1
نامدود ریثات هنیهب رب تشک طیحم عون و فلتخم یاه
هشیر دشر یزاس نییوم یاه
تخیرارت رد
هایگ ینساک
(Cichorium intybus L.)
بحم یدهم ،یحتف هیقر ینیدلا
، *
ینمچ لیعامسا نامرف میرک و
روپ
هورگ مولع هدکشناد،ینابغاب
،یعیبط عبانم و یزرواشک ی هاگشناد
ققحم یلیبدرا
سیون*
:لوئسم هدن [email protected]
هصلاخ ینساک زا هلاسود یهایگ هریت
ی Asteraceae یم مهم ییوراد ناهایگ زا یکی و
.دشاب تمسق مامت یاه
( هایگ رذب و گرب و هشیر )
هدافتسا اریز دنراد ییوراد ی ج زا فلتخم ییوراد تابیکرت لماش
،نیلونیا هلم
کیروکیش یئوکسس ،دیسا
نپرت نوتکلا نیراموک ،اه دیئونولاف ،اه
نیماتیو و اه ا اه
.تس هشیر تشک لصاح نییوم یاه
اب حیقلت زا Agrobacterium rhizogenes
شور یدمآراک تیلوباتم دیلوت یارب
هیوناث یاه اریز تسا یهایگ ی
هشیر یکیژولویب و یکیتنژ یرادیاپ زا نییوم یاه تیلوباتم دیلوت هب رداق و دنرادروخرب
تعرس و هاتوک نامز رد اه
یم نومروه نودب تشک طیحم رد دایز دشر .دشاب
هشیر ،قیقحت نیا رد طسوت نییوم یاه
هیوس A4 ی A.
rhizogenes .دش دیلوت
هشیر فلتخم نیلا جنپ ریثات نبرتهب نییعت یارب فلتخم تشک طیحم هس و نییوم یاه
یارب طیارش هشیر دشر
دش یسررب نییوم یاه ینعم توافت
نیلا ریثات نیب یراد تشک طیحم و فلتخم یاه
یاه
فلتخم MS (
MS ، 2 / 1 B5 و ) نزو و هشیر لوط ،هشیر تاباعشنا دیلوت رد هشیر رت
اه .دش هدهاشم تابثا
هشیر یتخیرارت هلیسو هب نییوم یاه
ی رگزاغآ زا هدافتسا اب PCR
نژ یصاصتخا یاه نا rolB
.دش ماج نیلا
C
نیرتشیب نیگنایم
( هشیر باعشنا 22
/ 12 ددع نزو و )هنومنزیر ره رد ( هشیر رت
45 / 3 رد ار )مرگ تشک طیحم.
2MS / 1 نیلا .داد ناشن نیرتشیبB
نیگنایم ( هشیر لوط 33
/ 13 )رتمیتناس تشک طیحم رد یتقو ار
2MS / 1
دش تشک داد ناشن
نیلا نیرتهب . هشیر یاه
ا رد هک نییوم یاه یم ،دش لصاح قیقحت نی
دیلوت دوبهب یارب دناوت
تیلوباتم هیوناث یاه ی
اب شزرا ینساک هایگ دنوش هدافتسا
تاملک یدیلک : هشیر ،زنژوزیار مویرتکابورگا
،نییوم یاه
،ینساک تیلوباتم هیوناث یاه .
همدقم
،عماوج یتملاس و تشادهب نیمأت رد یصاخ تیمها و شزرا زا ییوراد ناهایگ شیپ مه و نامرد ظاحل هب مه
یریگ
یرامیب زا رادروخرب اه
دن ..
شور یتنس یاه ییوراد ناهایگ تشک
هام هب زاین بلغا لاس یتح و اه
نامز اه دیلوت تهج
تیلوباتم هیوناث یاه نراد
د هدش دیلوت تیلوباتم رادقم هولاع هب . یم کدنا رایسب
دشاب .[8]
نینچمه لماوع ریثات تحت
مج زا یددعتم یرامیب لماوع هل
ای از یم ییاوه و بآ تارییغت تهج لح هار کی ناونع هب ییوراد ناهایگ تفاب تشک .دشاب
تیلوباتم دیلوت اب هیوناث یاه
تسا هدش یفرعم شزرا .
یکی زا شور ییاه هک هزورما یارب شیازفا تابیکرت ییوراد رد ناهایگ
ییوراد رایسب دروم هجوت رارق هتفرگ تسا هدافتسا زا تشک تفاب هشیر یاه نییوم یم [3, 10]دشاب . هشیر لیکشت یاه
زا هدافتسا اب ،ناهایگ رد نییوم A. rhizogenes
یم ماجنا دریگ .[2]
هشیر یاه
،نییوم نتشاد اب تعرس
رایسب یدشر
،دایز یرادیاپ یکیتنژ لااب و ناکما دیلوت تیلوباتم هیوناث یاه اب ی
رد ،شزرا نامز
مک اب ارف هدزاب میظنت هب زاین نودب و ناو
2
هدننک یم ییوراد تابیکرت دیلوت یارب دنمدوس یراکهار ،یهایگ دشر یاه هشیر تشک رد لاثم روط هب دشاب
هایگ نییوم یاه
هدام رادقم جنبلارذب نیملاوپوکسا ی
ُ(
Scopolamine )
نازیم هب 1
/ 5 دصرد تسا هدش شرازگ هشیر کشخ نزو [7, 9]
ینساک هایگ
( (C. intybus L. ود تروص هب ،فلتخم قطانم هب هتسب
دنچ و هلاس یم دشر هلاس
مامت ًابیرقت .دنک
تمسق یم رارق هدافتسا دروم ینساک هایگ یاه تافسف و تافلوس ،دیسا کیروکیش ینساک گرب تابیکرت هلمج زا .دریگ
یاه
یاراد هشیر .تسا میساتپ تارتین و میساتپ ،میزینم ،میدس 14
- 11 لونیا دصرد دنق ،نی
زوتکورف ،زکولگ لیبق زا فلتخم یاه
ییوکسس ،نیتکپ ،دیسا کیروکیش ،زراکاس و نپرت
یم کیراترات دیسا ،نوتکلا .دشاب
لگ هدام یواح ینساک یاه کیروکیش ی
یم دیسا ب هشیر زا .دشا یرامیب نامرد رد هایگ نیا ی
،روآاهتشا ناونع هب نینچمه ،مخز مایتلا و یوارفص و یدبک یاه
حم کمک و ارفص کر بت و ردم ،اذغ مضه لمع هب هدننک
یم هدافتسا رب دوش
.[11]
فده زا ا ی ن قحت ی ق هب ی هن زاس ی اقلا و
تشک ر ی هش ی وم یی ن هنومنزیر زا لصاح یاه
ینودلیتوک ینساک هایگ
اب هدافتسا ا ز
rhizogenes
هیوس A.
ی
A4
رد ارش ی ط
نورد ش ی هش ا ی یم .دشاب
شور و داوم اه
دض ینوفع رذب تشک و
تهج دض
،روذب ینوفع ادتبا
هب روذب تدم 33 هقیقد لیمونب لولحم رد 2
دندش یرادهگن دصرد .
سپس ریز دوه رانیملا
لولحم رد تیرلکوپیه
میدس 4 هب دصرد تدم 23 هقیقد دض ینوفع رد ،یشکبآ راب دنچ زا سپو دندیدرگ لکلا
23 دصرد هب
تدم 03 هیناث هطوغ رو دندش و سپس هب تدم 14 هقیقد اب بآ رطقم لیرتسا وشتسش هداد دندش . روذب دض ینوفع هدش رد
طیحم MS تشک
تشک دندیدرگ . لخاد ره هشیش 23 ددع رذب رارق و تفرگ رد
کقاتا دشر اب یامد
±2 24 هجرد
یتناس دارگ و بوانت یرون 11 تعاس ییانشور و 8 تعاس یکیرات یرادهگن دندش .
یرتکاب نویسناپسوس هیهت
زا ینولک کی A. rhizogenes
رد 13 یلیم تشک طیحم رتیل یواح عیام LB
43 یلیم یتنآ رتیل رد مرگ کیتویب
یامد اب روتابوکنا رکیش رد یرتکاب تشک .دیدرگ تشک ،نیسپمافیر 21
هجرد شخرچ اب و دارگیتناس ی 123rpm
تدم هب
25 نازیم .دش هداد رارق تعاس OD600
ب یرتکاب نویسناپسوس تشک طیحم رد حیقلت یار
،LB 1 / 3 .دش هتفرگ رظن رد
مه و حیقلت یرتکاب اب هنومنزیر یتشک
هچهایگ زا یاه
4 هزور
، زیر هنومن هیهت ینودلیتوک ی دش
و ،لپلاکسا غیت اب ندرک مخز زا سپ یرتکاب نویسناپسوس رد
تدم هب 14 هطوغ هقیقد زیر .دندش رو
هنومن ک یور رد ،هدش حیقلت یاه طیحم یور سپس و دیدرگ کشخ ًاتبسن ،یفاص ذغا
MS تشک یواح 3 و زراکاس دصرد 2
تدم هب و تشک راگآ رتیل رد مرگ 22
یامد رد تعاس
±2 24 هجرد و دارگیتناس ی
هنومنزیر .دندش یرادهگن یکیرات طیازش رد ..دندیدرگ تشک رامیت اب هباشم یطیارش رد دهاش ناونع هب زین هدشن حیقلت یاه
سپ مه تدم ندش یرپس زا هنومن زیر ،یتشک
بآ رد اه رطقم
یواح لیرتسا 243
یلیم وشتسش میسکاتوفس رتیل رد مرگ
تشک طیحم هب ،لیرتسا یفاص ذغاک یور ندرک کشخ زا سپ و دندش هداد یواح دماج MS
433 یلیم رتیل رد مرگ
.دش هداد لاقتنا میسکاتوفس رد
ره رارکت زیر جنپ هنومن تشک دیدرگ . دعب زا رارقتسا زیر هنومن اه رد طیحم
،تشک فارطا
یرتپ شید اه اب نوفلس هتسب دش و رد یامد
±2 24 هجرد یتناس دارگ و طیارش 11 تعاس ییانشور ( تدش رون 2333
سکول ) و 8 تعاس یکیرات رارق هداد دندش ..
هشیر روهظ زا هتفه راهچ تشذگ زا سپ هشیر زا نیلا جنپ ،اه
ره هک نییوم ی
3
ک هتفرگ اشنم تخیرارت لولس کی زا ماد دنا
هتشاد ار دشر نیرتشیب و دنا
هب روط هناگادج هب تشک طیحم هداد لاقتناMS
رود اب روتابوکنا رکیش رد و دندش 123rpm
یامد و 21 هجرد .دندش یرادهگن یکیرات رد و دارگیتناس ی
هشیر یلوکلوم دییات ا یاهرمیارپ زا هدافتسا اب نییوم یاه
یصاصتخ
هشیر یلوکلوم دییات تهج جارختسا ،نییوم یاه
شور هب DNA CTAB
.[5]
هشیر زا نینچمه و نییوم یاه
هشیر هنومنزیر زا لصاح یاه دیمسلاپ .دش ماجنا دهاش ناونع هب هتفاین حیقلت یاه
A. rhizogenes هیوس
A4 ی هب زین
همانرب .دش هدافتسا تبثم لرتنک ناونع ی
رگزاغآ اب PCR ه نژ یصاصتخا یا B
یور رب rol ماجنا هدش جارختساDNA
رگزاغآ یلاوت .دش :دوب ریز تروص هب اه
5'-ATGGATCCCAAATTGCTATTCCCCACGA-3' رگزاغآ(
و )میقتسم 5'-TAGGCTTCTTTCATTCGGTTTACTGCAGC-3'
همانرب .)سوکعم رگزاغآ(
RCR ی
یامد رد هیلوا یگتشرساو هخرچ کی لماش 05
هجرد گیتناس ی تدم هب دار
4 ،هقیقد 34 یامد رد یگتشرساو لماش هخرچ
05 هجرد تدم هب دارگیتناس ی 4
رگزاغآ لاصتا ،هقیقد یامد رد اه
44 هجرد تدم هب دارگیتناس ی 54
یامد رد طسب ،هیناث
22 هجرد تدم هب دارگیتناس ی 1
و هقیقد 33 یامد رد ییاهن طسب هخرچ کی و هیناث 22
هجرد هب دارگیتناس ی تدم
2
.دوب هقیقد تلاوصحم
زراگآ لژ رد زروفورتکلا زا سپPCR 8
/ 3 سکع و هدهاشم دروم ،کاد لژ هاگتسد رد دصرد یرادرب
دنتفرگ رارق .
تشک نیلا هشیر فلتخم یاه نییوم یاه
رد طیحم تشک فلتخم یاه
رد نیا ،شیامزآ 2 / 3 نیلا تاباعشنا کون زا مرگ هشیر یاه
نییوم یاه زا مادک ره هک
هدش لصاح تخیرارت لولس کی دنا
یتاعطق تروصب ، هب
لوط 2 یتناس رتم شرب هداد دندش و هب فورظ هشیش ابرم یواح 14 یلیم رتیل طیحم MSتشک
،
2MS / 1 و B5
عیام رد هس رارکت یواح رارکت ره و 433
یلیم یور رب سپس و دیدرگ تشک دندوب میسکاتوفس رتیل رد مرگ
رود اب رکیش 133rpm
د و یام
±2 24 هجرد هشیر تشکاو رابکی هتفه ود ره .دنتفرگ رارق یکیرات رد دارگیتناس ی ماجنا اه
دیدرگ . زا دعب جنپ هشیر ،هتفه دش هدروآ نوریب ابرم هشیش زا اه
و هشیر یلصا باعشنا لوط ،هشیر تاباعشنا دادعت نزو و
رت
نآ اه هزادنا یریگ نیا .دش شیامزآ هب تروص لیروتکاف رد
بلاق حرط
ًلاماک یفداصت ماجنا تفرگ .
و جیاتن ثحب
جیاتن لصاح زا هیزجت سنایراو هداد اه ناشن داد هک رب تشک طیحم عون و نیلا عون لباقتم رثا تاباعشنا دادعت
هشیر لوط و
هشیر اه ینعم ینعم تشک طیحم عون و نیلا عون یلصا تارثا اما هدوبن راد یم راد
قتم رثا نینچمه دشاب عون و نیلا عون لبا
رب تشک طیحم نزو
هشیر رت لامتحا حطس رد نییوم یاه 1
ینعم دصرد یم راد
.دشاب هسیاقم زا لصاح جیاتن نیگنایم ی
داد ناشن اههداد نیلا
( هشیر باعشنا نیرتشیب C 22
/ 12 ( هشیر رتنزو و )هنومنزیر ره رد 45
/ 3 رد ار )مرگ تشک طیحم.
نیلا .تسا هتشاد ناشن MS یبB
( هشیر لوط نیرتش 33
/ 13 یتناس )رتم تشک طیحم رد یتقو ار 2MS
/ 1 دش تشک
درک دیلوت لکش(
1 ).
هیحان جرد و لاقتنا ی
T-DNA عونت اذل دتفایم قافتا یفداصت تروص هب نابزیم هایگ یاه لولس رد
هشیر نیلا ره نیب یدایز یژولوفروم و یدشر اح تخیرارت لولس کی زا مادک ره هک نییوم یاه
هدش لص هدهاشم دنا
یم هخسن دادعت رد عونت عقاو رد .دنوش زا هدش جرد یاه
T-DNA نژ نایب نازیم و
نژ هلمج زا نآ رد دوجوم یاه rol
نیلا یدشر عونت رد ییازسب شقن هشیر فلتخم یاه
دراد نییوم یاه .[1]
نیلا یدشر پیتونف ،شهوژپ نیا رد یاه
رد هناگادج روط هب هک تخیرارت 14
لیم ی تشک طیحم رتیل ،MS
2MS / 1 و ار یدوهشم عونت دندوب هدش تشک عیامB5
4
نیلا زا یخرب .دنداد ناشن دشر نازیم رد یلوط دشر اه نیلا زا رگید یخرب اما دنداد ناشن دوخ زا یدایز یلوط دشر اه
باعشنا اما رتمک شهوژپ دنتشاد یدایز یهد
زین رگید یاه تشک هلمج زا
نیلا یاه یر فلتخم هش
نییوم یاه
هایگ Duboisia leichhardtii تشک طیحم رد
ینعم توافتMS یدشر ناوت رد ار یراد
تیلوباتم دیلوت و یاه
هیوناث
نیلا رد هشیر فلتخم یاه داد ناشن نییوم یاه
.[6]
نیلا یدشر ناوت یسررب یارب یقیقحت رد نینچمه فلتخم یاه
هشیر هایگ زا لصاح نییوم یاه Gentiana scabra
، 25 تشک طیحم رد فلتخم نیلا زا سپ و دوب هدش تشکWPM
8 نیلا کشخ نزو نازیم هتفه جنپ نیلا کشخ نزو هک یروط هب دنتشاد رگیدکی اب یریگمشچ توافت فلتخم یاه
م هب
نازیم 55 نیلا هک یلاح رد تفای شیازفا ربارب 18
دوب هداد ناشن شیازفا ربارب ود ًابیرقت نازیم هب طقف ..[4]
ab
abc abc
de de
a
abc
a
bcd
e cd
abc
bc
cd cd
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
A B C D E
رت نزو نیگنایم(مرگ)
نییوم هشیر فلتخم یاه نیلا
MS 1/2MS B5
C
لکش 1 - نیلا ریثات ( هشیر تاباعشنا نیگنایم رب تشک طیحم عون و فلتخم یاه ( هشیر لوط ،)A
رت نزو و )B (
)C هشیر یاه
نییوم .
5
هشیر یلوکلوم دیئات نییوم یاه
زا لصاح جیاتن راون روضح ،زروفورتکلا وPCR
213 bp
نژ ریثکت هب طوبرم ن ارrolB
دهاش زا لصاح راون اب هک داد ناش
مه )یرتکاب ( تبثم هشیر یارب اما دوب هزادنا
هنومنزیر زا لصاح یاه لکش ( دشن ریثکت یراون هدشن حیقلت یاه
2 .)
لکش 2 - هعطق ریثکت هزادنا هبDNA
ی 067bp شنکاو رد رگزاغآ ابPCR
نژ یصااصتخا یاه rolB
یور رب هشیرDNA
یاه
:.نییوم -1 هزادنا رگناشن ی
،یزابولیک کیDNA -2
A. rhizogenes ،تبثم لرتنک ناونع هب
-3-8 هشیر ،نییوم یاه -9
هشیر یاه
تخیرارت ریغ .
هجیتن یریگ
شیامزآ یلک جیاتن هک داد ناشن اه
ینعم توافت نیلا نیب یراد
فلتخم یاه هشیر
تمسق رد هدش لیلکشت نییوم یاه یاه
دوجو هنومنزیر فلتخم .دراد
عون نینچمه تشک طیحم
ییازسب شقن زین نزو و هشیر لوط ،هشیر تاباعشنا دیلوت رد
رت
هشیر اه دراد
عبانم
1. Cho, H.J. Widholm, J.M. Tanaka, N. Nakanishi, Y. and Murooka Y. 1998. Agrobacterium rhizogenesmediated transformation and regeneration of the legume Astragalus Sinicus (Chinese milk). Plant Science. 138: 53-65.
2. Dhakulkar, S. Ganapathi, T. Bhargava, S. and Bapat, T. 2005. Induction of hairy roots in Gmelina arborea Roxb.
and production of verbascoside in hairy roots. Plant Science. 169: 812–818.
3. Giri, A. and Narasu, M.L. 2000. Transgenic hairy root: recent trends and applications. Biotechnology Advances, 18: 1-22.
4. Huang, S.H. Vishwakarma, R.K. Lee, T.T. Chan, H.S. and Tsay, H.S. 2014. Establishment of hairy root lines and analysis of iridoids and secoiridoids in the medicinal plant Gentiana scabra. Botanical Studies. 55: 1- 17 5. Khan, S. Irfan, Q. M. Kamaluddin, A. and Abdin, M. 2007. Protocol for isolation of genomic DNA from dry and
fresh roots of medicinal plants suitable for RAPD and restriction digestion. African Journal of Biotechnology. 6, 175-178.
6. Mano, Y. Ohkawa, H. and Yamada, Y. 1989. Production of tropane alkaloids by hairy root cultures of Duboisia leichhardtii transformed by Agrobacterium rhizogenes. Plant Science. 59: 191-201.
7. Rischer, H. Häkkinen, S. T. Ritala, A. Seppänen-Laakso, T. Miralpeix, B. Capell, T. Christou, P. and Oksman- Caldentey, K.-M. 2013. Plant cells as pharmaceutical factories. Curr. Pharm. Des. 19: 5640–5660.
8. Ritala, A. Dong, L. Imseng, N. Seppänen-Laakso, T. Vasilev, N. Krol, S. Rischer, S. Maaheimo, H. Virkki, A.
Brändli, j. Schillberg, S. Eibl, R. Bouwmeester, H. and Oksman-Caldentey, K. 2014. Evaluation of tobacco (Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1) hairy roots for the production of geraniol, the first committedstep in terpenoid indole alkaloid pathway. Journal of Biotechnology. 176: 20-28.
9. Sevónand, N. and Oksman-Caldentey, K.-M. 2002. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation: root cultures as source of alkaloids. Planta Med. 68: 859–868.
10. Sujatha, G. Zdravkovic-Korac, S. Calic, D. Flamini, G. and Ranjitha Kumari, B. D. 2013. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Artemisia vulgaris: Hairy root production and essential oil analysis. Industrial Crops and Products, 44, 643–652.
11. Yu, S. Kwok, K.H. and Doran, P.M. 1996. Effect of sucrose, exogenous product concentration, and other culture conditions on growth and steroidal alkaloid production by Solanum aviculare hairy roots. Enzym Microb Technol. 18: 238–243.
6
Effect of Different lines and type of medium on growth of transformed hairy roots in chicory (Cichorium intybus L.)
Roghayeh Fathi, Mehdi Mohebodini*, Esmaeil Chamani, Karim Farmanpour
Department of Horticutural science, Faculty of Agriculture and Natural resources, University of Mohaghegh Ardabili,
*Corresponding Author: [email protected]
ABSTRACT
Chicory (Cichorium intybus L.), is a biennial plant of the Asteraceae family, and is one of the important medicinal plants The whole of this plant (root, leaf, and seed) is used medicinally, because of the presence of inulin, chicoric acid, sesquiterpene lactones, coumarins, flavonoids and vitamins. Hairy root cultures obtained by Agrobacterium rhizogenes infection are an effective method for production of secondary metabolites, because hairy roots are genetically and biologically stable and they are able to produce metabolite within a short time and high growth rate on hormone-free medium. In this research, transgenic hairy root induction was established through Agrobacterium rhizogenes strain A4. The effects of five different line of hairy roots and three different culture media were tested to determine the best suitable for the optimum growth of hairy roots. Significant differences were shown among the 5 independent hairy root lines and different media (MS, 1/2MS and B5) for total root branching, root length and fresh weight of roots. Hairy roots were confirmed by PCR using rolB gene-specific primers. Line C produced the highest root branching (12.72 per explant) and fresh weight (3.54 g) in 1/2MS medium. Line B showed the highest root length (13.03 cm) when cultured in 1/2MS medium. The best hairy root lines, resulted in this study, can be used to improve the production of secondary metabolites of pharmaceutical values of C. intybus L.
Keywords:Agrobacterium rhizogenes, Cichorium intybus L., Hairy roots, Secondary metabolites.
7
