受賞者講演要旨 《農芸化学技術賞》 15

受賞者講演要旨 《農芸化学技術賞》 15

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図3 乳酸菌のpDCによる取り込みの違い

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ウイルス感染防御機能を持つ Lactococcus lactis  JCM5805の発見と

事業応用

① ② ③ ④

キリン株式会社  基盤技術研究所  藤 原 大 介 ① 小岩井乳業株式会社  技術開発センター  城 内 健 太 ② キリン株式会社  酒類技術研究所  杉 村   哲 ③ キリン株式会社  基盤技術研究所  藤 井 敏 雄 ④

【背景】

 季節性インフルエンザなどの従来のリスクに加えて，新興感 染症の拡大などウイルスに関連したリスクは飛躍的に増大しつ つある．また，健常人においても高度情報化社会のもたらす多種 多様なストレスにより，免疫力の低下が問題となっている．

 乳酸菌に関しては古くから免疫について多くの研究が行われ ており，マクロファージやミエロイド樹状細胞(mDC)を介した 自然免疫活性化機能が明らかとなっていた．一方，近年ウイルス 感染防御機能を司る制御細胞としてプラズマサイトイド樹状細 胞(pDC)が見つかり，大きな注目を集めている．pDCはヒト末梢 血単核球の1%にも満たないマイナーなサブセットであるが，ウ イルス核酸を認識するTLR7/9を細胞内に強発現しており，大 量のtype Iインターフェロン産生を介した感染初期応答を担 い，さらにウイルス抗原特異的な獲得免疫の誘発による感染後 期応答まで制御する，いわばウイルス感染防御の中核を担う免 疫細胞である．

【pDC活性化乳酸菌の探索】

 上記のようなpDCの重要性から，それを活性化するような乳 酸菌が仮に見つかれば，実効性の高いウイルス感染リスク低減 技術になりうると考えた（図1）．

 

 マウス骨髄細胞からFlt-3Lによりin vitroで誘導したpDC培養 系を用い，公的菌株バンクから収集した31菌種からなる計125株 の乳酸菌株を添加し，pDC活性化指標であるIFN-αの定量を 行った．その結果，殆どの乳酸菌株添加でIFN-αは検出されな かったが，3株において100pg/mlを上回る量が検出された．極め て興味深いことにこれら3株はLactococcus lactis subsp. lactisに

分類されるものであった．このうち最も安定な反応を示す

L.lactis JCM5805を選抜し，その後の解析を行った．

【JCM5805の作用機構の解明】

 まずin vitro pDC培養系を用いて作用機構の解析を行った．対 照乳酸菌としてLactobacillus rhamnosus  ATCC53103を用いて 解析を行ったところ，JCM5805はIFN-αに加えてIFN-β，IFN-λと いったウイルス感染防御に関わるサイトカインを特異的に誘導 することが分かった（図2）

 

 また，この反応は生菌・死菌いずれの場合でも等しく観察され た ．さ ら に 必 須 シ グ ナ ル の 探 索 の 結 果 ，J C M 5 8 0 5 は TLR9/MyD88を介したpDC活性化を誘導することが示された．

TLR9はエンドソームに発現する内在性レセプターであり，

pDCにJCM5805が貪食され，菌体中のDNAが溶出することが 必須と考えられたため，蛍光染色したJCM5805を用いた蛍光顕 微鏡観察を行った．その結果，図3に示すように対照乳酸菌株は pDC外部を取り囲むように分布し，細胞内部に取り込まれない のに対して，JCM5805はpDCの内部に取り込まれ，DNAが TLR9を介した活性化を起こすことが作用機構であることが示 唆された．

図2  乳酸菌株のpDCへの添加によるIFNs産生誘導量比較

図1  pDC活性化乳酸菌の研究戦略 ^{JCM5805 対照乳酸菌株}

乳酸菌 pDC

IFN-α IFN-β IFN-λ

16 《農芸化学技術賞》 受賞者講演要旨

HLA-DR

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【JCM5805の動物感染モデルにおける効果】

 マウス経口摂取時の効果について，パラインフルエンザウイ ルス感染モデルを用いて検討した．マウスをJCM5805摂取・非 摂取の2群に分け，試験食投与2週間後に致死量のウイルスを感 染させた．その結果，感染から10日以内に非摂取群の全個体が 死亡したのに対し，摂取群では約7割が生存するという著効が 観察された（図4）．このとき非摂取群のマウスの肺では顕著な 好 中 球 の 浸 潤 が 認 め ら れ 気 道 の 閉 塞 が 起 こ っ て い た が ， JCM5805摂取群では浸潤の大幅な低下が起こっていた．さらな る解析の結果，腸管から取り込まれたJCM5805は腸管pDC活性 化を介して全身の抗ウイルス機能を高めていることが示唆さ れた．

 

【JCM5805のヒトにおける効果】

 動物モデルで著効を認めたため，JCM5805で製造したヨーグ ルト飲料(1000億cfu/本)を用いてヒトにおける効果の検証を 行った．

 2011年夏季に行った試験では被験者38名を無作為に19名ずつ 2グループに分け，一日100mlの試験飲料を4週間飲用させた．試 験開始時，終了時にそれぞれ採血を行い，末梢血単核球中のpDC 活性化度を評価したところ，試験終了時にJCM5805群のpDC活 性がプラセボ群より有意に高くなった(図5)．

 さらにヒトにおける風邪・インフルエンザ様症状に対する効 果の検証のため，2013年冬季に試験を行った．被験者213名を2グ ループに分け，10週間ヨーグルト飲料を飲用させ，医師による診 断及び自覚症状を調査した結果，風邪・インフルエンザ様症状で ある咳，熱っぽさの項目がプラセボ群と比してJCM5805群で有 意な低下を示した(図6)．さらにPBMCを不活化ヒトインフルエ ンザウイルスで刺激した際の抗ウイルス因子・ISG15の発現量 がJCM5805群でプラセボ群より有意に高くなった．

 さらに，工業的により広範な加工が可能な死菌粉末について も同様なヒトにおける有効性評価を行い，ポジティブな結果が 得られている．

【まとめ】

 このように我々は加工特性や安全性・コスト面に優れ，現実的 な有用性を持つ乳酸菌を題材に，ヒトの抗ウイルス免疫を司る pDCに着目し，ごく限られた株に活性化作用があることを発見 した．さらにJCM5805を題材にin vitro実験・動物実験・ヒト試験 を通して，その効果と作用機構について検証を行った．

 さらにヨーグルト製品を開発し，加工特性を生かした死菌粉 末の製造ラインを立ち上げ，清涼飲料製品及びサプリメントを 開発した．

 現在，JCM5805のpDC活性化における分子生物学的観点から のメカニズム解明や，腸管感染性ウイルスに対する効果，寿命や 加齢形質に与える効果など多岐に渡る応用研究を推進してい る．

【謝辞】

 本研究成果はキリングループ各社の多くの関係者の尽力に よるものであり，研究・商品開発・マーケティング・製造・販売に 関わった皆様に感謝いたします．また，研究コンセプトから開 発研究までご助言・ご指導を賜りました先生方に厚く御礼申し 上げます．

図4 マウスパラインフルエンザウイルス感染モデルにおける JCM5805経口投与の効果

図5 JCM5805含有食品摂取のヒトpDC活性における効果

図6 風邪・インフルエンザ様自覚症状に対するJCM5805 含有食品摂取の効果

自覚症状（咳） 自覚症状（熱っぽさ）

累積発症者数（人） 累積発症者数（人）

ウイルス感染後日数

生存率（%）

JCM5805 プラセボ

# ; 両グループ間 p<0.05

** ; 開始時に比して p<0.01

開始時 終了後