味幹細胞の同定と培養
味幹細胞の探索から新規味蕾オルガノイドの作製まで
内胚葉由来である味細胞は消化管の上皮細胞と同様に 細胞死と再生を繰り返す細胞である．近年，消化管にお ける幹細胞研究は近年飛躍的に進んだが，味幹細胞につ いては不明な部分が多かった．しかし，2013年に味幹 細胞・前駆細胞が同定されたことに端を発し，2014年 にはオルガノイド培養系にて味幹細胞も消化管幹細胞と 同様に培養できることが証明された．さらに同培養系を 用いて単一の味幹細胞がさまざまな細胞に分化すること が示された．このことで，これまで困難であった味細胞 を用いた種々の呈味物質のスクリーニングや味細胞分化 のメカニズム解析などへの応用が期待されている．本稿 では，消化管および味細胞研究の最近の進展と今後の展 望を示したい．
消化管とは口腔内から肛門までの食物の通り道を指す．
消化管の上皮細胞は内胚葉由来であるが，口腔内の粘膜 や歯は外胚葉由来であるため，舌上皮も外胚葉由来と混 同されやすい．しかし，最近の系統追跡実験などから舌 上皮に存在する味蕾やその構成細胞である味細胞は同じ 内胚葉由来であるとわかってきた．これは生物が進化の 過程において舌や味細胞を獲得した経緯を考えると納得 できる．イソギンチャクやクラゲに代表される太古の時 代に繁栄していた生物の消化管は単純な管であった．し かし，長い進化の過程でより安全に効率良く栄養を摂取
する必要に迫られた生物が，複雑な消化管を発達させそ の最前線に味蕾を配置したと推定できる．実際，消化管 には味細胞様細胞である内分泌細胞が存在し，甘味刺激 を受けGLP-1やGIPなどのホルモンを分泌し，摂食後の インスリン放出に積極的にかかわっていることが報告さ れている(1)．
一般的に味細胞は口腔内の舌上皮に埋まっている味蕾 の中の細胞を指すが，口蓋や咽頭など舌以外にも存在す ることが知られている．口腔内に存在する味蕾は，タマ ネギのような形をしており，100〜150個の味細胞を内包 する．この味細胞を介して伝えられる感覚が味覚であり，
うま味，甘味，苦味，酸味，塩味の5つに分けられ，5 基本味と呼ばれている．それぞれの味は特定の味覚受容 体を発現する5種類の味細胞によって感知され，味蕾の 基底部に存在する神経を介して味情報が中枢（脳）まで 伝えられる．味細胞は形態学的にI型，II型，III型，IV 型に分けられるが(2)（図1左），この形態学的分類はそ れぞれの型の味細胞が発現する選択的なマーカーとほぼ 一致する．現在，II型細胞はGタンパク質共役型の味覚 受容体を発現し，うま味，甘味，苦味を受容する細胞，
III型細胞は酸味を受容する細胞であることがわかって いる．I型味細胞は最も解析が遅れている細胞であり，
味覚受容にどのようにかかわる細胞であるかはいまだ解 明されていない．IV型味細胞は，味蕾の基底部近くに
図1■味蕾の構造とBrdU標識による細胞分裂する細胞の追跡実験
左：味蕾の中には形態学的に分類されたI，II，III，IV型の4種類の味細胞が存在する．ほかの3種類の味細胞が紡錘形であるのに対し，
IV型細胞は基底部にあり不定形である．このIV型細胞が味幹細胞あるいは前駆細胞と考えられていた．右：BrdUをマウスに投与し，そ れぞれ1日目，3日目，10日目に有郭乳頭切片を作製し，BrdUを取り込んだ細胞の移動部位を特定した．1日目に上皮の基底部に存在して いたBrdU陽性細胞は，時間の経過とともに味蕾内外に移動し，10日目にはわずかな細胞しか味蕾内に留まらないが，味蕾内部に存在する BrdU陽性細胞は味細胞に分化する．最初にBrdU標識される細胞が存在する場所（つまり基底部）が幹細胞あるいは前駆細胞の存在する 場所と推測できる．点線の部分が味蕾．
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存在する細胞で，味幹細胞あるいは味前駆細胞であると 考えられている．5基本味のうち，塩味受容細胞につい ては受容体全容が明らかにされていないため確定的でな い．
味細胞研究における最大の問題点は，培養細胞がない ということであった．これまでに味細胞の培養系を確立 したといういくつかの報告が存在するが，幹細胞が存在 しすべての味細胞系列への分化が明確に観察できる培養 系の報告はない．
生体内で分裂が盛んな場所に存在する細胞は，放射性 同位元素（トリチウム）でラベルされたチミジンやチミ ジンのアナログであるBrdU（臭化デオキシウリジン）
などにより標識されるため，オートラジオグラフィーや 免疫染色により確認できる．こうして消化管基底部の幹 細胞が多く存在するクリプト（陰窩）には，標識陽性細 胞が多数存在し，時間の経過とともに絨毛の先端に向 かって移動することがわかっていた．同様に味蕾につい ても，その基底部に増殖能が高い細胞が存在することが わかっていた．筆者らもBrdUによる標識実験を行い分 裂の盛んな細胞の運命を追った．すると，味蕾の基底部 に存在する多くの細胞はBrdU投与後1時間以内に標識 され，それらの細胞はしだいに頂端側（apical側）に移 動し10日後にはBrdU陽性細胞がほぼ消失するが（図1 右），ごく一部のBrdU陽性細胞だけが味蕾内にとどま り，10日後には分化した味細胞となることがわかった．
すなわち，味蕾基底部に存在したBrdU陽性細胞の中に 味細胞になる幹細胞または前駆細胞が存在するもののそ の数は少ないことが推察された．よって，味蕾の幹細胞 とそのほかの舌上皮に分化する運命である細胞との区別 は不可能であるという結論に達した．
そこで，味蕾基底部に幹細胞が存在すると仮説を立て，
味蕾基底部にのみ発現し，そのほかの舌上皮の基底部に は存在しないマーカーを泥臭い方法で探した．まず，味 蕾を含む領域と味蕾を含まない舌上皮とを分け，サブト ラクション法やDNAマイクロアレイ法により前者の cDNAライブラリーの中で味蕾の基底部にしか発現しな いマーカーの探索を始めた．すると，注目していた味蕾 基底部にはWntリガンドやWntシグナルの下流に存在 する転写因子であるLef1（図2A），Wntの阻害因子な どのWnt-
β
カテニンシグナル関連分子が選択的に発現し ていることがわかった．これらは初期発生や幹細胞の維 持に重要な役割を果たす分子であり，味幹細胞が味蕾基底部に存在することが初めて示唆された．
幹細胞が存在すると想定していた味蕾基底部におい て，Wnt-
β
カテニンシグナル関連分子が発現しているこ とがわかったが，実際にそれらのシグナルが伝達されて いるか，そのシグナルが何らかの機能と関連しているか は未知な領域であった．そこで筆者らは，Wnt-β
カテニ ンシグナルがオンになっている細胞だけにβ
-ガラクトシ ダーゼが発現するTopgalマウス(3)およびWnt-β
カテニ ンシグナル経路の分子が欠失したノックアウトマウス（Lef1-KO, Wnt10b-KO）を導入し，味蕾周辺における Wnt-
β
カテニンシグナル活性とその機能を調べた．その 結果，胎児期では将来味蕾が形成される土台である味乳 頭の発生時にWnt-β
カテニンシグナルがオンになり，生 後も味蕾周辺や味蕾内にWnt-β
カテニンシグナルが入る のを確認した（図2B）．また，同シグナルが伝わらない と味乳頭の形成不全が起こることが明らかとなり，味乳 頭の形成にWnt-β
カテニンシグナルが必須であることが 判明した(4)．時期を同じくして，ほかのグループからも 別の方法で味乳頭発生時におけるWnt-β
カテニンシグナ ルの重要性が報告された(5)．当然，成体の味幹細胞の機 能維持にWnt-β
カテニンシグナルが重要であることは予 想されたが，味細胞の培養系はおろか，内胚葉の幹細胞 培養系すらない時代であり，それを証明する手段がな かった．ここで味細胞の先祖である消化管の幹細胞の話をさせ ていただく．消化管の幹細胞は分裂が盛んな細胞が存在 図2■Wnt-βカテニンシグナルは味細胞の発生部位や再生部位 に選択的に活性化される
A：Wnt-βカテニンシグナルの下流に存在する転写因子Lef1の味 蕾基底部における発現．Lef1（矢印）をはじめ，Wnt関連分子の 多くは成体マウスの味蕾の基底部に選択的に発現する．点線の部 分が味蕾．B：妊娠12日目マウス舌上皮におけるWnt-βカテニン シグナルの可視化．上はコントロールマウス（Wt），下がTopgal マウス．X-gal染色によりTopgalマウス舌の味乳頭発生部位（矢 印）には強いWnt活性があることがわかる．
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するクリプトに存在することは長いことわかっていた．
2002年に大腸がんや消化管幹細胞を研究していたClev- ersらのグループはWnt-
β
カテニンシグナルの下流分子 としてLgr5（Leucine-rich repeat-containing G protein- coupled receptor 5）が存在することを報告した(6)．同 グループはその後Lgr5がクリプトに発現することを Lgr5‒LacZおよび 5‒ ‒ ‒ 2ノック インマウスにより示した．また，後者を 26‒Creレポーターマウスと掛け合わせたうえ，タモキシ フェン投与による系譜追跡実験を行いLgr5陽性細胞は すべての上皮細胞に分化すること，Lgr5陽性細胞自体 はその場にとどまることを示した(7)．これらの実験か ら，Lgr5陽性細胞が小腸と大腸において幹細胞のマー カーになると結論づけられた．消化管幹細胞のマーカー は不確かであったので，Lgr5の発見により消化管の幹 細胞研究が飛躍的に進んだのはいうまでもなく，これが 消化管幹細胞研究の新たな幕開けとなった．
しかしながら，ここでもう一つ消化管研究者には超え なければならないハードルが存在した．消化管上皮細胞 に代表される内胚葉の細胞を培養することは困難である という事実である．それゆえ，これまで研究者たちはが ん細胞由来の株化細胞などを使って各上皮細胞の機能解 析を試みてきた．しかし，これら株化細胞はがん細胞で あるために生体内の細胞の本来の機能のごく一部しか反 映することができないという問題があり，正常な生体内 の組織内にある細胞と同様の挙動を示す細胞が求められ ていた．
ついに2009年，これまで待ち望まれていた幹細胞の3 次元培養系を佐藤らが確立した(8)．同培養方法は，細胞
外マトリックスであるマトリゲルの中にクリプトを入れ，
Wntア ゴ ニ スト のR-Spondin，上 皮 増 殖 因 子 で あ る EGF，そして骨形成タンパク質（BMP）の阻害因子で あるNogginなどを添加し培養し増殖を繰り返すクリプ トを得るものであり，オルガノイド培養法と呼ばれてい る．特筆すべきは，同培養法の確立により，幹細胞の培 養が可能になっただけではなく，幹細胞からさまざまな 細胞が再生・分化する様子を において観察でき る点である．
現在までにオルガノイド培養できる組織として胃，小 腸，大腸などの消化管が報告されているほか(9)，肝臓，膵 臓などもオルガノイド培養できると報告されている(10, 11)
（図3）．
話を味細胞へ戻すが，上述の消化管幹細胞の特定とオ ルガノイド培養法の確立はわれわれ味細胞研究者を興奮 させた．なぜなら，味幹細胞（つまり味細胞の幹細胞）
は消化管と同様にWntの下流であるLgr5陽性細胞であ ることが推測されたからだ．当然のように，味幹細胞の 探索はLgr5陽性細胞の探索から始まった(12)．まず，
Lgr5陽性細胞は有郭乳頭のトレンチ部分（下部溝）と 味蕾基底部に存在することが明らかにされた．つづい て，Lgr5陽性マーカーの系譜追跡により，Lgr5陽性細 胞が味蕾内のI型，II型，III型すべての味細胞に分化し うることがわかった．加えて，トレンチ部分に存在して いた細胞が時間経過とともに味蕾内の細胞に移動するこ とが確認された．このように，消化管の幹細胞とほぼ同 様に味蕾周辺のLgr5陽性細胞が幹細胞である可能性が 高くなった．
そこで筆者らは早速，味幹細胞の培養，すなわち 味 図3■消化管オルガノイドと味蕾オルガノ イド
左：消化管と味蕾はどちらも内胚葉由来であ り，同じような培養条件でオルガノイドが形 成される．右：2週間培養した味蕾オルガノ イドをα-gustducin抗体（赤）およびCA4抗 体（緑）で染色したもの．前者はII型味細胞 に，後者はIII型味細胞に発現する分子であ るが，味蕾オルガノイドでも再現性よくこれ らの分子が発現する．bar: 100 μm
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蕾オルガノイド の培養に着手した．まず，味蕾周辺の Lgr5‒GFPあるいはLgr6‒GFP陽性細胞よりオルガノイ ドの作製を試みたところ，たった一つのGFP陽性細胞 より味蕾オルガノイドの形成が観察され，さらにすべて の味細胞系列に分化する多分化能を併せ持っていること を証明することができた（図3）．興味深いことに，分 化した細胞は甘味物質や苦味物質にも反応するというこ とが明らかになった．つまり，味幹細胞を出発点とした 味蕾オルガノイドの培養にて，味細胞の分化マーカーの 発現だけでなく，機能する味細胞を作製することが証明 できたのである(13)．
最近では，味蕾オルガノイドを用いた細胞周期の研究 により，味蕾周辺の幹細胞にはいくつか種類があることが わかってきている(14)．どの幹細胞が味細胞に最終的に 分化する幹細胞なのか，味細胞以外に変化する場合はど のような性質の細胞に分化するのかなどは今後の課題で ある．Lgr5‒GFPマウスからGFPシグナルの強弱によ り細胞を分取し，1細胞でのトランスクリプトーム解析 も今後必要になるだろう．
味蕾オルガノイドを利用する場面は，今後，産官学問 わず増えてくるであろう．というのも同培養系は，味覚 受容や味細胞再生のメカニズム研究から，食品中の新規 呈味物質や機能分子のスクリーニングまで幅広く用いる ことができる数少ない 培養系であるからであ る．味蕾オルガノイドは の幹細胞培養系という 点ではiPS細胞やES細胞と似ているが，multipotentで あってもpluripotentではない．おそらく，味蕾オルガ ノイドは最初に存在していた味蕾の幹細胞の性質をその まま引き継いでおり，分化系列を決める転写因子などを 変化させない限り味蕾オルガノイドが胃や大腸の細胞に 分化することはないだろう．そうであれば，味蕾オルガ ノイドは再生医療の安全なソースとしても魅力的であ る．味細胞は常に再生を繰り返す細胞である．毛髪や皮 膚が高齢化に伴い再生能力が落ちるのと同様に，味細胞 も年齢とともに再生スピードが遅くなり脱落する運命に あり，結果として味覚感度の低下を招くのではとわれわ れは考えている．高齢化社会を迎えつつある日本におい て，生活の質（QOL）を維持・向上させることは喫緊 の問題であり，いつまでも美味しく味わえる舌を維持す るための味蕾オルガノイドに熱い視線が注がれる日がく るかもしれない．そのため，われわれは霊長類からの味 蕾オルガノイド作製にも挑戦しているところである．
味幹細胞を追い求めて十数年になるが，ようやく味幹 細胞が同定でき，多くの研究者が待ち望んだ培養方法も 獲得できた．今後，味蕾オルガノイドから効率良く味細 胞にするためのさまざまな条件が明らかになり，特定の 味細胞へ分化誘導する方法も確立されるだろう．われわ れの研究が，味蕾オルガノイドを活用した新たな美味し さの提案や，食品の開発につながればと願っている．
謝辞：本文中の絵は中川織衣氏に描いてもらった．この場をお借りして 御礼申し上げます．
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（岩槻 健*1，Wenwen Ren*2，Peihua Jiang*2，粟飯 原永太郎*3，*1 東京農業大学応用生物科学部食品安全 健康学科，*2 モネル化学感覚センター，*3 シンシナ ティー大学）
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プロフィール
岩 槻 健（Ken IWATSUKI）
＜略歴＞1994年名古屋大学農学部農芸化 学科卒業／1999年東京大学大学院農学生 命科学研究科博士課程修了／東京都臨床医 学総合研究所研究員／米国マウント・サイ ナイ医科大学インストラクター／味の素
（株）イノベーション研究所課長，現在に至 る＜研究テーマと抱負＞味蕾オルガノイド と消化管オルガノイドを用いた幹細胞の制 御機構と分化メカニズムの解析．米国留学 時代にWnt関連分子が味細胞の発生と再 生にかかわると発見したことが，自分の研 究人生の転機となった．現在は，味蕾や消 化管上皮細胞が幹細胞からどのように分化 するのかに興味をもっている＜趣味＞ゴル フ，釣り，キャンプ，お茶，お香，お花，
チーズ Wenwen Ren
＜略 歴＞Ph.D. from Fudan University in 2011, master degree from Shanghai Uni- versity in 2007, bachelor degree from Shandong Agriculture University in 2004.
She is now a postdoctoral fellow working in the Jiang laboratory.＜研究テーマと抱 負＞Dr. Ren is interested in the biology of taste stem cells. Her work attempts to understand the molecular mechanism un- derlying taste stem cell renewal and dif- ferentiation.＜趣 味＞Dr. Ren enjoys hik- ing.
Peihua Jiang
＜略 歴＞Received his doctoral degree from the University of Pittsburgh in 2001, bachelor degree from Nankai University in 1992, master degree from Chinese Academy of Sciences in 1995. Postdoctor- al training at Pitt and then at Mount Si- nai, then joined Redpoint Bio as a senior scientist. Dr. Jiang moved back to the ac- ademia in 2009 and set up his laboratory at Monell in 2012.＜研究テーマと抱負＞
Dr. Jiang has a broad interest in the biol- ogy of taste. More recently, his laboratory is set to determine how nutrients re- shape taste and gut tissues. In essence, he tries to understand whether you are what you eat.＜趣 味＞Dr. Jiang enjoys doing yard work when he is free from re- search.
粟飯原 永太郎（Eitaro AIHARA）
＜略歴＞2003年京都薬科大学薬学部薬学 科卒業／2008年同大学大学院薬学研究科 博士課程修了／2008年シンシナティ大学 医学部ポスドク／2011年同研究員/2015年 同講師，現在に至る＜研究テーマと抱負＞
上部消化管の粘膜防御機構および傷害修復 機構の研究．主に2光子共焦点顕微鏡を用 いた動物組織のライブイメージングで，現 象を可視化できることを目標にしている
＜趣味＞ゴルフ
Copyright © 2016 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.54.543
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