺠﯿﺘﻧ ردوC يﺎﺟ ﻪﺑATC
ﻪﻨﯿﻣآ ﺪﯿﺳا ﯽﻨﯾﺰﮕﯾﺎﺟ ﻪﺑ ﺮﺠﻨﻣ ﻪﮐ دﻮﺷ ﯽﻣACC
دﻮﺷ ﯽﻣ ﻦﯿﻧﻮﺋﺮﺗ ﻪﺑ ﻦﯿﺳﻮﻟوﺰﯾا ﭗﯿﺗﻮﻧژ ﻪﺳ ﺮﻫ زا
،TT ،TC ﯽﻧاواﺮﻓ ﺎﺑ ﺐﯿﺗﺮﺗ ﻪﺑCC 03
/0 ، 08 /0 و 89 /0 زا ﻪﮐ ﺪﺷ هﺪﻫﺎﺸﻣ
) دﻮﺑراد ﯽﻨﻌﻣ گﺮﺒﻨﯾاو يدرﺎﻫ لدﺎﻌﺗ ﺮﻈﻧ p<0.05
نژ ﻪﮐ ﺪﻫد ﯽﻣ نﺎﺸﻧ ﺢﯾﺎﺘﻧ .(
بﺎﺨﺘﻧا ياﺮﺑ ﯽﺑﻮﺧ ﯽﮑﯿﺘﻧژ ﺮﮕﻧﺎﺸﻧTLR4
.ﺖﺳا نﺎﺘﺴﭘ مرو ﻪﺑ موﺎﻘﻣ يﺎﻬﻣاد :يﺪﯿﻠﮐ تﺎﻤﻠﮐ نژ
TLR4 - ﮐﻮﻧ ﮏﺗ ﯽﻠﮑﺷﺪﻨﭼ يﺪﯿﺗﻮﺌﻠ
- ﯽﮑﯿﺘﻧژ ﺮﮕﻧﺎﺸﻧ و يﺮﯿﺷ يﺎﻫوﺎﮔ
2
1 . ﻪﻣﺪﻘﻣ
يرﺎﻤﯿﺑ ﯽﺧﺮﺑ ﻪﺑ ماد ﺖﯿﺳﺎﺴﺣ ﺐﺟﻮﻣ ﺪﯿﻟﻮﺗ ﺶﯾاﺰﻓا و ﻪﺘﻓﺎﯾ ﺶﯾاﺰﻓا ﺮﯿﺷ ﺪﯿﻟﻮﺗ ،يﺮﯿﺷ يﺎﻫوﺎﮔ ﯽﮑﯿﺘﻧژ دﻮﺒﻬﺑ ﺎﺑ مرو ﺮﯿﻈﻧ ﺎﻫ
نﺎﺘﺴﭘ ﻞﺧاد ﺖﻧﻮﻔﻋ ﻪﻠﯿﺳو ﻪﺑ ﻪﮐ ﺖﺳا ﯽﻧﺎﺘﺴﭘ دﺪﻏ ﯽﻣرﻮﺗ يرﺎﻤﯿﺑ ﮏﯾ ،نﺎﺘﺴﭘ مرو .ﺖﺳا هﺪﺷ نﺎﺘﺴﭘ ﻦﯾا .دﻮﺸﯿﻣ دﺎﺠﯾا
ﯽﻣ دﻮﺟو ﻪﺑ ﯽﭼرﺎﻗ و ﯽﯾﺎﯾﺮﺘﮐﺎﺑ يﺎﻬﻧژﻮﺗﺎﭘ زا ﯽﻌﯿﺳو ﻒﯿﻃ ﻪﻠﯿﺳو ﻪﺑ يرﺎﻤﯿﺑ رد ﯽﻋﺎﻓد و ﯽﻨﻤﯾا ﻢﺘﺴﯿﺳ نﺪﺷ لﺎﻌﻓ ﺐﺒﺳ ﻪﮐ ﺪﯾآ
دﻮﺸﯿﻣ ﺮﯿﺷ رد ﮏﯿﺗﺎﻣﻮﺳ يﺎﻬﻟﻮﻠﺳ ﺶﯾاﺰﻓا و نﺎﺘﺴﭘ . [1]
ا ﯽﺷﺎﻧ ﺪﯿﻟﻮﺗ ﺶﻫﺎﮐ ناﺮﯾا رد .ﺖﺳا يرﺎﻤﯿﺑ ﻦﯾا ءﻮﺳ تاﺮﺛا زا ﺮﯿﺷ ﺖﯿﻔﯿﮐ و ﺪﯿﻟﻮﺗ ﺶﻫﺎﮐ لﺎﺳ رد نﺎﺘﺴﭘ مرو ز
1385 لدﺎﻌﻣ
150 ﺖﺳا هﺪﺷ دروآﺮﺑ ﻦﺗ راﺰﻫ . [2]
دﺮﮑﻠﻤﻋ ﺶﻫﺎﮐ ﺮﯿﻈﻧ ﯽﻨﯿﻟﺎﺑ نﺎﺘﺴﭘ مرو ناواﺮﻓ تارﺎﺴﺧ ﻦﺘﻓﺮﮔ ﺮﻈﻧ رد نوﺪﺑ راﺪﻘﻣ ﻦﯾا
رد بﻮﻠﻄﻣﺎﻧ تﺎﺒﯿﮐﺮﺗ ﺶﯾاﺰﻓا ،(هﺮﯿﻏ و ﻢﯿﺳﺎﺘﭘ ،ﺪﻨﻗ ،ﯽﺑﺮﭼ ،ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﺮﯿﺷ رد بﻮﻠﻄﻣ تﺎﺒﯿﮐﺮﺗ و ﮏﺸﺧ هدﺎﻣ ﺶﻫﺎﮐ ،ﻞﺜﻣ ﺪﯿﻟﻮﺗ ﯾﺪﺳ) ﺮﯿﺷ ﺖﺳا ﺮﯿﺷ يرﺎﮔﺪﻧﺎﻣ نﺎﻣز ﺶﻫﺎﮐ و (هﺮﯿﻏ و ﺎﻫ ﻢﯾﺰﻧآ ،ﺮﻠﮐ ،ﻢ
ﻪﮐ ،يرﺎﻤﯿﺑ ﻦﯾا ﻪﺑ ﯽﮑﯿﺘﻧژ ﺖﻣوﺎﻘﻣ ﺶﯾاﺰﻓا .[2]
ﻪﻨﯾﺰﻫﺮﭘ ﻪﻣﺎﻧﺮﺑ رد ﺪﻧاﻮﺗ ﯽﻣ ،ﺖﺳا يﺮﯿﺷ وﺎﮔ شروﺮﭘ رد يرﺎﻤﯿﺑ ﻦﯾﺮﺗ راﺮﻗ ﺮﻈﻧ ﺪﻣ يداﮋﻧ حﻼﺻا يﺎﻫ
دﺮﯿﮔ .[3]
نژ زا هﺪﻧﺮﯿﮔ ﺖﻣوﺎﻘﻣ ﻪﻨﯿﻣز رد اﺪﯾﺪﻧﺎﮐ يﺎﻫ دﺮﺑ مﺎﻧ ار لﻮﺗ ﻪﺒﺷ يﺎﻫ
ظﺎﺤﻟ زا ﻪﮐ يﺎﻬﻧژ ناﻮﺘﯿﻣ ﯽﮑﯿﺘﻧژ
TLR هداﻮﻧﺎﺧ ﻪﮐ ﯽﯾﺎﻫ
هﺪﻧﺮﯿﮔ زا ﺪﻨﮑﯿﻣ ﺪﮐ ار ﯽﻟﻮﻠﺳ يﺎﻫ ﺖﺳا رادرﻮﺧﺮﺑ يﺮﺘﺸﯿﺑ ﺖﯿﻤﻫا زا
نﻮﻨﮐﺎﺗ [4]
12 نژ عﻮﻧ TLR ﯽﯾﺎﺳﺎﻨﺷ ناراﺪﻧﺎﺘﺴﭘ رد
هﺪﻧﺮﯿﮔ ﻦﯾا .ﺖﺳا هﺪﺷ ﻨﻫﺪﯿﻣ ﺺﯿﺨﺸﺗ ار اﺰﯾرﺎﻤﯿﺑ ﻞﻣاﻮﻋ زا ﯽﺻﺎﺧ ﯽﻟﻮﮑﻟﻮﻣ ﯽﻟاﻮﺗ ﺎﻫ
نﺪﺑ ﯽﻨﻤﯾا يﺎﻬﺨﺳﺎﭘ زﺎﻏآ رد و ﺪ ژﻮﺗﺎﭘ ﻪﺑ
ﺪﻧراد يرﻮﺤﻣ ﺶﻘﻧ ﯽﺑوﺮﮑﯿﻣ يﺎﻬﻧ .[5]
نژ TLR4 ﻪﻧﻮﮔ ﻦﯿﺑ رد
و ﯽﻫدﺮﯿﺷ مواﺪﺗ ،ﯽﺛرا شزرا ﺎﺑ يرﺎﺠﺗ يﺎﻫداﮋﻧ ﯽﺧﺮﺑ رد نآ زوﺮﺑ و ﺪﻫﺪﯿﻣ نﺎﺸﻧ ﯽﻠﮑﺷﺪﻨﭼ وﺎﮔ يﺎﻫ
ﺪﻧراد طﺎﺒﺗرا ﯽﻧﺪﺑ يﺎﻬﻟﻮﻠﺳ داﺪﻌﺗ ﯽﺳرﺮﺑ رد.[4]
يﺎﻫوﺎﮔ رد هﺪﺷ مﺎﺠﻧا يﺎﻫ ﯽﻬﻧﺎﺳ
) Sanhe ( ﯽﻨﯿﭼ ﻦﯾﺎﺘﺸﻠﻫ و لﺎﺘﻨﻤﯿﺳ و
ﯽﻠﮑﺷ ﺪﻨﭼ ﻪﮐ ﺪﺷ ﺺﺨﺸﻣ يﺪﯿﺗﻮﺌﻠﮐﻮﻧ ﮏﺗ يﺎﻫ
(SNPs) نوﺰﮔا و ﮏﯾ نوﺮﺘﻨﯾا رد دﻮﺟﻮﻣ
3 نژ TLR4 يﺎﻬﻟﻮﻠﺳ داﺪﻌﺗ ﺎﺑ
ﺖﺳا طﺎﺒﺗرا رد ﺮﯿﺷ رد ﯽﮑﯿﺗﺎﻣﻮﺳ توﺎﻔﺗ.[6]
نوﺰﮔا ،ﮏﯾ نوﺮﺘﻨﯾا رد هﺪﺷ ﯽﯾﺎﺳﺎﻨﺷ يﺪﯿﺗﻮﺌﻠﮐﻮﻧ ﮏﺗ يﺎﻫ 3
ﻪﯿﺣﺎﻧ و UTR'5
ﺎﺑ نژ ﻦﯾا ﺖﺳا طﺎﺒﺗرا رد ﯽﻠﯾزﺮﺑ ﻦﯾﺎﺘﺸﻠﻫ يﺎﻫوﺎﮔ رد ﺮﯿﺷ ﯽﮑﯿﺗﺎﻣﻮﺳ يﺎﻬﻟﻮﻠﺳ داﺪﻌﺗ
.[7]
ﯽﻠﮑﺷ ﺪﻨﭼ ﻦﯿﭽﻤﻫ ﯽﯾﺎﺳﺎﻨﺷ يﺎﻫ
هرﺎﻤﺷ نوﺰﮔا رد هﺪﺷ 3
ﭗﯿﺗﻮﻧژ ﯽﺧﺮﺑ ﻪﮐ يرﻮﻃ ﻪﺑ ،ﺪﻨﺘﺴﻫ ﻂﺒﺗﺮﻣ نﺎﺘﺴﭘ مرو ﺎﺑ ﺪﻨﻫ لاﻮﯿﻫﺎﺳ يﺎﻫوﺎﮔ رد نژ ﻦﯾا ﻦﯾا ﻪﺑ ﺎﻫ
ﺮﺘﻣوﺎﻘﻣ يرﺎﻤﯿﺑ ﺪﻨﺘﺴﻫ
. [8]
رد ﻦﯿﻨﭽﻤﻫ ﺰﯿﻧ نﺎﺘﺳوﺪﻨﻫ يﺎﻬﺸﯿﻣوﺎﮔ
SNP نوﺰﮔا رد هﺪﺷ ﯽﯾﺎﺳﺎﻨﺷ 3
نژ TLR4 ﭗﯿﺗﻮﻧژ ﺎﺗ ﺖﺳا هﺪﺷ ﺐﺟﻮﻣ
يﺎﻫ aa
ﻪﺑ ﺖﺒﺴﻧ نﺎﺘﺴﭘ مرو ab
موﺎﻘﻣ ﺮﺗ ﺪﻨﺷﺎﺑ ﺎﺑ ﻪﻌﻟﺎﻌﻟﺎﻄﻣ ﻦﯾا اﺬﻟ .[9]
ﻦﺘﻓﺎﯾ فﺪﻫ نژ رد يﺪﯿﺗﻮﺌﻠﮐﻮﻧ ﮏﺗ يﺎﻫ ﯽﻠﮑﺷﺪﻨﭼ
TLR4
يﺎﻫوﺎﮔ ﺖﯿﻌﻤﺟ رد يﺮﯿﺷ
ﺖﻓﺮﮔ مﺎﺠﻧا نﺎﻐﻣ ﺖﻌﻨﺻ و ﺖﺸﮐ .
2 . ﻣ شور و داﻮ
ﻪﻧﻮﻤﻧ زا ﺶﻫوﮋﭘ ﻦﯾا رد نﻮﺧ يﺎﻫ
100 ﺖﮐﺮﺷ ﻦﯾﺎﺘﺸﻠﻫ وﺎﮔ ﻞﯿﺑدرا نﺎﻐﻣ ﺖﻌﻨﺻ و ﺖﺸﮐ
.ﺪﺷ هدﺎﻔﺘﺳا ترﻮﺻ ﻪﺑ ﺎﻫ ﻪﻧﻮﻤﻧ ﻪﮐ
.ﺪﺷ مﺎﺠﻧا يﺮﯿﮔ ﻪﻧﻮﻤﻧ و نﺪﺷ بﺎﺨﺘﻧا ﯽﻓدﺎﺼﺗ جاﺮﺨﺘﺳا DNA نژﻮﻤﻫ نﻮﺧ زا ﺖﯿﮐ زا هدﺎﻔﺘﺳا ﺎﺑ DNA
ﺪﺷ جاﺮﺨﺘﺳا ﺖﯿﻔﯿﮐ.
DNA زرﻮﻓوﺮﺘﮑﻟا هدﺎﻔﺘﺳا ﺎﺑ هﺪﻣآ ﺖﺳد ﻪﺑ
زرﺎﮔآ لژ ﺎﯾ 8/
0 ﺪﺷ يﺮﯿﮔ هزاﺪﻧا ﺮﺘﻣﻮﺘﻓﻮﺘﮑﭙﺳا هﺎﮕﺘﺳد ﺎﺑ نآ ﺖﻈﻠﻏ و ﺪﺷ ﯽﺳرﺮﺑ ﺪﺻرد ﺮﯿﺜﮑﺗ ﺖﻬﺟ .
نژ TLR4 لﻮﻃ ﻪﺑ
499 ﺮﮔ زﺎﻏآ ﺖﻔﺟ ﮏﯾ زا ،زﺎﺑ ﺖﻔﺟ ﺮﯾز حﺮﺸﺑ ﯽﺻﺎﺼﺘﺧا
.ﺪﺷ هدﺎﻔﺘﺳا : 5'-TCAGGTGCTGAATATGAGTCA-3' (f) 5'-CCAGTCTTCATCCTGGCTCGT-3' (R)
ﺶﻨﮐاو ﺎﻫ ي ﻢﺠﺣ ردPCR
25 ﻣ ﯿ ﻟوﺮﮑ ﯿ ﺮﺘ ي وﺎﺣ ي 5 / 12 ﻣﯿ ﻟوﺮﮑ ﯿ ﺮﺘ داﻮﻣ master mix
،5 /1 ﻣ ﯿ وﺮﮑ ﻟﯿ ﺮﺘ اﺮﭘ ﯾ ﺮﻤ ،ﺖﻓر
5/
1 ﻣﯿ ﻟوﺮﮑ ﯿ ﺮﺘ اﺮﭘ ﯾ ﺮﻤ ،ﺖﺸﮔﺮﺑ 7
ﻣ ﯿ ﻟوﺮﮑ ﯿ ﺮﺘ ﺮﺘﺳا ﺮﻄﻘﻣ بآ ﯾ
ﻞ و هﺪﺷ 5/
2 ﻣ ﯿ ﻟوﺮﮑ ﯿ ﺮﺘ ﺶﻨﮐاو مﺎﻤﺗ .ﺪﻧﺪﺷ مﺎﺠﻧا DNA
ﺎﻫ ي
3
ﻞﻣﺎﺷ دراﺪﻧﺎﺘﺳا ﻪﻣﺎﻧﺮﺑ زا هدﺎﻔﺘﺳا ﺎﺑ PCR 10
ﻗد ﯿ ﻪﻘ زﺎﺳ ﺖﺷﺮﺳاو ي
زﺎﻏآ ﯾ ﻦ ﺎﻣد رد ي 95 ﺘﻧﺎﺳ ﻪﺟرد ﯿ
داﺮﮕ ، 30 ﺳ ﯿ ﻞﮑ ﻞﻣﺎﺷ
30 ﻧﺎﺛ ﯿ ﻪ زﺎﺳ ﺖﺷﺮﺳاو ي
رد 94 ﺘﻧﺎﺳ ﻪﺟرد ﯿ
،داﺮﮕ 50 ﻧﺎﺛ ﯿ ﻪ ﺎﻣد رد ي لﺎﺼﺗا 55 ﺘﻧﺎﺳ ﻪﺟرد ﯿ
داﺮﮕ و 30 ﻧﺎﺛ ﯿ ﻪ رد 72 ﻪﺟرد
ﺘﻧﺎﺳ ﯿ داﺮﮕ ﻟوا ﻂﺴﺑ ﯽ ﺎﻬﻧ رد و ﯾ ﺖ ﺜﮑﺗ ﯿﺮ ﺎﻬﻧ ﯽﯾ ﻣ ﻪﺑ تﺪ 10 ﻗد ﯿ ﻪﻘ ﺎﻣد رد ي 72 ﺘﻧﺎﺳ ﻪﺟرد ﯽ
داﺮﮔ ﭙﺳ .ﺖﻓﺮﮔ مﺎﺠﻧا ﺲ
تﻻﻮﺼﺤﻣ
PCR زرﺎﮔا لژ زا هدﺎﻔﺘﺳا ﺎﺑ هدﺎﻣآ ﺖﺳد ﻪﺑ 5/
1 زرا ﺪﺻرد ﯾﺑﺎ
ﯽ ﻪﻧﻮﻤﻧ ﻞﮐ .ﺪﺷ ﺎﻫ
ي ﺮﻃ زا PCR
ﯾ ﻖ ز ﺖﮐﺮﺷ ﯾ ﺖﺴ روﺎﻨﻓ ي
ﭘﯿ مﺎﮕﺸ زﺎﺳ ﺺﻟﺎﺧ ي
ﻟاﻮﺗ ﺮﮕﻨﺳ شور زا هدﺎﻔﺘﺳا ﺎﺑ و ﯽ
ﯾ ﺑﺎ ﯽ دﺮﮔ ﯾﺪ .
ﯽﻟاﻮﺗ ﺰﯿﻟﺎﻧآ يﺎﻫ
ﯽﻟاﻮﺗ ﺖﯿﻔﯿﮐ راﺰﻓا مﺮﻧ زا هدﺎﻔﺘﺳا ﺎﺑ ﺎﻫ
Chromas ﺲﭙﺳ .ﺪﯾدﺮﮔ ﺶﯾاﺮﯾو ﻦﯿﯾﺎﭘ ﺖﯿﻔﯿﮐ ياراد ﯽﺣاﻮﻧ و ﺖﻓﺮﮔ راﺮﻗ ﯽﺳرﺮﺑ درﻮﻣ
ﯽﻟاﻮﺗ ﻪﺑ يﺎﻫ راﺰﺑا ﻖﯾﺮﻃ زا اﺪﺘﺑا ﺖﻗد ﯽﺳرﺮﺑ و نﺎﻨﯿﻤﻃا ﺖﻬﺟ هﺪﻣآ ﺖﺳد Blast
ﺖﯾﺎﺴﺑو رد .ﺖﻓﺮﮔ راﺮﻗ ﺪﯿﯾﺄﺗ درﻮﻣNCBI
مﺎﻤﺗ ﺪﯿﯾﺄﺗ زا ﺪﻌﺑ ﯽﻟاﻮﺗ
ﯽﻠﮑﺷﺪﻨﭼ ﯽﯾﺎﺳﺎﻨﺷ ﺖﻬﺟ ﺎﻫ ﻢﺘﯾرﻮﮕﻟا ﻖﯾﺮﻃ زا دﻮﺟﻮﻣ يﺎﻫ
Clustal W زا هدﺎﻔﺘﺳا ﺎﺑ
مﺮﻧ راﺰﻓا
MEGA 6.0 ﻢﻫ
زاﺮﺗ ﺪﯾدﺮﮔ [10]
.
3 . ﺚﺤﺑ و ﺞﯾﺎﺘﻧ
ﺘﻧ ﻪﻌﻄﻗ ﺖﺤﺻ ،زرﺎﮔآ لژ يور ﺮﺑ زاﺮﻤﯿﻠﭘ يﺎﻫﺮﯿﺠﻧز ﺶﻨﮐاو تﻻﻮﺼﺤﻣ زرﻮﻓوﺮﺘﮑﻟا ﻪﺠﯿ 499
نژ زا هﺪﺷ ﺮﯿﺜﮑﺗ يزﺎﺑ ﺖﻔﺟ
TLR4 ﻞﮑﺷ) داد راﺮﻗ ﺪﯿﯾﺎﺗ درﻮﻣ هزاﺪﻧا ﺮﮕﻧﺎﺸﻧ ﻂﺳﻮﺗ ار ﻦﯾﺎﺘﺸﻠﻫ يﺎﻫوﺎﮔ 1
دﻮﺷ ﯽﻣ هﺪﻫﺎﺸﻣ ﺮﯾﻮﺼﺗ رد ﻪﮐ رﻮﻄﻧﺎﻤﻫ .(
لﻮﺼﺤﻣ ﺖﯾﺎﻬﻧ رد و ﺪﺷ ﺮﯿﺜﮑﺗ ﯽﻓﺎﺿا ﺪﻧﺎﺑ ﭻﯿﻫ نوﺪﺑPCR
ﺪﯾدﺮﮔ ﯽﺑﺎﯾ ﯽﻟاﻮﺗ
ﻞﮑﺷ 1 - زاﺮﻤﯿﻠﭘ يﺎﻫﺮﯿﺠﻧز ﺶﻨﮐاو لﻮﺼﺤﻣ نژ
TLR4
زرﺎﮔآ لژ يور 8/
0 .ﺪﺻرد
ﻪﯿﺣﺎﻧ ﮏﯾ ﯽﯾﺎﺳﺎﻨﺷ ﻪﺑ ﺮﺠﻨﻣ ﯽﻟاﻮﺗ ﺎﻫ هداد ﺰﯿﻟﺎﻧا ﻪﺑ طﻮﺑﺮﻣ ﺞﯾﺎﺘﻧ InDell
نژ رد ﻞﮑﺷ رد رﻮﻄﻧﺎﻤﻫ ﺪﺷ TLR4
2 هﺪﻫﺎﺸﻣ
ﯽﻣ ﻞﻣﺎﺷ ﻪﮐ ﺪﯾدﺮﮔ هﺪﻫﺎﺸﻣ ﯽﻟاﻮﺗ ﻦﯾا زا ﭗﯿﺗﻮﻧژ ود ﺎﻬﻨﺗ دﻮﺷ وG-
ﭗﯿﺗﻮﻧژ ﯽﻧاواﺮﻓ ﻪﺘﺒﻟا ﺪﻧدﻮﺑGG ﯽﻧاواﺮﻓ ﺎﺑ ﻢﮐ ﯽﻠﯿﺧG-
2
ﻒﻗﻮﺘﻣ نوﺪﮐ ﺪﯿﻟﻮﺗ ﻪﺑ ﺮﺠﻨﻣ و ﻪﺘﺨﯾر ﻢﻬﺑ ار ﺶﻧاﻮﺧ بﻮﭼرﺎﭼ ﺖﺳا ﻦﮑﻤﻣ لﺪﻨﯾا دﻮﺟو ﻪﮑﻨﯾا ﻪﺑ ﻪﺟﻮﺗ ﺎﺑ .ﺪﺷ هﺪﻫﺎﺸﻣ ﺪﺻرد وﺮﭘ دﺮﮑﻠﻤﻋ ﺖﺳا ﻦﮑﻤﻣ ﻦﯾاﺮﺑﺎﻨﺑ دﻮﺷ هﺪﻨﻨﮐ ﺶﻨﮐاو ﯽﺑﺎﻬﺘﻟا يﺎﻫ ﻢﺴﯿﻧﺎﮑﻣ ﻪﺑ ماد ﻪﺠﯿﺘﻧ رد و ﻪﺘﻗر ﻦﯿﺑ زا هﺪﺷ ﺪﯿﻟﻮﺗ ﻦﯿﺌﺗ
ﺪﻨﻧﺎﻣ ﯽﯾﺎﻬﻧژ رد صﻮﺼﺨﺑ ﺎﻫ ﺶﻬﺟ ﻪﻧﻮﮔ ﻦﯾا ﻦﯾاﺮﺑﺎﻨﺑ .ﺪﻫد ﯽﻤﻧ ار ﯽﺒﺳﺎﻨﻣ و يﺎﻬﯾرﺎﻤﯿﺑ ﻪﺑ ﺖﻣوﺎﻘﻣ ﺎﺑ ﻂﺒﺗﺮﻣ ﻪﮐ TLR4
ﻦﯿﺑ زا تﺪﻣ هﺎﺗﻮﮐ رد ﻻﺎﻤﺘﺧا و دﻮﺑ ﺪﻫاﻮﺨﻧ ﺪﯿﻔﻣ ماد ياﺮﺑ ﺖﺳا ﯽﻧﺪﺑ ﻒﻠﺘﺨﻣ يﺎﻫ بﺎﻬﺘﻟا ﻢﻫ ﻞﯿﻟد ﻪﺑ ﺖﺳا ﻦﮑﻤﻣ و دور ﯽﻣ
4
ﻟد ﻪﺑ نﺎﻣز لﻮﻃ رد ﻪﮐ ترﻮﺻ ﻦﯾﺪﺑ .دﺮﮐ ﺪﯿﯾﺎﺗ ار لﺪﻨﯾا تﻮﮕﯾزﻮﻤﻫ دﻮﺒﻧ ﭘﺎﻧ ﺶﻬﺟ يدوز ﻪﺑ ﺶﻬﺟ ندﻮﺑ ﺮﻀﻣ ﻞﯿ
دﻮﺷ ﯽﻣ ﺪﯾﺪ
.ددﺮﮔ فﺬﺣ ﺖﺳا ﻦﮑﻤﻣ و هدﺎﺘﻓا ﺮﻄﺧ ﻪﺑ ماد ﯽﮕﺘﺴﯾﺎﺷ نﻮﭼ
ﻞﮑﺷ 2 نژ رد لﺪﻨﯾا عﻮﻧ زا ﺶﻬﺟ هﺪﻫﺎﺸﻣ:
TLR4
ﻣ ﺖﻌﻨﺻ و ﺖﺸﮐ يﺮﯿﺷ يﺎﻫوﺎﮔ رد .نﺎﻐ
رد ﺰﯿﻧ ﺮﮕﯾد ﺶﻬﺟ عﻮﻧ ﮏﯾ ﯽﻨﯾﺰﮕﯾﺎﺟ ﻪﺑ ﺮﺠﻨﻣ ﻪﮐ ﺪﺷ ﯽﯾﺎﺳﺎﻨﺷTLR4
يﺎﺟ ﻪﺑT نوﺪﮐ ﺮﯿﯿﻐﺗ ﻪﺑ ﺮﺠﻨﻣ ﻪﺠﯿﺘﻧ ردوC
ATC
يﺎﺟ ﻪﺑ ﻞﮑﺷ) دﻮﺷ ﯽﻣACC
3 ﺪﯿﺳا ﯽﻨﯾﺰﮕﯾﺎﺟ ﻪﺑ ﺮﺠﻨﻣ ﻪﮐ ﺖﺳا نوﺪﮐ رد مود زﺎﺑ ﯽﻨﯾﺰﮕﯾﺎﺟ عﻮﻧ زا ﯽﻨﯾﺰﮕﯾﺎﺟ عﻮﻧ ﻦﯾا .(
ﭗﯿﺗﻮﻧژ ﻪﺳ ﺮﻫ زا دﻮﺷ ﯽﻣ ﻦﯿﻧﻮﺋﺮﺗ ﻪﺑ ﻦﯿﺳﻮﻟوﺰﯾا ﻪﻨﯿﻣآ ،TT
،TC ﯽﻧاواﺮﻓ ﺎﺑ ﺐﯿﺗﺮﺗ ﻪﺑCC
03 /0 ، 08 /0 و 89 /0 ﺪﺷ هﺪﻫﺎﺸﻣ
) دﻮﺑراد ﯽﻨﻌﻣ كﺮﺒﻨﯾاو يدرﺎﻫ لدﺎﻌﺗ ﺮﻈﻧ زا ﻪﮐ p<0.05
.(
درﻮﻣ ﺖﯿﻌﻤﺟ رد گﺮﺒﻨﯾاو يدرﺎﻫ ﻂﯾاﺮﺷ ﻪﮑﻨﯾا ﻪﺑ ﻪﺟﻮﺗ ﺎﺑ ﻪﺘﺒﻟا
ترﻮﺼﺑ ﻪﻧﻮﻤﻧ بﺎﺨﺘﻧا ﺮﮕﯾد فﺮﻃ زا و دﻮﺷ ﯽﻣ هﺪﻫﺎﺸﻣ ﻪﻠﮔ رد ﯽﺑﻮﺧ ﻪﺑ تﺮﺟﺎﻬﻣ و بﺎﺨﺘﻧا لﺎﺜﻣ ناﻮﻨﻌﺑ دراﺪﻧ دﻮﺟو ﻪﻌﻟﺎﻄﻣ دﻮﺟو مﺪﻋ ﺖﺳا هدﻮﺒﻧ ﯽﻓدﺎﺼﺗ ﺮﺒﻨﯾاو يدرﺎﻫ لدﺎﻌﺗ
ﺪﺳر ﯽﻣ ﺮﻈﻨﺑ لﻮﻘﻌﻣ گ
5
ﻞﮑﺷ 3 ﯽﻧﺰﮕﯾﺎﺟ ﻞﯿﻟد ﻪﺑ هﺪﺷ ﯽﯾﺎﺳﺎﻨﺷ ﻒﻠﺘﺨﻣ يﺎﻫ ﭗﯿﺗﻮﻧژ . ﻪﺑT
نژ ردC
ﻦﯾﺎﺘﺸﻠﻫ يﺎﻫوﺎﮔTLR4
نژ رد دﻮﺟﻮﻣ ﯽﻠﮑﺷﺪﻨﭼ ،ﺖﻓﺮﮔ ترﻮﺻ يﺪﻨﻟﺮﯾا ﻦﯾزﺮﻓ ﻦﯾﺎﺘﺸﻠﻫ يﺎﻫوﺎﮔ رد ﻪﮐ ﯽﺳرﺮﺑ رد -TLR4
يﺎﻫ لﻮﻠﺳ داﺪﻌﺗ ﺎﺑ
) ﮏﯿﺗﺎﻣﻮﺳ 01
/0 ﺮﯿﺷ ﯽﺑﺮﭼ ﺪﺻرد ﻦﯿﻨﭽﻤﻫ و ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ ﺪﺻرد( دﻮﺑ ﻂﺒﺗﺮﻣ
.[11]
ﺪﻨﭼ ﯽﻠﮑﺷ يﺪﯿﺗﻮﺌﻠﮐﻮﻧ يﺎﻫ SNPs
سﻮﮐﻮﻟ نوﺰﮔا و ﮏﯾ نوﺮﺘﻨﯾا يﺎﻫ 3
نژ TLR4 و لﺎﺘﻨﻤﯿﺳ و ﻦﯾﺎﺘﺸﻠﻫ يﺎﻫوﺎﮔ
Sanhe ﻞﻟآ ود ﯽﯾﺎﺳﺎﻨﺷ ﻪﺑ ﺮﺠﻨﻣ ﻦﯿﭼ رد
A
و ﻞﻟآ و هدﻮﺑ ﻂﺒﺗﺮﻣ ﯽﻠﮑﺷﺪﻨﭼ ﻦﯾا ﺎﺑ ﺮﯿﺷ رد دﻮﺟﻮﻣ ﯽﮑﯿﺗﺎﻣﻮﺳ يﺎﻬﻟﻮﻠﺳ داﺪﻌﺗ شراﺰﮔ ﻦﯾا سﺎﺳا ﺮﺑ .ﺪﺷ ﺎﻬﺘﯿﻌﻤﺟ ﻦﯾا رد B
ﺶﻘﻧ ﺪﻧاﻮﺘﯿﻣA ﺪﯾﺎﻤﻧ ﺎﻔﯾا نﺎﺘﺴﭘ مرو ﻪﺑ ﯽﮑﯿﺘﻧژ ﺖﻣوﺎﻘﻣ رد ﯽﻤﻬﻣ
ﺎﺑ ﺰﯿﻧ نﺎﺘﺳوﺪﻨﻫ لاﻮﯿﻫﺎﺳ يﺎﻫوﺎﮔ رد.[6]
شور زا هدﺎﻔﺘﺳا
RFLP- PCR ﻪﺑ و
ﺮﺛﻻادوﺪﺤﻣ ﻢﯾﺰﻧآ يﺮﯿﮔرﺎﮐ HinfI
نوﺰﮔا 3 نژ TLR4 ﻞﻟآ ود .ﺖﻓﺮﮔ راﺮﻗ ﯽﺳرﺮﺑ درﻮﻣ
و C ﻦﯾا ردD
ﭗﯿﺗﻮﻧژ ﻪﮐ ﺪﻧﺪﺷ ﺺﺨﺸﻣ هﺎﮕﯾﺎﺟ يﺎﻫ
و CC ﺴﭘ مرو ﻪﺑ ﺖﺒﺴﻧ DD
سﺎﺴﺣ نﺎﺘ ﺪﻧدﻮﺑ ﺮﺗ
.[8]
نژ دﺮﮑﻠﻤﻋ ﻪﺑﺎﺸﺗ ﻪﺑ ﻪﺟﻮﺗ ﺎﺑ TLR4
ﻪﻧﻮﮔ رد نوﺰﮔا يﺪﯿﺗﻮﺌﻠﮐﻮﻨﮑﺗ توﺎﻔﺗ ،وﺎﮔ ﻒﻠﺘﺨﻣ يﺎﻫ 3
يﺎﻬﺸﯿﻣوﺎﮔ رد نژ ﻦﯾا
Murrah ﺮﺛﻻادوﺪﺤﻣ ﻢﯾﺰﻧآ زا هدﺎﻔﺘﺳا ﺎﺑ نﺎﺘﺳوﺪﻨﻫ
StyI شور و -PCR RFLP ﻞﻟآ ود ﯽﯾﺎﺳﺎﻨﺷ ﻪﺑ ﺮﺠﻨﻣ
و A .ﺪﺷ B
يﺎﻬﭙﯿﺗﻮﻧژ مرو ﻪﺑ ﺖﺒﺴﻧ AA
ﺮﺘﻣوﺎﻘﻣ نﺎﺘﺴﭘ ﺪﻨﺘﺴﻫ
) 05 /0 (
نژ ،ﻪﻌﻟﺎﻄﻣ ﻦﯾا هﺪﻣآ ﺖﺳﺪﺑ ﺞﯾﺎﺘﻧ و ﻊﺑﺎﻨﻣ ﯽﺳرﺮﺑ سﺎﺳاﺮﺑ ﯽﻧژ يﺎﻫﺎﮕﯾﺎﺣ زا ﯽﺧﺮﺑ رد و هدﻮﺑ فرﻮﻣ ﯽﻠﭘ نژ ﮏﯾ TLR4
نوﺰﮔا ﻪﯿﺣﺎﻧ رد صﻮﺼﺨﺑ 3
مرو ﻪﺑ ﺖﻣوﺎﻘﻣ رد ﺶﻧﺎﯾراو دﺎﺠﯾا ﺚﻋﺎﺑ هﺪﺷ ﯽﯾﺎﺳﺎﻨﺷ يﺎﻫ ﭗﯿﺗﻮﻧژ و ﺖﺳا هداد نﺎﺸﻧ ﯽﻠﮑﺷﺪﻨﭼ
ﺘﻧ رد .ﺪﺷﺎﺑ ﯽﻣ نﺎﺘﺴﭘ نژ ﻪﮐ دﺮﮐ طﺎﺒﻨﺘﺳا ناﻮﺗ ﯽﻣ ﻪﺠﯿ
و ﻪﺑ موﺎﻘﻣ يﺎﻫ ماد بﺎﺨﺘﻧا ياﺮﺑ بﻮﺧ اﺪﯾﺪﻧﺎﮐ نژ ﮏﯾTLR4 مر
ﺎﺨﺘﻧا رد ﯽﺘﺴﯾﺎﺑ و ﺖﺳا نﺎﺘﺴﭘ .دﻮﺷ هدﺎﻔﺘﺳا ﺮﮕﻧﺎﺸﻧ ناﻮﻨﻌﺑ نژ ﻦﯾا زا ﺎﻬﻣاد ب
6
ﻊﺟاﺮﻣ [1] Goldammer T, Zerbe H, Molenaar A, Schuberth HJ, Brunner RM, Kata SR, Seyfert HM (2004) Mastitis increases mammary mRNA abundance of β- defensin 5, Toll-like receptor 2 (TLR2) and TLR4 but not TLR9 in cattle. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 11:174-185.
[2] Kasravi R (2008) Trouble shooting contagious mastitis in dairy herds. Proceedings of 15th Iranian Veterinary International Convention. Tehran, Iran. 33-37. (In Farsi).
[3] Sordillo LM, Streicher KL (2002) Mammary gland immunity and mastitis susceptibility. Journal Mammary Gland Biology 7:135-146.
[4] Sharma BS, Leyva I, Schenkel F, Karrow NA (2006) Association of Toll-like receptor 4 polymorphism with somatic cell score and lactation persistency in Holstein bulls. Journal Dairy Science 89:3626-3636.
[5] Sabroe I, Read RC,Whyte MK, Dockrell DH, Vogel SN, Dower S (2003) Toll- like receptors in health and disease: Complex questions remain. Journal Immunology 171:1630- 1635.
[6] Wang X, Xu S, Goa X, Ren H, Chen J (2007) Genetic polymorphism of TLR4 gene and correlation with mastitis in cattle. Journal of Genetics and Genomics 34: 406-412.
[7] Mesquita AQ, Rezende CSM, de Mesquita AJ, da Veiga Jardim EAG, Kipnis APJ(2012) Association of TLR4 polymorphisms with subclinical mastitis in Brazilian Holstein. Brazilian Journal Microbiology 43:
[8] Wakchaure RS, Gupta ID, Verma A, Kumar D, Rajesh Kumar S, Soumya NP (2012) Genetic polymorphism in TLR4 and its association with incidences of mastitis in Sahiwal cattle. Wayamba Journal Animal Science 4: 291- 295 .
[9] Gulhane AB, Sangwan ML (2012) Polymorphism in TLR4 gene and its association with mastitis in Murrah buffaloes. Indian Journal Biotechnology 11:330-332. Hill AW (1981) Factors influencing the outcome of Escherichia coli mastitis in the dairy cow Research in veterinary science 31:107-112.
[10]Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S., 2013. MEGA6:
Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution, 30: 2725-2729.
[11] Beecher C, Daly M, Childs S, Berry DP, Magee DA, McCarthy TV, Giblin L (2010) Polymorphisms in bovine immune genes and their associations with somatic cell count and milk production in dairy cattle. BMC Genetics 11:99.
7
Identifying Single Nucleotide polymorphism of TLR4 gene in dairy cattle’s
D. safari, N. Hedayat, R. Seyedsharif, M.D. Shakouri, V. Vahedi, K. Pourasad Department of Animal Science, Faculty of Agriculture and natural resources, University of
Mohaghegh Ardabili.
*[email protected] Abstract:
Mastitis is the most common disease in dairy cattle. Identification of mastitis resistant genes and alleles is necessary to create genetic resistance to this disease. TLRs are candidate genes for genetic resistance to mastitis in dairy cows. In this study, TLR4 polymorphism was studied in a population of dairy cattle and Moghan industry. For this purpose, 100 Holstein cows received blood samples and their DNA was extracted. A pair of primers was designed for the TLR4 gene. The primers amplified a 499-bp fragment in the polymerase chain reaction process (PCR). The analysis of data leads to identify one mutation in TLR4 gene that substituted T to C and change ATC codon to ACC with substitution of Isoleucine amino acid to Threonine amino acids. We observe three genotype that called TT, TC and CC with frequency of 0.03, 0.08 and 0.89 respectively. Hardy- Weinberg test was significant (p<0.05). These result showed that TLR4 gene is suitable genetic markers to choose resistant animal for mastitis.
Keywords: TLR4 Gene, Single nucleotide polymorphism, dairy cattle and genetic markers.
