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およびRAW264.7
細胞 (B) に対して，LPS
を 単独またはPA
R2‑ A P( 0 . 1 ‑ 1 0 μ M )
と同時に処置し，2 4
時間後に培地中のNO
濃 度をG r i e s s
法で測定した。腹腔マクロファージでは0 . 1 μ
g/ml，RA W 2 6 4 . 7
細胞 では0 . 0 1 μ
g/mlのLPS
を処置した。LPS
を単独処置した場合のNO
産生量を100%
として表示した。
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単独処置との比較)。2・2・2 Trypsinの抑制作用に対する PARl，3， 4の影響
次に， trypsinによる抑制作用における PAR2以外のPARサブタイプの関与を 検討した。 ddY腹腔マクロファージと RAW264.7細胞に，各々0.1μg/mlと0.01 μg/mlのLPSを，単独またはPARl特異的活性化ペプチドである PARI‑AP(0.1‑10 μM) ， PAR4特異的活性化ペプチドである PAR4‑AP (1‑100μM) と同時に処置
し，培地中の NO産生量を測定した。 PARI‑APの処置は， ddY腹腔マクロファ ージ及びRAW264.7細胞し、ずれの細胞においても LPSによる NO産生に影響を 与えなかった(図 21A，B)。一方， PAR4‑APは， ddY腹腔マクロファージに おいては LPSによる NO産生を抑制したが， RAW264.7細胞においては NO産 生を濃度依存性に促進した(図21C，D)。しかし， ddY腹腔マクロファージに おける PAR4・APのNO産生抑制作用は， trypsinの抑制作用と比較すると著しく 小さいもので、あった。
さらに， PAR1， 3， 4を活性化させる生理活性物質である thrombinを用いて検 討を行った。 ddY腹腔マクロファージと RAW264.7細胞に，各々0.1μg/mlと0.01 μg/mlのLPSを，単独またはthrombin (3 U/ml)と同時に処置し，培地中のNO 産生量を測定したところ， trypsin処置により観察された抑制作用は認められな かった(図22)。
以上より， trypsinによる LPSシグナル抑制作用には，いずれの PARも関与し ていないことが示唆された。
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図21 Trypsinの抑制作用に対する PAR1，4の影響
ddY腹腔マクロファージ (A，C)およびRAW264.7細胞 (B，D) に対して，
LPSを単独またはPARI‑AP (0.1・10μM) (A， B) ， PAR4・AP (1 ‑100μM)
( C
， D)と同時に処置し， 24時間後に培地中のNO濃度を Griess法で測定した。ddY腹腔マクロファージでは0.1μg/ml，RA W264.7細胞では0.01μg/mlのLPSを 処置した。LPSを単独処置した場合のNO産生量を100%として表示した。n=4四100
* : Pく0.05，**: Pく0.01 (LPS単独処置との比較)。
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3 図22 LPSによる NO産生に対する thrombinの影響ddY腹腔マクロファージ (A)およびRAW264.7細胞 (B) に対して， LPSを 単独または thrombin (3 Unit/ml)と同時に処置し， 24時間後に培地中のNO濃 度を Griess法で測定した。 ddY腹腔マクロファージでは 0.1μg/ml，RAW264.7 細胞では 0.01μg/mlのLPSを処置した。 LPSを単独処置した場合の NO産生量を 100%として表示した。 n=6o
* :
Pく0.05 (LPS単独処置との比較)。49
2‑3 Trypsinの抑制作用におけるプロテアーゼ活性の影響
次に， trypsinの抑制作用におけるプロテアーゼ活性の必要性を検討した。プ ロテアーゼ活性の阻害には，鶏卵白 (CEW)由来および大豆 (SW)由来のtrypsin 阻害剤を用いた。RAW264.7細胞に対して， LPS (0.01μg/ml)を単独またはtrypsin (1μM)およびtrypsin限害剤 (SB; 10μg/mL， CEW; 30陀/mL) と同時に 24 時間処置し，培地中のNO濃度を測定したところ， trypsinによる NO産生抑制作 用は trypsin阻害剤により解除された(図 23)。
以上より， trypsinのLPSシグナル抑制作用にはプロテアーゼ活性が必要で、あ ることが示された。
2‑4 LPSに対する trypsinの影響
これまでの実験はLPSとtrypsinを同時に処置しているため， trypsinがLPSを 直接分解することでLPSシグナルを抑制する可能性が考えられた。そこで， ddY 腹腔マクロファージに trypsin (1.0μM) を1時間前処置い洗浄により trypsin を除去した後， LPS (0.01μg/ml)を 24時 間 処 置 し 培 地 中 の NO量を測定し たところ， trypsin前処置は LPSによる NO産生を抑制した(図 24)。
以上より， trypsinのLPSシグナル抑制作用に， trypsinによる LPSの分解は関与 しないことが示された。
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・‑6 圃 CEVlSB図23 Trypsinの抑制作用に対する trypsin阻害剤の影響
RAW264.7細胞に対して， LPS (0.01μg/ml)を単独またはtrypsin (1μM) を 同時に処置し， 24時間後の培地中のNO濃度を Griess法で測定した。またtrypsin 処置時に鶏卵白由来 CCEW;30陀/mL)または大豆由来 (SB;10μg/mL)のtrypsin 阻害剤を処置することで， trypsinのプロテアーゼ活性を阻害した。 LPSを単独 処置した場合のNO産生量を 100%として表示した。 n=3‑7o
* :
Pく0.05 (LPSとtrypsinの同時処置との比較)。
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