エリスロマイシンやテトラサイクリンに代表されるポ リケチド抗生物質は，化学構造と生理活性の多様性に最 も富んだ抗生物質の一群である．主に放線菌などの微生 物が生産することが知られており，脂肪酸生合成と類似 した機構で生合成されることが知られている．脂肪酸生 合成では，アセチルACP（アシルキャリアープロテイ ン）とマロニルACP間のクライゼン型縮合反応により アセトアセチルACPが生成し，次いで
β
位のカルボニル 基が水酸基に還元され，さらに脱水反応によりα
,β
-不飽 和エステルに変換される．そして，さらに二重結合が還 元されることで酢酸ユニット（二炭素）が伸長したブタ ノイルACPに変換される．この鎖伸長反応サイクルを 繰り返すことで長鎖脂肪酸は生合成される．ポリケチド 生合成では，結果的に還元段階の異なる酢酸ユニットが 連結していくことにより，さまざまな組み合わせの炭素 鎖が形成されることになる．また，伸長鎖ユニットはマ ロニルCoAに加えて，メチルマロニルCoAやメトキシ マロニルACPなども存在し，ポリケチド化合物の多様 性創出の一端を担っている．鎖状構造か環状構造，また 芳香族ポリケチド化合物のようにポリケチド鎖が芳香環 化するなど，ポリケチド鎖の折り畳まれ方によっても多 様な化合物が形成される．さらには，ポリケチド合成酵 素反応以後のポストPKS修飾と言われる水酸化や配糖 化を受けることで活性型の化合物へと変換されることが 多い．そのようなポリケチド化合物の構造多様性を拡げるも う一つの要因として，ポリケチド鎖伸長における開始基 質の多様性が挙げられる（1）．酢酸やプロピオン酸などの 低級脂肪酸が開始基質になる場合が多いが，エバーメク チン生合成におけるイソブタン酸や2-メチルブタン酸，
FK506生合成における3,4-ジヒドロキシシクロヘキサン カルボン酸，リファマイシン生合成における3-アミノ-5- ヒドロキシ安息香酸など，さまざまな開始基質が知られ ている（図1）．本稿では，アミノ基を含有する開始基 質から形成されるポリケチド化合物，なかでもそのアミ ノ基を利用してラクタム環となった化合物（マクロラク タム）の生合成系に焦点を当てる．マクロラクタム抗生 物質は，環状アミド構造を有する点で特徴的であり，独 特な抗菌性や抗腫瘍性を有する化合物が多数知られてい る．このようなアミノ基を有する開始基質を生合成工学 手法により改変させることで，活性向上や類縁体創製も 期待できる化合物群である（2）．
図2にはこれまで単離同定されたマクロラクタム化合 物をいくつか示してある．リファマイシンやレイナマイ シンの例を除いて，いずれも
β
位にアミノ基を有するβ
- アミノ酸が開始基質として生合成されていることが推察 できる．β
-アミノ酸を含むペプチド化合物は，通常のタ ンパク質加水分解酵素には認識されくいと想像される．しかしながら，なぜ多くのマクロラクタム抗生物質が
β
- アミノ酸を開始基質に用いるのかはいまだに不明であセミナー室
天然化合物の探索と創製-8β -アミノ酸含有マクロラクタム抗生物質の生合成
工藤史貴，宮永顕正，江口 正
東京工業大学大学院理工学研究科
第二部：天然物の創製
る．抗生物質としての構造と機能を獲得するために利用 しているかもしれない．
このような
β
-アミノ酸はどの生物にも存在しているわ けではなく，抗生物質など二次代謝産物を生産する生物 が独自に生合成している（図3）．これまでにさまざま なβ
-アミノ酸含有型天然物が単離構造決定されており，それぞれに特徴的な生物活性を有している．たとえば，
イチイの木が産生する抗がん剤としても有名なタキソー ルは，特徴的なジテルペン骨格に
α
-L-フェニルアラニン から生合成される（ ）-β
-フェニルアラニン誘導体が結 合している．α
-L-フェニルアラニンをβ
-フェニルアラニ ンへと変換するフェニルアラニンアミノムターゼもイチ イから単離，クローニングされている（3）．微生物が産生 するマクロラクタム化合物に話を戻すと，ヒタチマイシンは（ ）-
β
-フェニルアラニンを開始基質として生合成 されることが容易に想像されるが，この部位には標識L- フェニルアラニンが効率良く取り込まれることが報告さ れており（4），フェニルアラニンアミノムターゼが（ ）-β
-フェニルアラニンを形成して生合成されると推定でき る．ほかにも，インセドニン生合成系では標識グルタミン 酸，
β
-グルタミン酸，3-アミノ酪酸が効率良く取り込ま れたことから，グルタミン酸2,3-アミノムターゼによりβ
-グルタミン酸が生じ，さらに脱炭酸反応により3-アミ ノ酪酸が生じることが明らかになっている（5）．これらの 例のようにα
-L-アミノ酸のアミノ基 転位 反応によりβ
-アミノ酸が生じることが多いが，クレミマイシンなど の3-アミノ脂肪酸はそのような転位反応を伴わないことO O CH3
CH3CH3 OH OH
CH3
CH3 O
NH O O
OH OH H3C
O O CH3 HO H3C O H3C
O
rifamycin B erythromycin A
O O
O
O O
OH OH OH
O CH3OH OCH3
CH3 O
N(CH3)2 HO Me
FK-506
O OCH3
OH O
OH H3CO
N
O O OOH O H3CO
H
avermectin
O O
O
O OH OH O
O H
O H3CO H3C O H3C O
H3CO HO O
OH
O H
OH OH
OH HO
O NH2
OH HO
O
図1■ポリケチド生合成における開始基質（スターター）の多様性
O HN
H3C
CH3 CH3
CH3 O
vicenistatin H3C O
NH OH
NH CH3 O
OCH3
CH3 CH3
CH3 O
NH N O
H H3C
OHO OHO CH3
incednine salinilactam
HN CH3
O O H3C O
cremimycin OCH3
HO
CH3
O
OH OH
O HN
ML-449 O CH3 CH3
HO OH HN
O CH3 CH3
HO OH
BE-14106
HN
H3CO O
hitachimycin CH3
O
OH OH H3C
H3C
H3C NH
HO
OH OH
OH CH3
O CH3
CH3 NH
O
fluvirucin A1 O
OOH NHOH2 CH3
NH
OH O
HO
CH3 CH3
HO CH3
OH
micromonolactam
図2■β-アミノ酸をポリケチドスターター部位に有するマクロラクタム抗生物質
O O CH3
CH3 CH3 OH OH
CH3
CH3 O
NH O O
OH OH H3C
O O CH3 HO H3C O H3C
O
rifamycin B erythromycin A
O O
O
O O
OH OH OH
O CH3OH OCH3
CH3 O
N(CH3)2 HO Me
FK-506
O OCH3
OH O
OH H3CO
N
O O OOH O H3CO
H
avermectin
O O
O
O OH OH O
O H
O H3CO H3C O H3C O
H3CO HO O
OH
O H
OH OH
OH HO
O NH2
OH HO
O
O H
N
H3C
CH3 CH3
CH3 O
vicenistatin H3C O
NH OH
NH CH3 O
OCH3
CH3 CH3
CH3 O
NH N O
H H3C
OHO OHO CH3
incednine salinilactam
HN CH3
O O
H3C O
cremimycin OCH3
HO
CH3
O
OH OH
O HN
ML-449 O CH3 CH3
HO OH HN
O CH3 CH3
HO OH
BE-14106
HN
H3CO O
hitachimycin CH3
O
OH OH H3C
H3C
H3C N
HO H
OH OH
OH CH3
O CH3
CH3 NH
O
fluvirucin A1 O
OOH NHOH2 CH3
NH
OH O
HO
CH3 CH3
HO
CH3 OH
micromonolactam
が明らかとなった（6）（図3）．3-アミノ脂肪酸の炭素骨格 から容易に想像されるのは，脂肪酸生合成中間体の
β
位 がアミノ化される経路である．β
-ケトエステルがアミノ 基転移酵素によりアミノ化される機構は，ミクロシスチ ンのようなラン藻由来環状ペプチドの生合成系に見られ る戦略である．一方，クレミマイシンにおける3-アミノ ノナン酸は，α
,β
-不飽和脂肪酸エステルへのグリシンの 共役付加，引き続いてFADによる酸化反応により生じ ることがわかった．これはβ
-アミノ酸の新たな生合成経 路である．このように生成した
β
-アミノ酸が天然物に取り込まれ るので，何らかの生合成酵素がβ
-アミノ酸を認識してポ リケチド合成酵素（PKS）へと受け渡す経路が容易に想 像できる．非リボソーム性ペプチド生合成系（NRPS）においては，
α
-L-アミノ酸がアデニレーション（A）ド メインによりアデニル化されることで活性化され，隣の ペプチジルキャリアープロテイン（PCP）ドメインのホ スホパンテテイニル基にロードされる．このように生じ たアミノアシル-PCPと，生合成されてきたペプチジ ル-PCPの間でアミド結合が形成され，ペプチド鎖が伸 長していく．これと同じロジックがβ
-アミノ酸の活性化 と運搬に当てはまると予想したが，もう一手間かかる独 特な生合成ロジックが存在することが明らかとなった．ビセニスタチン生合成では，安定同位体標識化合物を 用いた取り込み実験において，グルタミン酸から変換さ れる（2 ,3 ）-3-メチルアスパラギン酸（3-MeAsp）が取 り込まれ，3-アミノイソブタン酸（3-AIB）は取り込ま れなかったことから，遊離の3-MeAspがアデニル化酵 素による活性化を受けPCP（もしくはACP）へと受け 渡される経路が予想された（図4）．実際に，NRPSのA ドメインと相同性を有するアデニル化酵素VinNは，天 然のL-
α
-アミノ酸を認識しないのに対し，3-MeAspを高 選択的に認識しアデニル化することがわかった．その後 はACPにロードされると考えられたが，PKSのロー ディングドメインにあるACPではなく，遺伝子クラス ター中にコードされるスタンドアローンACPである VinLに受け渡されることが明らかとなった（7）．ビセニスタチン生合成系では，
β
位のカルボン酸が生 合成過程で除去されなければならないが，PLP依存型酵 素VinOにより，β
位のアミノ基を起点とした脱炭酸反 応が進行すると考えられ，実際に3-MeAsp-VinLを基質 とする脱炭酸反応がスムーズに進行することが明らかと なった．すなわち，この段階でようやくポリケチド骨格 のスターター部位に相当する3-AIBが形成されることが わかった．この結果は，遊離の3-MeAspはVinOの基質 にならず，遊離の3-AIBがビセニスタチンに取り込まれO OH NH2 O HO
O OH O HO
NH2 O
OH NH2
IdnL4 IdnL3
NH2 O
OH
O OH
O OH NH2 phenylalanine
aminomutase
incednine
cremimycin O NH
OH O
OH O OHO
H O O
O O
O
taxol O
O
hitachimycin
CmiS2 OH O NH OH O
OH O NH2
FAD
+
HO O
O H
OH O N OH O
H2O S
O CmiS1
glycine 1)
2)
3)
KS C C
CM ACP
AT AMT A PCP
McyE
S O
NH2
O
O
NH
HN N
O O O OH
O NH
O
HN
NH NH2 HN
O HN
HO OO HN O
microcystin-LR 4)
ACP
図3■さまざまなβ-アミノ酸生合成経路
O OH NH2 O HO
O OH O HO
NH2 O
OH NH2
IdnL4 IdnL3
NH2 O
OH
O OH
O OH NH2 phenylalanine
aminomutase
incednine
cremimycin O NH
OH O
OH O OHO
H O O
O O
O
taxol O
O
hitachimycin
CmiS2 OH O NH OH O
OH O NH2
FAD
+
HO O
O H
OH O N OH O
H2O S
O CmiS1
glycine 1)
2)
3)
KS C C
CM ACP
AT AMT A PCP
McyE
S O
NH2
O
O
NH
HN N
O O O OH
O NH O
HN
NH NH2 HN
O HN
HO OO HN O
microcystin-LR 4)
ACP
ないことと矛盾せず，ほかの実験の結果とよく一致して いる．
このようにして生じた3-AIB-VinLがPKSにロードさ れると考えるのが通常ではあるが，生合成遺伝子クラス ター中に生合成に関与しなくなってしまう機能未知の余 剰の遺伝子が存在するため，それらの遺伝子産物が何ら かの形で生合成に関与すると考えられた．一つはVinN と相同性のあるアデニル化酵素VinMであり，何らかの カルボン酸を活性化して，アシル化を触媒すると推定さ れた．もう一つはペプチダーゼと相同性を有するVinJ で，何らかのアミノアシル部位を加水分解する活性を有 すると推定された．そこで，VinMが3-AIB-VinLをア シル化し，VinJがマクロラクタム化前にアシル基を加 水分解する経路が想定された．このなんとも無駄な変換 反応の意義としては，PKS上での鎖伸長の際，特にモ ジュール1による鎖伸長時に生じる中間体は末端のアシ ル基がないと熱力学的に安定な六員環ラクタムとなると 考えられ，このアシル化反応はそれを回避するための保 護基として働くためのものと考えられた．
実際にVinMの酵素反応解析を行うと，VinMは低級 脂肪酸を認識せず，L-
α
-アミノ酸の中でも，グリシン，アラニン，セリンといった比較的小さなアミノ酸をアデ ニル化する活性を有することがわかった．さらに，
ATP存在下で3-AIB-VinLとVinMとアラニンを混合す ると3-AIB-VinLがアラニル化された分子由来と考えら れるマススペクトルが得られた．興味深いことにVinM
はVinLを直接アミノアシル化する活性をもっていな かった．さらにVinN, VinM, VinO, VinL, 3-MeAsp, ア ラニン，ATPが同時に存在する条件下ではAla-3-AIB- VinLだけが選択的に生成することから，VinMは3-AIB- VinLを受容体として選択的に認識してアミノアシル化 する酵素であることがわかった．
ビセニスタチン生合成に関与するPKSの特徴として，
ローディングモジュールに単独のACPドメインが存在 することが挙げられる．このACPドメイン（VinP1-Ld- ACP） に，先 に 述 べ たAla-3-AIB-VinLか らAla-3-AIB が転移されると推定した．またこの反応は遺伝子クラス ター中の単独のアシル基転移酵素VinKが触媒すると予 想された．実際にVinP1-Ld-ACPを単独発現させて，酵 素反応解析してみると，予想したとおりにAla-3-AIB- VinLのジペプチド部位がVinP1-Ld-ACPに転移される こ と が わ か っ た．ま た，Ala-3-AIB-VinL, 3-AIB-VinL, 3-MeAsp-VinLの三者を等モル混合してアシル基転移反 応を行った場合，Ala-3-AIBだけが選択的に転移された 生成物が検出されたため，VinKはAla-3-AIB-VinLを選 択的に認識することも明らかとなった．すなわち，末端 のアラニル基の存在はVinKによる基質認識能にも関与 することがわかった．一方，VinKがどのように受容体 であるVinP1-Ld-ACPを認識するかは不明で，現在，酵 素の結晶構造解析研究を進めている．
Ala-3-AIBを開始基質としてPKSにより鎖伸長が触媒 され，マクロラクタム化される前に末端のアラニル基が
L-Glu
VinN
holo VinL O
OH NH2
VinH, VinI NH2 CH3
NH2 CH3
O O
AMP
ACP KS MT
DH ER
ACP KR VinP1 mod1
S S
O CH3
NH O
CH3 NH
H2N O
O H2N
VinO
L-Ala VinMATP
NH2 CH3
S O
VinL H2N
CH3
S O
VinL
NH CH3 S O
VinL O
CH3
VinK ATP
H2N
CH3
CH3
VinP1, 2, 3, 4
HO S
H3C
CH3 CH3
CH3 O KS
MT DH
ACP KR VinP4 mod8
TE HN NH2
O CH3 VinL : acyl carrier protein (ACP)
MeAsp-VinL 3-AIB-VinL
M
HO H
N
H3C
CH3
CH3
CH3 O VinJ
HO S
H3C
CH3
CH3
CH3 O KS
MT DH
ACP KR
TE NH2
TE O
HO
O HO
O OH
O HO
O HO
O H
N
H3C
CH3
CH3
CH3 O
vicenistatin H3C O
NH OH H3C VinC VinP1 Ld
Ala-3-AIB-VinL
図4■Vicenistatinのβ-アミノ酸（3-アミノイソブタン酸）の取り込み機構と生合成
L-Glu
VinN
holo VinL O
OH NH2
VinH, VinI NH2 CH3
NH2 CH3
O O
AMP
ACP KS MT
DH ER
ACP KR VinP1 mod1
S S
O CH3
NH O
CH3 NH
H2N O
O H2N
VinO
L-Ala VinMATP
NH2 CH3
S O
VinL H2N
CH3
S O
VinL
NH CH3 S O
VinL O
CH3
VinK ATP
H2N
CH3
CH3
VinP1, 2, 3, 4
HO S
H3C
CH3 CH3
CH3 O KS
MT DH
ACP KR VinP4 mod8
TE HN NH2
O CH3 VinL : acyl carrier protein (ACP)
MeAsp-VinL 3-AIB-VinL
M
HO H
N
H3C
CH3
CH3
CH3 O VinJ
HO S
H3C
CH3
CH3
CH3 O KS
MT DH
ACP KR
TE NH2
TE O
HO
O HO
O OH
O HO
O HO
O H
N
H3C
CH3
CH3
CH3 O
vicenistatin H3C O
NH OH H3C VinC VinP1 Ld
Ala-3-AIB-VinL
除去される機構を証明するために，セコビセニラクタム の -アラニル-エチルエステル体を基質類縁体として合 成し，VinJの酵素活性を検証した．その結果，予想し たとおり効率良くアミドの加水分解反応が進行し，生じ たセコビセニラクタムエチルエステルはPKSのチオエ ステラーゼドメインによりマクロラクタム化された．以 上，推定した保護‒脱保護が含まれる生合成経路の存在 が証明された．なお，ビセニスタチンの3-AIB部位の立 体化学は，生合成過程においてエピメリ化されなければ ならないが，どの段階でエピメリ化するかについては現 在検討中である．
微生物二次代謝産物の中には，ここで示した保護・脱 保護反応のように，生合成過程では存在していたアミノ 酸やペプチドが取り除かれることで，活性型の天然物が 生合成される経路が存在することが最近認識されるよう になってきた（8）．Xenocoumacin生合成では，N末端側 のアシルアミノ酸がペプチダーゼ様酵素XcnGによって 除去され，活性型の天然物が生合成される．Caerulo- mycin生合成も同様であるが，こちらはC末端側のアミ ノ酸が除去されて，活性型の天然物への生合成が進んで いく．天然物に含まれるアミノ酸のアミノ基やカルボキ シ基の（保護‒）脱保護の機構は，広く天然物生合成マシ ナリーに組み込まれていると推定され，新たな活性型天 然物探索で考慮すべき生合成機構である．
また，われわれは
β
-アミノ酸含有型マクロラクタム抗 生物質であるクレミマイシンとインセドニン生合成遺伝 子クラスターも特定し，両者にビセニスタチン生合成に おける3-AIBの運搬にかかわる酵素VinJ, VinK, VinL, VinM, VinNと相同性を有する5つの酵素遺伝子が保存 されていることを明らかにしている（6, 9）．これらは現在 までに報告されているほかのβ
-アミノ酸含有型マクロラ ク タ ム 生 合 成 遺 伝 子（salinilactam（10），BE-14106,（11）ML-449,（12） micromonolactam（13））クラスターにも保存 されている．さらに，いくつかの解読された微生物ゲノ ム中にも，これら5つの酵素遺伝子が群をなして保存さ れており，それぞれ
β
-アミノ酸含有型マクロラクタム化 合物の生合成に関与すると推定される．実際，ノボビオシン生産菌として知られている に
はBE-14106生合成遺伝子クラスターがコードされてお り（14），その生産性が確かめられている．これら5つの 酵素遺伝子をクエリーとすることで，新規な
β
-アミノ酸 含有型マクロラクタム生合成遺伝子を発見できると期待 される．β
-アミノ酸を運搬する酵素のうち，VinNホモログが，各天然物の生合成経路に特異的な
β
-アミノ酸を認識しゲートキーパーの役割を果たしているのは容易に想像で きる（図4）．この酵素の基質認識を改変することがで きれば，天然型とは異なった
β
-アミノ酸を取り込ませ て，新たなマクロラクタム化合物の創製も期待できる．現在，基質認識機構を解明すべく結晶構造解析を進めて おり，それを基にした基質認識改変を検討している．こ れら生合成系を利用した新規マクロラクタム化合物の創 製も，近い将来報告できるときがくるだろう．
文献
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14) K. Flinspach, C. Ruckert, J. Kalinowski, L. Heide & A. K.
Apel: , 2, e01146 (2014).
プロフィル
工藤 史貴（Fumitaka KUDO）
＜略歴＞1994年東京工業大学理学部化学 科卒業／1999年同大学大学院理工学研究 科化学専攻博士後期課程修了，博士（理 学）／同年米国ブラウン大学化学科博士研 究員／2001年米国ジョンンズホプキンス 大学化学科博士研究員／2003年東京工業 大学大学院理工学研究科化学専攻助手
（2007年，助教に職名変更）／2010年同准 教授，現在に至る＜研究テーマと抱負＞天 然物生合成研究＜趣味＞ジョギング
宮永 顕正（Akimasa MIYANAGA）
＜略歴＞2001年東京大学農学部生命工学 専修卒業／2006年同大学大学院農学生命 科学科応用生命工学専攻博士課程修了，博 士（農学）／同年同大学大学院農学生命科学 科博士研究員／2009年米国カリフォルニ ア大学サンディエゴ校スクリプス海洋研究 所博士研究員／2011年東京理科大学理工 学部助教／2012年東京工業大学大学院理 工学研究科化学専攻助教，現在に至る＜研 究テーマと抱負＞天然物生合成研究，構造 生物学＜趣味＞旅行
江 口 正（Tadashi EGUCHI）
＜略歴＞1980年横浜市立大学文理学部理 科化学課程卒業／1982年東京工業大学大 学院総合理工学研究科生命化学専攻修士課 程修了／同年大正製薬総合研究所研究員／
1987年 い わ き 明 星 大 学 理 工 学 部 助 手／
1990年東京工業大学理学部化学科助手／
同年学位取得（理学博士）／1995年東京工 業大学理学部化学科助教授／1998年同大 学大学院理工学研究科物質科学専攻助教授
（配置換え）／2005年同大学大学院理工学 研究科物質科学専攻教授，現在に至る＜研 究テーマと抱負＞専門分野は，生物有機化 学，天然物有機化学，生化学．本分野の大 海の1滴を知ろうと牛歩の歩みながら，さ まざまな視点から研究を進めている＜趣 味＞夜な夜なお酒を飲むこと
Copyright © 2014 公益社団法人日本農芸化学会
