イネの形質転換効率向上方法の開発とその意義 - J-Stage

化学と生物 Vol. 50, No. 9, 2012 629

今日の話題

イネの形質転換効率向上方法の開発とその意義

イネ効率的相同組換え系の確立にむけて

植物における形質転換においては，現在アグロバクテ リウムを介した遺伝子導入法が一般的な方法として用い られている^（1）．近年，培養手法の改良により形質転換効 率が向上したイネのモデル品種の日本晴ではポストイネ ゲノムにおける遺伝子機能解析研究の材料として大規模 な遺伝子の機能を破壊させたT-DNAの挿入ライブラ リーやイネ FOX （Full-length cDNA over-expression） 

ライブラリーが作出され，多くの植物研究者により利用 されている．さらに特定の遺伝子の機能解析に相同組換 えによる遺伝子ノックアウト手法が植物においても可能 になってきた^（2）．このような大規模形質転換系が利用さ れている植物はイネ，アラビドプシスなどのモデル植物 だけである．基礎的な遺伝子機能解析研究などではモデ ル植物やモデル品種で十分ではあるが，実用化研究にお いてはコシヒカリなどの実用品種に汎用的に利用でき る，効率の高い形質転換技術が望まれている．

植物のアグロバクテリウムによる形質転換において最 も重要な点は活発に増殖している培養細胞の利用と共存 培養時のアグロバクテリウムの過増殖の抑制である．わ れわれはアグロバクテリウムの増殖抑制により形質転換 効率を高めた，新規形質転換法（ろ紙法）を開発してい る^（3）．このアグロバクテリウムの増殖抑制法は他の植物 の形質転換体の作成にも応用が可能である．一般に液体 振とう培養細胞は細胞塊が小さく増殖が活発なことから 大規模形質転換に最適と考えられていたが，イネではそ のような形質転換系が確立されていなかった．今回，イ ネ振とう培養細胞を用いて，ろ紙法で形質転換すること により，従来法より数十倍程度，形質転換効率を高める ことができることを見いだした^（4）．形質転換効率を向上 させていくことにより，どのようなことが可能となるか 紹介したい．

図1-Aに示したのが日本晴由来のカルスを従来の固体 培地を用いる形質転換方法^（2） により形質転換（ , 

β

- グルクロニダーゼ （GUS） 遺伝子の導入）した後，選抜 培地に移し，1週間目のカルスをGUS染色したものであ る．この方法ではカルス10 g（約1,000 〜2,000個のカル ス）あたり，約10³  の形質転換体を得ることが可能で あったが，その効率は安定していなかった．また日本晴

の1/10 〜 1/100程度の形質転換効率を示す実用品種は 多く，品種によっては形質転換イネをほとんど得られな いこともあった．また実用化研究で利用されているイネ 由来の変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子 （ ） や亜硝 酸還元酵素遺伝子 （ ）（コシヒカリ培養細胞にマー カー遺伝子として利用可能）の選抜効率は 遺伝子 などの抗生物質耐性マーカー遺伝子と比較し低く，形質 転換イネを再現性よく得ることは難しかった．筆者らも 実用化研究として，培養特性の低い北海道の実用品種 おぼろづき を用いイネ由来の1点変異型 遺伝子 を選抜マーカー遺伝子として形質転換体を作出したが，

約10 gのカルスから数個体の形質転換体しか得られな かった．

図1-Bに示したのが少量の液体培地をしみこませたろ 紙上でアグロバクテリウムとカルスの共存培養を行うろ 紙法で形質転換した後，選抜培地に移し，1週間目のカ ルスをGUS染色したものである^（3）．再現性よく，従来 法の約10倍程度の形質転換効率を示し，カルス10 gあ たり，約10⁴  の形質転換体を得ることが可能であった．

日本晴以外の多くの品種でも同様に形質転換効率は約 10倍向上した．この方法の開発により培養特性の低い コシヒカリ，おぼろづきなどの実用品種でも効率的に形 質転換イネを得ることが可能となった．また 遺伝 子， 遺伝子などの選抜効率の低いマーカー遺伝子を 用いても多数の形質転換イネを再現性よく得ることが可 能となった．

図1-Cはイネ液体振とう培養細胞をろ紙法により形質 転換した後，選抜培地に移し，1週間目のカルスをGUS 染色したものである^（4）．再現性よく従来法の約100倍程 度の形質転換効率を示し，カルス10 gあたり，約10⁵の 形質転換体を得ることが可能であった．これはすなわち 少量のカルスを用いてこれまでに比べ大量の形質転換体 が容易に得られることを意味している．たとえばイネで はnegative/positive選抜法を用いた相同組換えによる 遺伝子ノックアウト作出技術が開発されている^（2）．しか しこの方法で相同組換え体を得るためには約10⁵の形質 転換細胞を作出する必要があり，従来の形質転換法では 1個体の相同組換えイネを得るために約10,000個のカル

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ス（約50 g）をシャーレに並べてnegative/positive選 抜する必要があり，労力的な問題から普及していなかっ た．しかし液体培養細胞を用いた本形質転換法とnega- tive/positive選抜法を組み合せることにより，容易に相 同組換えによる遺伝子ノックアウトイネを作出すること が可能となった^（5）．その効率を調べたところ，1 gのカ ルスより約20個のnegative/positive選抜カルスが得ら れた．そして選抜カルスの約1.5%が相同組換えカルス だった．本遺伝子ノックアウト技法により，マウスなど と同様に高等植物のイネにおいても，遺伝子ノックアウ トの作出と遺伝子機能解析は一般的な手法として普及し ていくことが期待される．

実際にろ紙法による形質転換実験を行うにあたっての 注意点は，ろ紙に含ませる共存培地量の調整である．余 分な感染液の除去度合い，カルス量，培養室の湿度など によってろ紙中の培地量が変化するため，アグロバクテ リウムの増殖速度も変化してしまう．このためろ紙法の 利用にあたってはそれぞれの実験者が共存培地量を再検 討することが大切である．

今回筆者らは，汎用的に利用できる効率的な形質転換 技術を利用することにより，実用品種の低い形質転換効 率，選抜効率の低いマーカー遺伝子の利用，などの問題 を解決できることを示した．また，労力が必要で普及し なかった遺伝子ノックアウト手法も形質転換効率を向上 させることにより容易な手法となることを示した．今 後，さらに形質転換効率を向上させることにより，マー カー遺伝子を用いない形質転換法やアグロバクテリウム による一過的発現解析系などの新たな手法の開発が期待 される．

  1）  Y. Hiei, S. Ohta, T. Komari & T. Kumashiro : , 6,  271 （1994）.

  2）  R.  Terada,  Y.  H.  Johzuka,  M.  Saitoh,  H.  Asao  &  S. 

Iida : , 144, 846 （2007）.

  3）  K. Ozawa : , 176, 522 （2009）.

  4）  K. Ozawa & F. Takaiwa : , 179, 333 （2010）.

  5）  K.  Ozawa,  Y.  Wakasa,  Y.  Ogo,  K.  Matsuo,  H.  Kawa- higashi  &  F.  Takaiwa : , 53（4）,  755 

（2012）.

（小沢憲二郎，（独）農業生物資源研究所）

図1^■アグロバクテリウム法における共存培養条件によるイネ 形質転換効率の変化

形質転換（ ,  遺伝子を導入）処理後，選抜培地にカルス を移し，1週間後にGUS染色を行った．A ; 固体培地で前培養した カルスを固体培地上で3日間共存培養後，選抜培地へ移した．B ; 固体培地で前培養したカルスを少量の液体培地を含むろ紙上で3 日間共存培養後，選抜培地へ移した．C ; 液体培地で前培養したカ ルスを少量の培地を含むろ紙上で3日間共存培養後，選抜培地へ 移した．bar ; 2 mm