● 化学 と 生物

はじめに

なぜDNAの塩基は4種類なのだろうか？ 塩基の種 類が増えたらどんな生物やどんなバイオ技術ができるの だろうか？ そもそも，塩基の種類を増やすことが，人 工的にできるのだろうか？ 生物の授業で初めてDNA を学んだとき，そんな疑問をもった人はいませんか？

4種類の塩基がA‒T，ならびに，G‒Cの塩基対を選択 的に形成することにより，DNAは複製され，RNAへと 転写され，そして，RNAの塩基配列がアミノ酸配列へ と翻訳されてタンパク質が合成される．この2種類の天 然型塩基対に加えて，もし第三の塩基対を複製→転写→

翻訳のセントラルドグマに組み込むことができたら（図 1_），どんなことが起こるのだろう？

実は，tRNAの立体構造の解明や左巻きDNA二重ら せん構造の発見で名高いAlexander Richが，すでに 1962年の総説中で第三の塩基対の化学構造式を示し，

その可能性を考察している⁽¹⁾．DNAの二重らせん構造 が 誌に掲載されたのが1953年，Richの予言は，

まだ遺伝暗号表が解明され出した最中のことであった．

もし，2種類の天然型塩基対に人工的な塩基対（人工 塩基対）を加えて，6種類の塩基からなるDNAが存在 するとしたら，2つの塩基のみの並び（2塩基コドン）

では，36通り（6×6）の組み合わせができるので，コ ドンに3つの塩基（図2A）を用いなくても20種類のア

ミノ酸に対応することができる（図2B）．Richの1962 年の総説では，このアイデアが述べられている．これを さらに発展させると，たとえば，6種類の塩基の場合，3 塩基コドンの組み合わせは216通り（6×6×6）に増える

（図2C）．この拡張版の遺伝暗号表に，多種類の非天然 型アミノ酸を組み込めば，将来的には100種類のアミノ 酸からなるタンパク質を作り出す生物システムが作れる かもしれない．もちろん，DNAやRNAも塩基の種類が 増えるので，核酸分子自体の機能も向上させることがで きるだろう．

Richの総説から半世紀を経て，ようやく複製で機能 する人工塩基対が作り出されるようになった．今まさ に，合成生物学をさらに一歩進めたXenobiologyという 非天然合成生物学の研究が広がりつつある．本稿では，

筆者ら，ならびに，Floyd Romesbergら，Steven Ben- nerらの実用化レベルに達している人工塩基対の開発と それらの応用研究について解説する．

最初の人工塩基対：iG‒iC塩基対

Richが1962年の総説で示した第三の塩基対は，イソ グアニン（iG）とイソシトシン（iC）の塩基対であった

（図3_A）．A‒TとG‒Cの塩基対は，それぞれの塩基が水 素結合で結ばれている．そして，それぞれの水素結合の 向き（プロトン供与→プロトン受容）はA‒TとG‒Cで

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

セミナー室

合成生物学を意識した核酸改変技術の現状と展望-5

遺伝情報を拡張する人工塩基対技術から新たな研究領域 Xenobiologyに向けて

平尾一郎，木本路子

Institute of Bioengineering and Nanotechnology （IBN）, A*STAR, Singapore

異なる（図1参照）．これが，AはTのみと，また，Gは Cのみと選択的に塩基対を形成する仕組みと考えられて いる．したがって，これらの天然型塩基対とは異なる水 素結合様式をもつ塩基対を設計すれば第三の塩基対がで きる．こうして考え出された塩基対の一つが，iG‒iC塩 基対であった．

iG‒iC塩基対は，1980年代後半になって，Bennerら により，それぞれの塩基のヌクレオチド誘導体が化学合 成された⁽²⁾．そして，複製や転写で試験され，人工塩基 対開発の可能性が示された⁽³⁾．しかし，iG‒iC塩基対は，

複製や転写において，第三の塩基対として利用できる精 度の選択性を有してはいなかった．この主な理由は，iG 塩基がケト・エノールの互変異性により，Tとも塩基対

を形成してしまうためであった（図3A）．その後，一時 的に人工塩基対研究は下火になったが，バイオ技術の急 速な進展とともに非天然型成分を組み込む技術が必須と なり，1990年の後半より，再び，人工塩基対の開発が 盛んになった．

人工塩基対開発の研究方法

人工塩基対開発の最初の関門は，第三の塩基対として 複製で選択的に機能するものを作ることである．人工塩 基の基質（ヌクレオシド三リン酸）が，DNAポリメ ラーゼによって，鋳型鎖DNA上の相補人工塩基と選択 的に塩基対が形成され，相補鎖DNA中に取り込まれな 図1^■人工塩基対による遺伝情報拡張技術 A‒TとG‒Cの塩基対に加えて，第三の塩基 対（X‒Y，人工塩基対）が，複製，転写，

翻訳で機能すれば，DNAやRNA，タンパ ク質の特定の部位に人工の構成成分を導入 することができる．AA-1, AA-2:  非天然型 アミノ酸．プリン塩基（AとG）の3位の窒 素原子（赤字），ピリミジン塩基（TとC）

のケト基（赤字）は，ポリメラーゼとの相 互作用に必要．

図2^■塩基の種類に応じた遺伝暗号表 A）通常の4種類の塩基からなる3塩基コドン による遺伝暗号表．B）6種類の塩基からなる 2塩基コドンによる遺伝暗号表．C）6種類の 塩基からなる3塩基コドンによる遺伝暗号表．

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

ければならない．

人工塩基対のように，新しい物質を作り出す研究で は，どのようなアイデアで，また，どのような研究手法 で進めるかが重要になる．現在までに，実用化レベル  に達する人工塩基対を有しているのは，筆者ら，そし て，Bennerら，Romesbergらの3つの研究チームであ

る^(4, 5)．それぞれの研究チームの人工塩基対は，個性的

で異なる概念により開発されたものであるが，どれも概 念立証型（Proof of concept）の研究から生まれている．

概念立証とは，ある概念に基づいて，検証実験を行 い，得られた結果からさらに概念を修正・補強し，さら に検証実験を行う，というものである．難易度の高い研 究では，概念の構築とその検証実験を何度も繰り返すこ とにより，最終目的を目指す．概念立証型の研究では，

実は，ポジティブな結果よりもネガティブな結果のほう が貴重であり，そこから新たなアイデアが生み出される ことが多い．ネガティブな結果ばかりになると，精神的 には辛いが，慣れてくると，そこに隠れている宝探しが 楽しくなってくる．

この概念立証型の研究を始めるには，関連する研究の バックグラウンドを知ること，そして，研究に必要な実 験技術を身に付けていることが必須である．複製で機能 する人工塩基対を開発するためには，化学と生物の両分 野の基礎知識と実験技術に加えて，これまでの塩基対関 連の研究，塩基部の修飾にかかわる核酸化学の研究，複 製とその修復に関する生化学研究，DNAポリメラーゼ の構造学的な研究などの論文をできる限り頭に入れてお く必要がある．

たとえば，DNAポリメラーゼとDNA，ならびに，基

質の三者複合体のX線結晶構造解析は，重要な情報の 一つである⁽⁶⁾．この複合体の立体構造から，鋳型鎖中の 塩基と基質の相補塩基がポリメラーゼ内で塩基対を形成 する際に，それぞれの塩基の特定の部位のプロトン受容 性の原子や置換基が，ポリメラーゼとの相互作用に必須 であることが示されている．AやGのプリン塩基では3 位の窒素原子，TやCのピリミジン塩基では2位のケト 基がこれに相当する（図1参照）．設計する人工塩基に は，この知見を組み込まなければならない．

もう一つの重要な情報は，Eric Koolらによって得ら れていた⁽⁷⁾．彼らは，複製での塩基対形成における塩基 間の水素結合の重要性を再検証するために，AとTの塩 基からそれぞれ水素結合性の置換基や原子を除き，しか し，分子の形はそれぞれの塩基と類似するZとFという 塩基類似体を設計・化学合成し，DNAポリメラーゼを 用いた複製実験を行った（図3B）．その結果，基質Zは 鋳型鎖中のFやTと，また，基質Fは鋳型鎖中のZやA と塩基対を形成してDNA中に選択的に取り込まれるこ とがわかった．この結果は，複製における塩基対形成に おいては，塩基間の水素結合はそれほど重要ではなく，

対合する塩基の形の適合性（形状適合性）が大きな要因 であることを示すものであった．このZ‒F塩基対は，

A‒Tとの互換塩基対であるため，第三の塩基対にはな らないが，人工塩基対の設計に，形状適合性の概念が有 効であること，また，水素結合をもたない疎水性の塩基 対がその候補になることが示された．

複製で機能する人工塩基対

筆者らは，主に形状適合性の概念を拡張して人工塩基 対の設計を進めた．開発初期には，水素結合を有する塩 基類似体に，望ましくない天然型塩基との対合を立体障 害のアイデアを用いて抑制することにより，転写で機能 する人工塩基対（x‒y）の開発に成功した⁽⁸⁾（図4_A）． 次いで，この立体障害の効率を高めることにより，転写 と翻訳で機能するs‒y塩基対を開発した⁽⁹⁾．しかし，水 素結合性の人工塩基対の開発に限界を感じ，その後は，

s‒y塩基対を疎水性の塩基対に作り変えることにした．

そして，形状適合性をさらに高めることにより，複製で 機能する人工塩基対（Ds‒Pa）に到達した⁽¹⁰⁾．さらに，

PaとAの望ましくない塩基対の形成をできるだけ抑え るために，Paのアルデヒド基をニトロ基に変えたPxを 設計した⁽¹¹⁾（図4A）．このニトロ基の酸素原子は，Aの 1位の窒素原子と静電的に反発する．こうして作られた Ds‒Px塩基対は，複製で非常に高い選択性を有し，100 図3^■初期の人工塩基対研究

A）最初の人工塩基対：iG‒iC塩基対．iGのケト体は，iCと塩基対 を形成するが，水溶液中では，iGのエノール体も存在し，これが Tと塩基対を形成してしまう．B）KoolらによるA‒Tの互換塩基 対（Z‒F）．

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

サイクルに相当するPCRで増幅されたDNA中に97％以 上保持される人工塩基対ができ上がった⁽¹²⁾．

Romesbergらは，自己相補的で疎水的なPICS‒PICS 塩基対を最初に開発した⁽¹³⁾（図4B）．この塩基対は DNAポリメラーゼによってDNA中に取り込まれるも のの，その後の複製が進まないという問題を有してい た．そこで，彼らはこの人工塩基の構造を基にして，多 数の疎水的な人工塩基を網羅的に設計・合成して，複製 実験を精力的に行った．そのなかからよいものを見つけ 出し，その構造に基づいて，再度，網羅的に設計・合成 を行い，最終的に，複製で機能する5SICS‒MMO2や 5SICS‒NaM塩基対を開発した⁽¹⁴⁾（図4B）．最近では，

複製での選択性をさらに高めたTPT3‒NaM塩基対も報 告している⁽¹⁵⁾（図4B）．

Bennerらは，彼らが最初に合成したiG‒iC塩基対の 問題に対処するために，網羅的に水素結合性の人工塩基 対を設計・合成し，最終的に，複製で機能するP‒Z塩 基対（ここでのZ塩基は，KoolらのZ塩基とは異なる）

に到達した⁽¹⁶⁾（図4C）．P‒Z塩基対では，iG‒iC塩基対 の欠点であったケト・エノールの互変異性，さらには，

人工塩基ヌクレオシド誘導体の化学的安定性，ポリメ ラーゼとの相互作用などの問題が改善されている．

これら3つのグループでは，どれも初期の人工塩基対 を改良することにより，概念立証型研究を繰り返して，

最終的に複製で機能する人工塩基対を作り出している．

しかし，その過程では（図4），RomesbergらやBenner らが網羅的な合成と解析で一気に研究を進めているのに

対して，筆者らは，一つずつ問題を解決しながら人工塩 基対を設計・合成・試験する段階的な方法を取ってい る．これは，萌芽的な研究の重要性が日米で異なり，そ れに伴って研究の規模が違うことに起因しているかもし れない．

こうして，3つの研究チームから相次いで複製で機能 する人工塩基対が開発されると，次は，これらの人工塩 基対の性能の確認も兼ねて，応用研究がそれぞれの研究 チームで進められるようになった．

人工塩基対技術の応用（アプタマー，Cell-SELEX，

細胞への応用）

筆者らの応用の一つは，Ds‒Px塩基対を用いたDNA アプタマーの作成技術（SELEX法）の開発であった．

DNAアプタマーは，標的物質に特異的に結合するDNA 断片のことであり，SELEX法という試験管内進化の方 法で人工的に作成できるので，抗体に代わる診断・治療 薬として期待されている．SELEX法では，ランダム配 列を含むDNAライブラリのなかから標的物質に結合す るDNA断片を釣り上げる．こうして選別されたDNA 断片をPCRで増幅する．この選別とPCR増幅を繰り返 すことにより，最終的に標的物質に最も強く結合する DNAアプタマーを得る．しかし，4種類の天然型塩基 やその修飾体からなるDNAでは，標的物質（特にタン パク質）に強く結合するものはなかなか得られなかっ た．改良法の一つとして，塩基の種類を増やして，

DNAアプタマーの高機能化が図れないかということが 図4^■複製で機能する人工塩基対開発 A） 筆 者 ら に よ る 人 工 塩 基 対 開 発．B）

Romesbergらによる疎水性人工塩基対の開 発．C）Bennerらによる水素結合性人工塩 基対の開発．それぞれ，最初にデザインし た塩基対に改良を加えつつ独自の概念立証 型の研究を経て，複製で機能する人工塩基 対Ds‒Px, TPT3‒NaM, P‒Z塩 基 対 に 到 達 している．

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

言われていたが，SELEX法ではPCR増幅中に新たな塩 基がDNA中に保持されなければならず，複製で機能す る人工塩基対が開発されるまでは，その実現は不可能で あった．

筆者らは，Dsを第5の塩基として，DNAライブラリ のランダム配列中に導入し，これを用いて，標的タンパ ク質に結合するDNAアプタマーを作成するSELEX法 の開発に着手した（図5_A）．SELEX法におけるライブ ラリのPCR増幅は，DsとPx，ならびに4種類の天然型 塩基のそれぞれの基質を加えて行った．増幅された二本 鎖DNAから，Dsを含む側のDNA鎖を分離して，その 後の選別のライブラリにした．

本来，DNAは，親水的な物質であるので，標的とす るタンパク質の疎水性部分との親和性が低いために，

DNAアプタマーの標的タンパク質に対する結合能には 限界があった．そして，ほとんどのDNAアプタマーの 解離定数（ d）は，よくてもnM前後であった．そこ で，筆者らは，疎水性の高いDsをライブラリ中に導入 することにした．また，相補塩基であるPxはライブラ リに加えなかった．一般的に，DNAは塩基対を形成し て規則正しい二本鎖構造を取りやすい．しかしPx塩基 を加えないと，Ds塩基は塩基対を形成できないので，

ライブラリ中の各DNA断片の高次構造が多様化すると 期待された．

筆 者 ら は，最 初 に，ヒ ト 血 管 内 皮 増 殖 因 子165

（VEGF165）とインターフェロン

γ

（IFN

γ

）のそれぞれ を標的にして，人工塩基を用いたSELEX法を行った．

その結果，これまでに得られている天然型塩基のDNA

アプタマーよりも100倍以上結合力が向上した人工塩基 DNAアプタマーが得られた⁽¹⁷⁾．それらの解離定数は，

VEGF165に対しては1 pM程度，IFN

γ

に対しては38 pM であり，それぞれのDNAアプタマー中には2つあるい は3つのDs塩基が含まれていた．これらのアプタマー 中のDs塩基をAに置き換えると，結合力が極端に低下 したことから，僅かなDs塩基がDNAアプタマーの結 合能を大幅に高めていることがわかった．

Bennerらは，彼らのZ‒P塩基対を用いて，がん細胞 を標的にしてSELEX法を行った（細胞を標的とする SELEX法は，Cell-SELEX法と呼ばれている）（図5B）． 彼らは，ライブラリ中にZとPの両人工塩基を導入し た．この方法で，乳がん細胞，次いで，肝臓がんの細胞 に結合するZとPを含むDNAアプタマーが得られた⁽¹⁸⁾．

Romesbergらは，彼らの人工塩基対を細胞システム に応用した（図5C）．彼らは，TPT3‒NaM塩基対をプ ラスミドDNA中に導入し，これを大腸菌に形質転換 し，人工塩基基質を含む培地で，この大腸菌を培養し た．増殖した大腸菌中のプラスミドを調べたところ，24 世代後の大腸菌においても人工塩基対が86％保持され ていることがわかった．これは，6種類の塩基からなる DNAが生物の遺伝子になりうることを示した最初の報 告になった⁽¹⁹⁾．

おわりに

筆者らやBennerらのDNAアプタマーへの人工塩基 の応用研究から，塩基の数を増やすことの有用性が示さ

図5■人工塩基対技術の応用

A）筆者らのDs‒Px塩基対を用いた人工塩 基DNAアプタマー作成技術．B）Benner らのP‒Z塩基対を用いたCell-SELEXによ る 人 工 塩 基DNAア プ タ マ ー の 作 成．C）

RomesbergらのTPT3‒NaM塩基対を組み 込んだ細胞システム（大腸菌改変体）．

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

れ，また，Romesbergらの細胞の研究から，人工塩基 対の細胞工学への応用の可能性が一気に高まった．今後 は，細胞内のDNAやRNA転写物の特定部位に蛍光性 の人工塩基を導入することにより，1細胞レベルでの分 子イメージングが可能になるかもしれない．また，機能 性人工塩基を含む核酸触媒の開発や非天然型アミノ酸を 複数種類含むタンパク質の合成系などにも，応用研究が 広がるだろう．重要なことは，人工塩基対技術が安全な 遺伝子組換え技術を提供することである．Romesberg らの細胞実験が示すように，人工塩基の素材は培地から 導入するので，この供給が閉ざされれば，細胞内の DNAから人工塩基対がなくなるか，組換え生物が増殖 できなくなる．すなわち，人工塩基対により，組換え体 の封じ込めが可能になる．想像すればいろいろな応用が 考えられるが，今まさに，非天然素材を用いるバイオ研 究（Xenobiology）の扉が開かれつつある．

文献

  1)  A. Rich: “Horizons in biochemisty,” ed. by M. Kasha & B. 

Pullman, Academic Press, 1962, pp. 103‒126.

  2)  C. Switzer, S. E. Moroney & S. A. Benner: 

, 111, 8322 (1989).

  3)  J. A. Piccirilli, T. Krauch, S. E. Moroney & S. A. Benner: 

, 343, 33 (1990), see comment.

  4)  I. Hirao & M. Kimoto:  , 88, 345  (2012).

  5)  I.  Hirao,  M.  Kimoto  &  R.  Yamashige:  ,  45, 2055 (2012).

  6)  S. Doublie, S. Tabor, A. M. Long, C. C. Richardson & T. 

Ellenberger:  , 391, 251 (1998).

  7)  J.  C.  Morales  &  E.  T.  Kool:  , 5,  950  (1998).

  8)  T. Ohtsuki, M. Kimoto, M. Ishikawa, T. Mitsui, I. Hirao & 

S. Yokoyama:  , 98, 4922 (2001).

  9)  I.  Hirao,  T.  Ohtsuki,  T.  Fujiwara,  T.  Mitsui,  T.  Yoko- gawa,  T.  Okuni,  H.  Nakayama,  K.  Takio,  T.  Yabuki,  T. 

Kigawa  :  , 20, 177 (2002).

10)  I. Hirao, M. Kimoto, T. Mitsui, T. Fujiwara, R. Kawai, A. 

Sato,  Y.  Harada  &  S.  Yokoyama:  , 3,  729  (2006).

11)  M. Kimoto, R. Kawai, T. Mitsui, S. Yokoyama & I. Hirao: 

, 37, e14 (2009).

12)  R.  Yamashige,  M.  Kimoto,  Y.  Takezawa,  A.  Sato,  T. 

Mitsui, S. Yokoyama & I. Hirao:  , 40,  2793 (2012).

13)  D. L. McMinn, A. K. Ogawa, Y. Wu, J. Liu, P. G. Schultz 

& F. E. Romesberg:  , 121, 11585 (1999).

14)  D.  A.  Malyshev,  Y.  J.  Seo,  P.  Ordoukhanian  &  F.  E. 

Romesberg:  , 131, 14620 (2009).

15)  L.  Li,  M.  Degardin,  T.  Lavergne,  D.  A.  Malyshev,  K. 

Dhami,  P.  Ordoukhanian  &  F.  E.  Romesberg: 

, 136, 826 (2014).

16)  Z. Yang, F. Chen, J. B. Alvarado & S. A. Benner: 

, 133, 15105 (2011).

17)  M. Kimoto, R. Yamashige, K. Matsunaga, S. Yokoyama & 

I. Hirao:  , 31, 453 (2013).

18)  K. Sefah, Z. Yang, K. M. Bradley, S. Hoshika, E. Jimenez,  L.  Zhang,  G.  Zhu,  S.  Shanker,  F.  Yu,  D.  Turek  : 

, 111, 1449 (2014).

19)  D. A. Malyshev, K. Dhami, T. Lavergne, T. Chen, N. Dai,  J. M. Foster, I. R. Correa Jr. & F. E. Romesberg:  ,  509, 385 (2014).

プロフィール

平尾 一郎（Ichiro HIRAO）

＜略歴＞1976年沼津工業高等専門学校工 業化学科卒業／1983年東京工業大学理工 学研究科博士課程修了，理学博士／1984 年東京大学工学部工業化学科助手／1993 年東京薬科大学薬学部准教授／1995年イ ンディアナ大学アソシエイトサイエンティ スト／1997年科学技術振興事業団ERATO チームリーダー／2002年東京大学先端科 学技術センター特任教授／2006年理化学 研究所GSCチームリーダー／2007年タグ シクス・バイオ（株）代表取締役／2012年 理化学研究所CLSTチームリーダー／2015 年IBN研究所Team Leader and Principal  Research Scientist

木本 路子（Michiko KIMOTO）

＜略歴＞1997年東京大学理学部生物化学 科卒業／2002年同大学大学院理学系研究 科博士課程修了／同年理化学研究所リサー チアソシエイト／2006年同研究員／2013 年同上級研究員，タグシクス・バイオ（株）

共同研究員およびJSTさきがけ「分子技 術と新機能創出」研究者を兼務／2015年 IBN研究所Senior Research Scientist

Copyright © 2016 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.54.835

日本農芸化学会

● 化学 と 生物