今日の話題 - J-Stage

530 化学と生物 Vol. 54, No. 8, 2016

酵母を用いたアルツハイマー病の病因研究

病気の原因となる毒性アミロイド（ A β ⁴² ）の生成抑制に成功

膜内切断プロテアーゼは，膜貫通タンパク質の膜内の 領域を切断し，ペプチド断片を膜から遊離させる．断片 は情報伝達分子として機能する一方で，さらに分解を受 けることからタンパクの代謝においても重要なメカニズ ムとなる．膜領域の切断機構は，RIP（Regulated In- tramembrane Proteolysis） と 略 称 さ れ，ア ル ツ ハ イ

マー病の発症メカニズムとの関連から詳しく研究され，

理解が進んできた．

アミロイド前駆体タンパク（APP）（図1_{A，中央）}

は，家族性アルツハイマー病患者の脳内に蓄積するアミ ロイド

β

ペプチド（A

β

）の前駆体である⁽¹⁾．APPは

β

セ クレターゼによって細胞外領域を切断され，生じた断片

図1^■アミロイドβ生成経路と酵母γセクレターゼ 発現系

A）アミロイド前駆体タンパク（APP）の分解経路．

I型膜タンパクであるAPPは，3種類（αβγ）のセク レターゼによる2つの経路によって分解され，その うちの1つの経路でアミロイド（Aβ）を生成する．

B）酵母γセクレターゼ発現系．ヒトγセクレターゼ の4サブユニット（プレセニリン，ニカストリン，

Aph1, Pen2）と，基質（APPもしくはNotch）に転 写因子Gal4を融合した人工基質を酵母に導入した．

基質の切断によるAβの生成と，膜から遊離した Gal4による ， ， 遺伝子（Aβ生成レ ポーター）の転写活性化を模式的に示した．

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

今日の話題

531

化学と生物 Vol. 54, No. 8, 2016

（C99）の膜貫通ドメインを，さらに，

γ

セクレターゼが 切断して，A

β

と細胞内ドメイン（AICD）が生成される

（図1A）．

家族性アルツハイマー病の研究から，プレセニリン

（PS1, PS2）の変異が疾病の原因であることが報告され たのは，1995年のことである．その後，プレセニリン が

γ

セクレターゼのサブユニットであること，そして，

プレセニリンの膜貫通領域には活性中心のアスパラギン 酸（2つ）が存在するとの発見⁽²⁾は，当初驚きをもって 受け入れられた．現在では，

γ

セクレターゼ，シグナル ペプチドペプチダーゼ，site-2プロテアーゼ，ロンボイ ドからなる 膜内切断プロテアーゼファミリー の存在 が確認されている．これらはチャンネル状の立体構造を とり， 常識 では考えられなかった「疎水環境（膜内 領域）の加水分解」についても，理解が進んできてい る．

膜内切断プロテアーゼの中でも

γ

セクレターゼは4  つのサブユニットからなり（図1B），生化学的に研究  す る の は 難 し い．複 合 体 を 界 面 活 性 剤（た と え ば，

CHAPSOなど）で可溶化し，精製した

γ

セクレターゼと 基質ペプチド（C99Flagなど）を反応させることがすぐ に頭に浮かぶ．しかし，

γ

セクレターゼの活性は，界面 活性剤や脂質によって大きく影響を受けるために⁽³⁾，精 製酵素の特異性が生体内での本来のものとは異なってし まう．

私たちは，出芽酵母（ ）をい

わば 生きた試験管 として，ヒト

γ

セクレターゼを発 現させ（図1B）研究を進めてきた^(4〜8)．

γ

セクレターゼ は，触媒サブユニットであるプレセニリン以外に3つの 膜タンパク（ニカストリン，Aph1, Pen2）が一分子ず つ集合した，全分子量が23万を超える巨大な膜タンパ ク複合体である⁽¹⁾．これら4つのサブユニットを酵母に

図2■酵母γセクレターゼ発現系を用いた解析

A）酵母発現系を使った活性化変異体の同定．酵母の生育を指標に，家族性アルツハイマー病変異体の活性を回復させる2次変異を同定し た．プレートはG384Aに対する2次変異の生育結果．B）PS1/PS2遺伝子破壊MEF（マウス胚性繊維芽細胞）細胞にPS1変異体を導入し て解析したところ，2次変異体ではAβ42の生成量が落ちていることがわかった（ ＜0.01 （**）, もしくは ＜0.05 （*））．C）同定した変異体 のうち，G384Aの活性を回復した2種類の変異の位置をプレセニリンの予測構造（PDB No. 4HYG）内に示した．触媒中心を細胞質側から 見ている．中央で向かい合う2つのアスパラギン酸（球状モデル）が活性残基である．さらに，2次変異の箇所（S438, I287; L432, C158）， FAD変異部位（G384）を示した．基質の通り道として予想されている第9膜貫通領域に重要な変異（S438P or L432M）が位置し，プレセ ニリンが活性化されると考えている．文献8を改変．

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

今日の話題

532 化学と生物 Vol. 54, No. 8, 2016

導入し，

γ

セクレターゼを細胞内に再構成した（図1B）． 次に，基質となるAPPまたはNotchを導入し，

γ

セクレ ターゼ活性を解析した．転写因子Gal4を融合した基質 を用いると，

γ

セクレターゼによる切断に伴い，転写因 子Gal4pが膜から遊離し，レポーター遺伝子（ , 

,  など）の発現を誘導する．ヒスチジンとア デニンのない条件での生育に必要なタンパク質と，

β

ガ ラクトシダーゼ（LacZ）が誘導され，生育と酵素活性 測定によって

γ

セクレターゼ活性を評価することができ た⁽⁴⁾（図1B）．

さらに，酵母のミクロソーム膜画分を用いてAPPの 分解を解析するとヒトの脳内と同じく，A

β

40, A

β

42,  A

β

43のアミロイドA

β

分子種（数字はアミノ酸残基数）

の生成が確認できた⁽⁵⁾（図1B）．

酵母を用いる利点は，①酵母には対応するホモログ分 子がないので，導入した

γ

セクレターゼ以外はAPPを切 断できない，②タンパク質の高発現が期待でき，強力な 遺伝学的手法によって小胞輸送をはじめ細胞内のAPP やアミロイドタンパク質の細胞内の動態を容易に研究で きる，の2つに要約できる．

本研究では，家族性アルツハイマー病（FAD）で見 つかっているプレセニリン（PS1）変異を解析した⁽⁸⁾． PS1のG384AとL166P（384番 目 の グ リ シ ン が ア ラ ニ ン，もしくは166番目のロイシンがプロリンに置換し た）変異体は，ヒト細胞を用いた解析で切断活性が落ち ることが知られているが，酵母でも変異により機能がな くなった（図2_{A）．変異した}

γ

セクレターゼは切断活性 が落ち，同時に，毒性の高いA

β

42やA

β

43を生成する ようになり，これが病気の原因となると考えられてい る．

さて，遺伝的な解析が簡単にできる酵母の特徴を生か して，PS1変異体の活性を回復させる2次変異（抑圧変 異）を探索した．PCR（error-prone法）によりランダ ムに変異を導入し，生育を指標に10⁶個の酵母をスク リーニングしたところ，5種類（16個）の2次変異が FAD変異体の活性を回復させた（図2A）．また，2次変 異を単独でもつPS1について活性を解析したところ，野 生型と比べて最大で2倍に活性が上昇しており，活性化 変異とも言えることが明らかとなった．

マウス細胞中で，これらの変異の活性を解析したとこ ろ，酵母と同じように活性を上げただけでなく，アルツ ハイマー病で蓄積するA

β

42の生成を抑制した（図2B）．

これらの結果を理解していただくために，

γ

セクレ ターゼの活性について，もう少し説明を加えたい．

γ

セ クレターゼは，APPを切断して生じた長いA

β

（A

β

48 もしくはA

β

49）をトリミングして，A

β

46, A

β

45, A

β

43,  A

β

42, A

β

40, A

β

38, A

β

37のように，3残基（もしくは4 残基）ごとに短く分解する切断機構をもっている⁽⁹⁾．家 族性アルツハイマー病変異体では，このトリミングの活 性が落ち，長いままのA

β

がたまると考えられる．本研 究で明らかにした2次変異はトリミング活性を上昇させ て，A

β

42やA

β

43の生成を抑えていたのである．

A

β

42の生成を減少させる効果をもつ化合物は

γ

セクレ ターゼモジュレーター（GSM）と呼ばれ，認知症治療 薬を目指して，世界中で研究されている⁽¹⁰⁾．私たちの 成果は，見つかった重要な変異の位置情報（第9膜貫通 領域のS438PやL432M（図2C））が有用なのはもちろ  んのこと，酵母発現系がモジュレーターの開発にも有  効であることを示している．本研究はアルツハイマー  病治療薬の開発を支援する重要な成果をもたらしたもの として，2015年11月11日付けで，

（オンライン版）に掲載された．

研究の遂行にあたってたいへんお世話になった東京大 学大学院薬学研究科の富田泰輔教授，同総合文化研究科 の石浦章一教授，東北大学大学院農学研究科の五味勝也 教授，原田昌彦准教授，新谷尚弘准教授，東京大学と東 北大学の研究室メンバーの方々に深謝いたします．

  1)  B. De Strooper, T. Iwatsubo & M. S. Wolfe: 

, 2, a006304 (2012).

  2)  M. S. Wolfe, W. Xia, B. L. Ostaszewski, T. S. Diehl, W. T. 

Kimberly & D. J. Selkoe:  , 398, 513 (1999).

  3)  P. C. Fraering, W. Ye, J. M. Strub, G. Dolios, M. J. LaVoie,  B. L. Ostaszewski, A. Van Dorsselaer, R. Wang, D. J. Sel- koe & M. S. Wolfe:  , 43, 9774 (2004).

  4)  E.  Futai,  S.  Yagishita  &  S.  Ishiura:  , 19,  13013 (2009).

  5)  S.  Yagishita,  E.  Futai  &  S.  Ishiura: 

, 377, 141 (2008).

  6)  Y. Yonemura, E. Futai, S. Yagishita, S. Suo, T. Tomita, T. 

Iwatsubo & S. Ishiura:  , 286, 44569 (2011).

  7)  T.  Onodera,  E.  Futai,  E.  Kan,  N.  Abe,  T.  Uchida,  Y. 

Kamio & J. Kaneko:  , 157, 301 (2015).

  8)  E. Futai, S. Osawa, T. Cai, T. Fujisawa, S. Ishiura & T. 

Tomita:  , 291, 435 (2016).

  9)  M. Takami, Y. Nagashima, Y. Sano, S. Ishihara, M. Mori- shima-Kawashima, S. Funamoto & Y. Ihara:  ,  29, 13042 (2009).

10)  T. Tomita:  , 156, 195 (2014).

（二井勇人，東北大学大学院農学研究科）

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

今日の話題

533

化学と生物 Vol. 54, No. 8, 2016 プロフィール

二井 勇人（Eugene FUTAI）

＜略歴＞1996年東京大学農学部農芸化学 科卒業／2001年同大学大学院農学生命科 学研究科応用生命工学専攻博士課程修了／

同年同大学分子生物学研究所研究員／2002 年カリフォルニア大学バークレー校研究 員／2006年東京大学大学院総合文化研究 科助教／2010年東北大学農学研究科准教 授，現在に至る＜研究テーマと抱負＞膜内 切断プロテアーゼと小胞輸送の解析＜趣 味＞野鳥観察＜所属研究室ホームページ＞

http://www.agri.tohoku.ac.jp/enzyme- futai/HOME.html

Copyright © 2016 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.54.530

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

今日の話題