イネのゲノム編集 ―その動向と展望 - J-Stage

ゲノム編集は標的遺伝子を狙って改変することができる技術 であり，新しい育種技術（New Plant Breeding Techniques）

の一つに分類される．ゲノム編集技術は，人工制限酵素と呼 ばれる，標的遺伝子を切断できるように人為的に設計したヌ クレアーゼの研究開発が近年急速に進展したことにより，さ まざまな生物種で広く利用されるようになった．図1に示す とおり，ゲノム編集技術は，標的変異（targeted mutagenesis）

と 標 的 組 換 え（gene targeting; GT） の2つ の 方 法 に 大 別 さ れ る．OECDの 報 告 書 で は，標 的 変 異 をSDN  (site-directed  nucleases)-1（報 告 書 で はZFN-1と 表 記），GTに よ っ て1〜 数塩基の小さい変異が導入されるものをSDN-2, 遺伝子発現 カセットなど大きな変異が導入されるものをSDN-3と分類し ている⁽¹⁾．本稿では，最も重要な穀物の一つであり，かつゲ ノム編集の論文が多数発表されているイネに焦点を絞り，ゲ ノム編集研究の現状と今後の見通しについて概説する．

標的変異 1. 人工制限酵素

標的変異は，人工制限酵素を用いて標的遺伝子にDNA 二重鎖切断（DNA double strand breaks; DSBs）を誘導 し，その修復過程で生じる誤り（ここでは，元の塩基配 列と異なる配列に修復されることを指す）を利用して標 的遺伝子に挿入や欠失などさまざまな変異を導入する技 術である⁽¹⁾（図

1

_）

_{．これまでに，}

_{人工制限酵素として，}

既存のメガヌクレアーゼを改変した改変型メガヌクレ

The Recent Trends and Prospects in Genome Editing of Rice: 

Precise Modification of Rice Genome

Hiroaki SAIKA, Seiichi TOKI, *¹ 農業・食品産業技術総合研究機 構生物機能利用研究部門遺伝子利用基盤研究領域先進作物ゲノム 改変ユニット，*² 横浜市立大学木原生物学研究所植物分子育種科 学部門

イネのゲノム編集 

―その動向と展望―

イネの遺伝子を狙いどおりに改変

雑賀啓明 * ¹ _{，土岐精一} * ^{1 , 2}

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

【解説】

図1^■ゲノム編集の種類

アーゼ，DNA結合ドメインとヌクレアーゼドメインを融 合したZFNsやTALENs，元来は細菌の免疫システムで あり，標的遺伝子を認識するRNA分子（guide RNA; 

gRNA）とDNA切断酵素（Cas9）の複合体であるCRIS- PR/Cas9などが報告されている⁽²⁾が，人工制限酵素ベク ターの構築の容易さ，および標的配列に対する切断活性 の高さなどから，TALENsやCRISPR/Cas9が広く利用 されている．一方，上記の人工制限酵素以外にも，PPR タンパク質⁽³⁾やArgonauteタンパク質⁽⁴⁾を利用した人工 制限酵素の開発が試みられており，今後の進展が期待さ れる．

2. イネにおけるCRISPR/Cas9を用いた標的変異 イネでは，アグロバクテリウムを利用した遺伝子導入 法が広く利用されている．すなわち，完熟種子や未熟胚 由来のカルスにアグロバクテリウムを感染させることで 外来遺伝子を導入し，形質転換に成功した細胞塊を抗生 物質などの薬剤を用いて選抜して，そこから植物体を再 分化させる方法である．標的変異においても，このス キームに従い，カルスに人工制限酵素発現ベクターを形 質転換し，変異が導入された細胞を含むカルス塊から植 物体へ再生させる．人工制限酵素によって標的変異が生 じるイベントと選抜マーカーの導入によって薬剤耐性が 付与されるイベントは独立した事象であるため，標的変 異に成功した細胞自身に薬剤耐性などの選抜形質が付与 される実験系でない限り，形質転換に成功した細胞すべ てに標的変異を導入できるわけではない^(5, 6)

．よって，

標的変異に成功した再分化個体を効率よく獲得するため には，より多くの標的変異細胞が含まれる形質転換カル ス塊を作出する必要がある．標的遺伝子や標的配列に

よっても異なるが，当室で開発したイネに最適化した CRISPR/Cas9ベクターを用いれば，10系統程度の独立 した形質転換カルスを準備することで，標的変異に成功 した個体を問題なく得ることができ，また，形質転換当 代の植物体で，標的遺伝子の両アリルに変異が導入され た系統を得ることも可能である^(5, 7, 8)

．これまでに，標

的遺伝子を破壊することにより，品質や収量，耐病性な どの農業形質を改変したイネが多数作出されている．

CRISPR/Cas9はgRNAを簡便にデザインすることが 可能であるため，非常に汎用性が高い人工制限酵素であ る．また，ほかの人工制限酵素とは異なり，複数の gRNAを同時に発現させることによって，複数の異なる 標的配列を切断することが可能であるため，一度のゲノ ム編集実験により，複数の標的遺伝子を改変した個体を 容易に作出することが可能である．複数のgRNAを同 時に発現させる一番単純な方法は，複数のgRNA発現 カセットをベクター上に用意することであるが，Golden  Gate cloning法やGibson assembly法など，ベクター構 築を容易にする方法が開発されている⁽⁹⁾

．また，複数の

gRNAを連結して発現させ，そのトリミングにtRNAの プロセシングシステムや自己切断機能をもつribozyme のシステムを応用し，一つの転写単位で複数のgRNA を生産できるようなベクター構築システムも開発されて いる⁽⁹⁾

．一方，gRNAは100 nt程度の短いRNA分子で

あることから，通常，U6のようなRNAポリメラーゼ III型の転写調節を利用して発現させる．それに対し，

gRNAとCas9を一つの転写単位として，RNAポリメ ラーゼII型のシステムを利用して発現させることで，イ ネの標的変異に成功したことが報告されている⁽¹⁰⁾

．こ

の方法では，gRNAの発現にも組織特異性をもたせるこ

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● 化学 と 生物 

近年，次世代型シークエンサーの開発によって，

生物の遺伝子情報を高速かつ安価に解読することが 可能になりました．また，人工知能等を用いた情報 の高度解析技術も急激に進歩しています．この2つの 技術を利用することで，生物がもつ遺伝子やタンパ ク質を最適化したり，新たに設計したりすることが 可能になりつつあります．本稿で紹介するゲノム編 集は，標的とした遺伝子に対して，計画的に変異を 導入することができる技術です．したがって，ゲノム 編集技術を用いることで，これまで蓄積された遺伝子 やタンパク質の情報に加え，人工知能等によってそ れら情報の解析から得られた予測をもとに，実際の

生物の遺伝子を自在に改変することが夢ではなく なってきました．現在，世界中でこのような最新の バイオテクノロジーを活用した研究開発が進められ ています．このような技術の目覚しい進歩により，

医療分野や工学分野，農業分野等の生物関連産業に 大きなパラダイムシフトをもたらしたといっても過 言ではありません．私たちのグループでは，農作物 に利用できるゲノム編集技術の開発を進めるととも に，それを利用した農作物の素材開発にも取り組ん でいます．私たちが開発を進めている技術によって，

消費者，あるいは生産者や加工業者等の実需者の希 望に応え，新たな性質をもった農作物をこれまで以 上に迅速に提供できるようになるものと期待してい ます．

コ ラ ム

とが可能になる．

Cas9によるDNA切断には，Cas9タンパク質自体が 標的配列近傍に存在するproto-spacer adjacent motif

（PAM）配列を認識することが必要である．よって，

PAM配列がCRISPR/Cas9による標的配列の自由度を 制限する主要因となっている．PAM配列は細菌の種類 によって異なることから，別の細菌に由来するCRIS- PR/Cas9を利用することで認識できる標的配列の幅を 広げることが可能である．これまでに，イネにおいてゲ ノム配列を切断できることが報告されているCRISPRシ ステムを表

1

に示した．特に，FnCpf1においては，Sp- Cas9やSaCas9とは異なり，PAM配列にグアニンが含 まれず，標的配列として利用できる選択肢が広くなった だけではなく，突出末端が形成されることからDNA断 片をDSBs部位に挿入する頻度を上げることができると 期待される．また，SpCas9においては，アミノ酸置換 によりPAM配列が改変された変異型タンパク質の作出 に成功しており，イネにおいても，従来とは異なる PAM配列（5′-NGA-3′，5′-NGCG-3′）を有する標的配列 に変異を導入できることが報告されている⁽¹³⁾

．このよ

うな研究が進むことによって，将来的にはPAM配列の 制限を受けない変異型Cas9タンパク質を開発すること ができると期待される．

3. off-target変異

人工制限酵素のうち，特にCRISPR/Cas9は，標的遺 伝子以外の相同性が高い配列を切断することがあり，標 的遺伝子以外の配列に意図しない変異（off-target変異）

が導入されることが報告されている．

Cas9タンパク質は，2つのDNA切断ドメインが二本 鎖DNAのそれぞれの鎖を切断することによりDSBsを 誘導する．Cas9のDNA切断ドメインのうち片方の活性 を欠失させることで，一方の鎖のみを切断し，ニック

（nick）を導入するnickaseとして機能させることが可能 である．そこで，Cas9 nickaseと隣接する2カ所の異な る鎖の配列を認識するgRNAを設計することにより，

DNA鎖の両側にニックを導入でき，結果的にDSBsを誘 導することができる．この方法では，Cas9 nickaseが2

カ所の塩基配列を認識することにより，標的部位の認識 特異性を上げることができる．イネにおいても，Cas9  nickaseの利用によりoff-target変異を抑えることができ ると報告されている⁽¹⁴⁾

．一方，Cas9タンパク質の立体

構造情報をもとに，DNA鎖との結合能力を改変した変 異タンパク質を作出することで，ヒト細胞においてoff- target変異を抑制したことが報告されている^(15, 16)

．現在

のところ，この方法については，植物への適用例は報告 されていない．

off-target変異は，人工制限酵素のDNA認識能の特異 性が低い場合や，DNA認識能の特異性が高い適切な人 工制限酵素でも大過剰量や長期間適用することにより生 じることが報告されている．そのため，人工制限酵素を 組織または時期特異的に機能させる方法も開発されてい る．たとえば，シロイヌナズナでは，組織特異的に人工 制限酵素を働かせて標的変異個体を獲得した例が報告さ れている⁽⁹⁾が，イネではまだそのような報告はない．一 方，off-target変異を逆に利用し，一つのgRNAを用い て複数の類似遺伝子を破壊することも可能であり，イネ で相同性が高い3個の遺伝子を同時に破壊することに成 功している⁽⁵⁾

．

なお，特にイネのような自殖可能な植物においては，

自殖や戻し交雑などにより，遺伝的背景を原系統に近づ けることが可能である．また，一般的に，ヒトの遺伝子 治療など標的遺伝子以外に変異が導入されることが許容 されない場合と異なり，農作物の育種においては生育な どの表現型に変化が生じていなければoff-target変異が 許容される可能性が考えられる．

4. 人工制限酵素遺伝子やタンパク質などの直接導入 上述のとおり，イネにおいては自殖または交配が容易 であるため，後代個体の中から標的遺伝子に変異が入っ ているが外来遺伝子を含まない個体（null segregant）を 得ることができる．一方，複数の植物において，物理的 導入法により人工制限酵素遺伝子のDNA, mRNAやタ ンパク質を細胞内に直接導入し，標的変異に成功した例 が報告されている．たとえば，PEG法を用いてタバコの プロトプラストにTALENsのmRNAやタンパク質を直

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表1^■イネで利用可能なCas9およびCpf1の比較

SpCas9 SaCas9^（11） FnCpf1^（12）

由来とする細菌

PAM配列 5′-NGG-3′ 5′-NNGRRT-3′ 5′-TTN-3′

DSBsの位置 PAMから3塩基目 PAMから3塩基目 PAMから18番目と23番目の塩基

DSBsの切断面 平滑末端 平滑末端 5′突出の粘着末端

Cas9タンパク質の大きさ 1368a.a. 1053a.a. 1307a.a.

接導入することで，標的変異に成功したことが報告され

ている^(17, 18)

．また，イネ，

コムギ，トウモロコシなどの

複数の植物種において，PEG法やパーティクルボンバー ドメント法により で形成したCas9タンパク質と gRNAとの複合体を細胞内に直接導入し，標的変異を誘 導できることも報告されている^(19〜21)

．

プロトプラストを用いる方法では，個々の細胞を独立 に扱うことが可能であるため，薬剤などによる形質転換 細胞の選抜を経ずとも，標的変異に成功した細胞や個体 を得ることが可能である．また，プロトプラストにDNA を導入する方法では，人工制限酵素遺伝子の一過的発現 により，植物ゲノム中に外来遺伝子を挿入せずに標的変 異を誘導することが可能である．さらに，人工制限酵素 のmRNAやタンパク質を細胞に直接導入する方法で は，導入に用いるmRNAやタンパク質の量を厳密に制御 できるため，DNAを導入した場合と比較して短期間で 効果的な量の人工制限酵素を機能させることが可能であ り，off-target変異の抑制にも有効である．一方，イネ のプロトプラスト形質転換法は培養期間が長く，熟練し た操作が必要であることから，ソマクローナル変異の軽 減と実験系の汎用化が課題である．

5. 標的変異による変異スペクトラムの改変

標的変異によって導入される変異は，DSBsの修復過 程において生じる誤りの結果である．DSBsの修復経路 は複数存在し，細胞が由来する組織や細胞周期，生じた 損傷の種類によって，DSBsの修復経路が異なる．現時 点では，DSBs修復の選択を人的に操作する実験系はな く，標的遺伝子に導入される変異のパターンも予測でき ないが，一般的には，人工制限酵素を用いてDSBsを導 入した場合，欠失や挿入は生じやすいが，塩基置換は生 じにくい．特にCRISPR/Cas9による標的変異では，1〜

数塩基程度の欠失や挿入が高頻度で生じる．したがっ て，標的変異では標的遺伝子を破壊することがほとんど であり，アミノ酸置換などによりタンパク質機能が改変 されることはまれである．植物の体細胞において，

DSBsの修復機構のうち最も主導的に機能するのは，切 断されたDNA末端をそのまま結合する非相同末端結合 経路（NHEJ）である．たとえば，この経路の最終酵素 であり，切断末端を結合する機能を有するDNA Li- gase4が欠損したイネ変異体では，野生型と比較して TALENsによる標的変異頻度が向上し，導入される欠 失長が長くなることが報告されている⁽⁶⁾

．また，標的遺

伝子に数塩基以上の欠失が生じていた場合，欠失配列の 両端に数塩基程度の短い相同配列（マイクロホモロ

ジー）が存在していることが多く，欠失にはマイクロホ モロジー介在末端結合経路が関与していることが示唆さ れている⁽⁶⁾

．したがって，このような経路を抑制または

活性化することで導入される変異のスペクトラムを改変 できるかもしれない．一方，人工制限酵素によって隣接 する2カ所にDSBsを誘導することにより，その間を欠 失させることが可能である．代謝系の酵素遺伝子には遺 伝子クラスターを形成しているものもあり，2カ所を切 断することによりそのようなクラスターを一度に欠失さ せることが可能である．これまでに，イネにおいて，

245 kbもの長鎖配列を欠失させることに成功したことが 報告されている⁽²²⁾

．

一方，イネにおいて，Cas9 nickaseとDNA修復経路 の一つである塩基除去修復経路の酵素シトシンデアミ ナーゼを融合した人工酵素を用いることにより，標的配 列のシトシンをチミンに変換し，目的の塩基置換を誘導 することに成功したことが複数のグループから報告され

た^(23〜25)

．現在のところ，この方法は標的変異によって

積極的に塩基置換を誘導する唯一の方法であるが，シト シンのみを改変することから，ほかの塩基を改変する技 術開発が望まれる．

標的組換え 1. GTとは

GT技術は，標的遺伝子を含む配列と相同な鋳型DNA を利用し，標的遺伝子と鋳型DNA間の相同組換え（ho- mologous recombination; HR）により，鋳型DNAが有 する変異を標的遺伝子にコピーする技術である（図1）

．

この技術では鋳型DNA上の変異がそのままコピーされ るため，標的変異とは異なり，目的どおりに標的遺伝子 を改変することが可能である．イネのGTは日本が初め て成功例を報告しており⁽²⁶⁾

，現在も世界を大きくリー

ドしている．筆者らは，これまでにGTによって除草剤 耐性イネ⁽²⁷⁾やアミノ酸高蓄積イネ⁽²⁸⁾などの育種素材と なりうる系統を作出することに成功している．一方，イ ネ以外の顕花植物においては，GTによって内在性遺伝 子を改変した報告は少なく，イネが最も進んでいると言 える．

2. GT細胞の選抜法

GTは，その選抜法により，標的遺伝子特異的選抜法 とポジティブ・ネガティブ選抜法の2種類に大別される．

前者はGTによって標的遺伝子に目的の変異を導入する ことで，改変された標的遺伝子自身が選抜マーカーにな

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りうる場合に利用できる．たとえば，除草剤の標的遺伝 子に対して，GTによって除草剤耐性型の変異を導入す ることで，除草剤耐性形質を指標にGTに成功した細胞 を直接獲得することが可能である⁽²⁷⁾

．しかしながら，

この方法は，選抜マーカーとなりうる遺伝子と変異の組 み合わせでなければ使用することはできない．それに対 し，後者は，形質転換に成功した細胞に薬剤耐性などを 付与するポジティブ選抜マーカー遺伝子と，鋳型DNAが ゲノムの目的外の部位に挿入された細胞の生育を抑制す るネガティブ選抜マーカーの2種類を利用する方法であ り，原理的にはあらゆる遺伝子に適用可能である（図

2

_）

_．

ポジティブ・ネガティブ選抜法によるGTの場合，ポジ ティブ選抜マーカー遺伝子は標的遺伝子内部またはその 近傍に挿入されるが，同時に相同配列上の変異も標的遺 伝子に導入することが可能である．そこで，ポジティブ・

ネガティブ選抜法によるGTとポジティブ選抜マーカー の除去を組み合わせることで，標的遺伝子に必要最小限 の変異だけを導入することが可能である（図

3

_）

_．これま

でに，イネにおいては，バクテリオファージのCre/

を用いたシステム⁽²⁹⁾

，

昆虫のトランスポゾン ⁽³⁰⁾ やDSBs修復の一つである単鎖アニーリング（SSA）を 利用したシステム⁽³¹⁾などが利用されている．Cre/ は，

さまざまな生物で広く使用されているマーカー除去シス テムであり，部位特異的組換え酵素Creが30 bp程度の P

配列を認識して，タンデムに重複した P配列の内部を 離脱させる．この方法では， P配列が宿主ゲノム中に 残存することから， P配列をイントロンや遺伝子間領 域にもたせるなどの工夫が必要となる．一方，

トランスポゾンにおいて，transposaseであるPBaseは，

トランスポゾン特異的逆位末端配列に囲まれた配列を，

宿主ゲノムに存在する「TTA A」の塩基配列に挿入，

離脱させる．よって，ポジティブ選抜マーカーの両側に トランスポゾン特異的逆位末端配列を配置しておき，宿 主ゲノム中の「TTA A」配列にポジティブ選抜マーカー を挿入することにより，PBaseを用いて余分な変異を残 さずにマーカーを除去することが可能である．また，

SSAを利用した方法では，ポジティブ選抜マーカーの両 側にタンデム重複配列と制限酵素の認識配列を配置する．

GT後に制限酵素によりDSBsを誘導し，生じた単鎖の重 複配列がアニーリングすることにより，重複配列内部を 脱離させることができ， と同様に余分な変異を 残さずにマーカーを除去することが可能である．この方 法は，原理的にはどのような配列でも応用可能であり，

より汎用性が高い方法であるが，DSBs部位で SSAを効率よく誘導する技術は確立されていないため，

その効率は に劣る．以上のように，標的遺伝 子特異的選抜法はSDN-2型の変異，ポジティブ・ネガ ティブ選抜法はSDN-2型，または3型の変異を導入する ことが可能である（図1）

．

3. GTの高効率化

一般的に，高等植物においては，GTの効率は標的変 異に比べてはるかに低く，通常の遺伝子導入の10⁻³〜 10⁻⁶の頻度でしか生じないことが報告されている⁽³²⁾

．

GTの効率は，①標的遺伝子の鋳型となる外来DNAの 効果的な供給，②外来DNAと標的遺伝子との効率的な HR，③GTに成功した細胞を取りこぼさずに選抜する ことの大きく3つの要因によって決定され⁽³³⁾

，それぞれ

の要因からGT効率を改善する研究が取り組まれてい る．なお，イネにおいては，高効率かつ汎用的な遺伝子 導入システムや形質転換細胞の選抜システムが開発され てきたため，一定の労力は必要となるが，大量の形質転 換細胞（およそ10 g程度のカルス）を準備すればGT細 胞を得ることは十分可能である．また，イネカルスは培 養中に盛んに細胞分裂を繰り返しているため，DSBsが 生じやすい条件にあると考えてられている．これらのこ とから，イネはほかの植物に比べて，GTが生じやす く，かつGT細胞をロスせずに獲得できるような条件の 最適化がなされてきた数少ない植物種であるといえる．

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図2■ポジティブ・ネガティブ選抜法を用いたGTのスキーム

図3^■GTとマーカー除去を利用した変異導入スキーム

3.1 鋳型DNAの供給

動物細胞や微生物では，物理的導入法によって外来 DNAを導入するため，鋳型DNAの細胞への供給効率 は高い．一方，上述のとおり，高等植物，特にイネにお いては，アグロバクテリウムを用いた遺伝子導入が主流 である．アグロバクテリウム法は，物理的導入法と比較 して，外来DNAが大きく再編成せずに宿主ゲノムに導 入されるメリットがあるが，その効率は高いとは言えな い．これまでに，高効率なイネのアグロバクテリウム形 質転換系を用いることで，GT細胞を効率的に獲得でき ることが報告されている⁽³⁴⁾

．また，われわれはアグロ

バクテリウム形質転換に高感受性を示すイネ品種を見い だしている⁽³⁵⁾ので，それをGTの材料として使用するこ とも興味深い．

核内に導入された外来DNAは，その一部がゲノムに 挿入されるが大部分が内在性のヌクレアーゼにより分解 されてしまう．すなわち，GTが成功するチャンスは，

外来核酸が核内に存在するわずかな期間しかない．これ を解決するために，鋳型となる外来DNAを一度ゲノム に挿入し，それを必要に応じて切り出してGTの鋳型と して使用する  GT法がシロイヌナズナで報告さ れた⁽³⁶⁾

．この方法では，必要なタイミングで鋳型DNA

を供給することができること，標的配列の切断と鋳型 DNAの供給を同調できること，対象とする植物細胞す べてに鋳型DNAが保持されていることなどのメリット がある．この方法のポイントはどのような方法で鋳型 DNAを効率よく切り出すか，GTに成功した細胞をど のように濃縮するかである．この方法が利用できれば，

煩雑な形質転換実験を省略することが可能であるため，

今後の汎用化が期待される技術である．また，タバコ，

トマトなどにおいては，核内で自己増殖するジェミニウ イルスベクターを用いることで，鋳型DNAを効率的に 供給し，GT頻度の向上に成功している^(37〜39)

．イネを宿

主とするジェミニウイルスベクターを利用すれば，同様 にGT頻度の改善は可能であると期待される．

3.2 HR効率

GT効率を最も決定づけるのはHR効率であると考え られている．HRはDSBs修復経路の一つであるため，

イネ，シロイヌナズナ，タバコ，トマト，ワタなどの植 物を含むさまざまな生物において，人工制限酵素による 標的遺伝子の切断によってGT効率が改善することが報 告されている．イネにおいても，人工制限酵素の利用に よって，また，人工制限酵素とDNA Ligase4の欠損を 組み合わせることによって，GTによる点変異導入の効 率化に成功している^(40, 41)

．人工制限酵素の利用が容易

になった現在，上記に加えてさまざまな植物においてGT の成功例が相次いで報告されるのではないかと予想され る．また，ニワトリにおいてはDNAの切断に加え，

exonucleaseによる切断されたDNAの削り込みやRecQ  helicaseによるDNAヘリックスの巻き戻しを誘導する ことで，GT効率が飛躍的に向上することが示されてい る⁽⁴²⁾

．イネにおいても，ORFの途中に変異が挿入され

ているため機能的ではない選抜マーカーをモデル標的遺 伝子として同様のGT実験を行い，DNAの切断と切断 末端のプロセシングを促進することにより，GT効率が 向上することが示されている⁽⁴³⁾

．今後は，これらの方

法が，SDN-3型のGTにも有効であるかを検証する必要 がある．

3.3 GT細胞の選抜

通常，GTでは，多数の非形質転換細胞やGTベクター がランダム挿入した細胞から，低頻度で生じたGT細胞を 効率的に選抜することが求められる．ポジティブ・ネガ ティブ選抜法を用いたGTにおいては，cell-autonomous に作用するネガティブ選抜システムがGT細胞の濃縮に 重要である．これまで，イネのGTにおいて，ネガティ ブ選抜マーカーとして汎用的に使われているのはジフテ リア毒をコードする 遺伝子である⁽⁴⁴⁾

．しかし，ジ

フテリア毒は細胞毒性が高いがゆえに，ゲノムに挿入さ れていない 遺伝子の一過的発現により，形質転換 細胞を過剰に死滅させていることが懸念される．そこで，

コンディショナルなネガティブ選抜マーカーとして毒性 の低い5-フルオロシトシンを毒性の高い5-フルオロウラ シルに代謝する 遺伝子を用いる方法⁽⁴⁵⁾

，ポジティ

ブ選抜マーカーである の働きをアンチセンス法に より抑制するanti-nptII法⁽⁴⁶⁾などが開発されている．

また，イネのアグロバクテリウム形質転換法において，

T-DNAのゲノムへの挿入にはNHEJが関与しているこ とが示唆されている⁽⁴⁷⁾

．NHEJを欠損させるまたは抑制

することにより，GTベクターのゲノムへのランダム挿 入が減少し，GT細胞を効率よく獲得できると期待され る．

ゲノム編集生物の規制

日本において，遺伝子組換え生物は，2004年2月に施 行された遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物 の多様性の確保に関する法律（通称カルタヘナ法）に従 い，規制される．一方，ゲノム編集によって作出した生 物（特にSDN-1）には，必ずしもカルタヘナ法で定める 遺伝子組換え生物等に該当しない可能性がある事例もあ

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ると考えられる．

これまでに，農林水産省⁽⁴⁸⁾や環境省⁽⁴⁹⁾の委員会にお いて，ゲノム編集生物に関する議論がなされており，研 究開発段階におけるカルタヘナ法などの規制対応を適正 に推進することや技術を利用する者に対して規制当局に 事前に相談をするように周知することなどが提言されて いる．また，全国大学等遺伝子研究支援施設連絡協議会 の声明⁽⁵⁰⁾や日本学術会議の報告書⁽⁵¹⁾においても，ゲノ ム編集技術を用いて作出した生物を適切に管理すること が必要であると提言している．しかしながら，日本にお いては，ゲノム編集によって作出された生物の規制につ いて，統一的な見解が出されていないのが現状である．

また，世界各国においても同様の議論がなされている が，国によってその対応が異なる⁽⁵²⁾

．ゲノム編集生物

の規制について，世界各国である程度調和がとれた方針 が定まらない限り，ゲノム編集生物の輸出入などは個別 の対応をとる必要があり，産業利用の一つの障壁になる のではないかと懸念される．

人工制限酵素の知的財産権

ゲノム編集のカギとなる人工制限酵素は欧米を中心と して開発されてきた経緯があり，ゲノム編集を用いて改 良した農作物を実用化する際にはその許諾が必要となる．

しかしながら，CRISPR/Cas9については，その知的財 産権を巡って裁判が行われているところであり，権利者 は明確になってはいない．CRISPR/Cas9の知的財産権 については，ブロード研とMIT，カリフォルニア大と ウィーン大，ヴィリニュス大など複数のグループから出 願されている状態であり，今後の動向が注目される⁽⁵³⁾

．

CRISPR/Cas9の農業分野への利用については，DuPont 社やMonsanto社が戦略的に実施許諾の権利を収集してい ることが公表されている．特に，DuPont社は，カリフォ ルニア大発のベンチャー企業であるカリブー・バイオサ イエンシス社やヴィリニュス大からCRISPR/Cas9の農業 分野への利用について排他的ライセンスの許諾を受けて いる．2016年4月には，アメリカ農務省からCRISPR/

Cas9を利用して開発したモチ性トウモロコシが規制対 象外であるという返答を受け，5年以内に米国内の農家 が優良なモチ性トウモロコシ品種を利用できるようにす ることを発表，また同年9月には，国際トウモロコシ・

コムギ改良センター（CIMMYT）とCRISPR/Cas9を用 いた品種育成の共同研究を実施することを発表するなど，

積極的な取り組みが進められている．一方，Monsanto 社はMITやブロード研究所からCRISPR/Cas9やCRIS-

PR/Cpf1に関する非排他的ライセンスの許諾を受けた．

今後もゲノム編集にかかわる新技術が発表されれば，大 手農薬・種苗メーカーは，権利の獲得に動くものと予想 される．このような状況を鑑みると，日本においてはク ロスライセンスを視野に入れた強みのある要素技術の開 発とその権利化を進めるとともに，日本独自のゲノム編 集技術を開発することが重要ではないかと思われる．

文献

  1)  OECD:  New  plant  breeding  techniques.  Stateof-the-art  and prospects for commercial development, ftp://s-jrcsv  qpx102p.jrc.es/pub/EURdoc/EURdoc/JRC65265̲RR.pdf. 

(2011)

  2)  H. Puchta & F. Fauser:  , 78, 727 (2014).

  3)  Y.  Yagi,  M.  Shirakawa  &  T.  Nakamura:  ,  (2015),  Sponsor feature.

  4)  B. Enghiad & H. Zhao:  , 6, 752 (2017).

  5)  M. Endo, M. Mikami & S. Toki:  , 56,  41 (2015).

  6)  A. Nishizawa-Yokoi, T. Cermak, T. Hoshino, K. Sugimoto,  H. Saika, A. Mori, K. Osakabe, M. Hamada, Y. Katayose,  C. Starker  :  , 170, 653 (2016).

  7)  M. Mikami, S. Toki & M. Endo:  , 34, 1807  (2015).

  8)  M. Mikami, S. Toki & M. Endo:  , 88, 561  (2015).

  9)  X. L. Ma, Q. L. Zhu, Y. L. Chen & Y. G. Liu:  , 9,  961 (2016).

10)  X. Tang, X. L. Zheng, Y. P. Qi, D. W. Zhang, Y. Cheng,  A. T. Tang, D. F. Voytas & Y. Zhang:  , 9, 1088  (2016).

11)  H. Kaya, M. Mikami, A. Endo, M. Endo & S. Toki: 

, 6, 26871 (2016).

12)  A. Endo, M. Masafumi, H. Kaya & S. Toki:  , 6,  38169 (2016).

13)  X. X. Hu, C. Wang, Y. P. Fu, Q. Liu, X. Z. Jiao & K. J. 

Wang:  , 9, 943 (2016).

14)  M. Mikami, S. Toki & M. Endo:  , 57,  1058 (2016).

15)  I. M. Slaymaker, L. Y. Gao, B. Zetsche, D. A. Scott, W. X. 

Yan & F. Zhang:  , 351, 84 (2016).

16)  B. P. Kleinstiver, V. Pattanayak, M. S. Prew, S. Q. Tsai,  N. T. Nguyen, Z. Zheng & J. K. Joung:  , 529, 490  (2016).

17)  S. Luo, J. Li, T. J. Stoddard, N. J. Baltes, Z. L. Demorest,  B. M. Clasen, A. Coffman, A. Retterath, L. Mathis, D. F. 

Voytas  :  , 8, 1425 (2015).

18)  T. J. Stoddard, B. M. Clasen, N. J. Baltes, Z. L. Demorest,  D.  F.  Voytas,  F.  Zhang  &  S.  Luo:  , 11,  e0154634 (2016).

19)  J. W. Woo, J. Kim, S. Il Kwon, C. Corvalan, S. W. Cho, H. 

Kim, S. G. Kim, S. T. Kim, S. Choe & J. S. Kim: 

, 33, 1162 (2015).

20)  S. Svitashev, C. Schwartz, B. Lenderts, J. K. Young & A. 

M. Cigan:  , 7, 13274 (2016).

21)  Z. Liang, K. L. Chen, T. D. Li, Y. Zhang, Y. P. Wang, Q. 

Zhao, J. X. Liu, H. W. Zhang, C. M. Liu, Y. D. Ran  :  , 8, 14261 (2017).

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

22)  H. Zhou, B. Liu, D. P. Weeks, M. H. Spalding & B. Yang: 

, 42, 10903 (2014).

23)  J. Li, Y. Sun, J. Du, Y. Zhao & L. Xia:  , 10, 526  (2017).

24)  Y. Lu & J. K. Zhu:  , 10, 523 (2017).

25)  Z. Shimatani, S. Kashojiya, M. Takayama, R. Terada, T. 

Arazoe,  H.  Ishii,  H.  Teramura,  T.  Yamamoto,  H.  Ko- matsu, K. Miura  :  , 35, 441 (2017).

26)  R. Terada, H. Urawa, Y. Inagaki, K. Tsugane & S. Iida: 

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27)  M. Endo, K. Osakabe, K. Ono, H. Handa, T. Shimizu & S. 

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28)  H. Saika, A. Oikawa, F. Matsuda, H. Onodera, K. Saito & 

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32)  S. Iida & R. Terada:  , 15, 132 (2004).

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35)  H. Saika & S. Toki:  , 29, 1351 (2010).

36)  F. Fauser, N. Roth, M. Pacher, G. Ilg, R. Sanchez-Fernan- dez, C. Biesgen & H. Puchta:  ,  109, 7535 (2012).

37)  N. J. Baltes, J. Gil-Humanes, T. Cermak, P. A. Atkins & 

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39)  N. M. Butler, N. J. Baltes, D. F. Voytas & D. S. Douches: 

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41)  Y.  W.  Sun,  X.  Zhang,  C.  Y.  Wu,  Y.  B.  He,  Y.  Z.  Ma,  H. 

Hou, X. P. Guo, W. M. Du, Y. D. Zhao & L. Q. Xia: 

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42)  K. Kikuchi, H. I. Abdel-Aziz, Y. Taniguchi, M. Yamazoe,  S. Takeda & K. Hirota:  , 284, 26360 (2009).

43)  土岐精一，武田俊一，廣田耕志，刑部敬史： 遺伝的に改

変された細胞を製造する方法 ，特許第5773403号．

44)  R. Terada, H. Asao & S. Iida:  , 22, 653 (2004).

45)  K. Osakabe, A. Nishizawa-Yokoi, N. Ohtsuki, Y. Osakabe 

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46)  A. Nishizawa-Yokoi, S. Nonaka, K. Osakabe, H. Saika & 

S. Toki:  , 169, 362 (2015).

47)  A. Nishizawa-Yokoi, S. Nonaka, H. Saika, Y. I. Kwon, K. 

Osakabe & S. Toki:  , 196, 1048 (2012).

48)  新たな育種技術研究会：ゲノム編集技術等の新たな育種

技術（NPBT）を用いた農作物の開発・実用化に向けて，

http://www.affrc.maff.go.jp/docs/commitee/nbt/pdf/

siryo3.pdf, 2015.

49)  中央環境審議会自然環境部会遺伝子組換え生物等専門委員 会：遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多 様性の確保に関する法律（カルタヘナ法）の施行状況の 検討について，http://www.env.go.jp/council/12nature/ 

y120-32/mat02.pdf, 2016.

50)  全国大学等遺伝子研究支援施設連絡協議会：ゲノム編集技 術を用いて作成した生物の取り扱いに関する声明・見解・

方 針，http://www1a.biglobe.ne.jp/iden-kyo/genome-  editing1.html, 2014.

51)  日本学術会議：植物における新育種技術（NPBT  :  New  Plant Breeding Techniques）の現状と課題，http://www. 

scj.go.jp/ja/info/kohyo/pdf/kohyo-22-h140826.pdf, 2014.

52)  農林水産技術会議事務局：NPBTを巡るGM規制等の動 向について，http://www.affrc.maff.go.jp/docs/anzenka/

attach/pdf/NPBT1-1.pdf, 2016.

53)  K. J. Egelie, G. D. Graff, S. P. Strand & B. Johansen: 

, 34, 1025 (2016).

プロフィール

雑賀 啓明（Hiroaki SAIKA）

＜略 歴＞2001年 東 京 大 学 農 学 部 卒 業／

2003年同大学大学院農学生命科学研究科 修士課程修了／2006年同大学大学院農学 生命科学研究科博士課程修了，農業生物資 源研究所任期付研究員／2011年同研究所 主任研究員／2016年農業・食品産業技術 総合研究機構主任研究員＜研究テーマと抱 負＞ゲノム編集技術の高度化とその応用＜

趣味＞スポーツ観戦，家族でオリエンテー リング

土岐 精一（Seiichi TOKI）

＜略歴＞1989年東北大学大学院農学研究 科博士課程修了／1990年北海道大学理学 部植物学科助手／1994年農業生物資源研 究所主任研究官／2006年同研究所ユニッ ト長／2016年農業・食品産業技術総合研 究機構ユニット長，2008年より横浜市立 大学木原生物学研究所客員教授＜研究テー マと抱負＞植物におけるゲノムの可塑性と 改変に関する研究＜趣味＞釣り，旅行，読 書

Copyright © 2017 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.55.676

日本農芸化学会

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