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第 38 回（平成 22 年度）研究奨励金受領者研究報告
出芽酵母におけるリボソーム構成因子の生合成機構の解明
東京農業大学応用生物科学部アイソトープセンター 笠原浩司
【研究の背景】
リボソームは 4種類のリボソーム RNA（rRNA）と約80 種類のリボソームタンパク質（RP）からなる巨大複合体で あり，その生合成は 3種類のRNAポリメラーゼ（Pol I, Pol II, Pol III）の協調的な活性と，膨大な資源やエネルギーを 必要とし，細胞の成長や分裂を始め様々な生物機能に密接 に関与することから，その制御は細胞にとって極めて重要 である．特に，RP をコードする 138個の RP 遺伝子（以下 RPG: RP Gene）群においては，その転写量が増殖時には Pol II によって転写される全mRNA の 50％にも上る一方，
栄養の枯渇やストレスに応じて Pol I や Pol III による rRNA 転写と協調して速やかに抑制されるなど，厳密かつ 複雑な制御の存在が知られており，その解明は分子生物学 における重要な課題である（文献1）．
【これまでの研究経過】
申請者が基本転写因子 TFIID の結合タンパク質として 同定した Hmo1 は，ChIP-chip 法，及び ChIP 法による詳 細な解析から，35S rRNA 遺伝子，及び約70％の RPG プ ロモーターに特異的に結合することが明らかになっている
（文献2）．申請者は Hmo1 の RPG プロモーターにおける 機能解析を行う過程で，HMO1遺伝子破壊により，その 標的である RPG の転写開始点（以下 TSS; Transcription start site）が上流側にシフトするという興味深い現象を見 出し（文献3），その原因を探る中で，Hmo1 が（申請者が）
IVR（Intervening region）と名付けたヌクレオソーム結合 量が少ない領域に結合すること，HMO1 の欠失により IVR 内部に非特異的な転写開始前複合体（以下 PIC; pre- initiation complex）が形成され，それに伴って新たな TSS が生じることを明らかにした（文献4）．これらを基に申請 者は，Hmo1 が下流に結合したヌクレオソームと協調的 に，PIC が形成可能な領域を狭い範囲（コアプロモーター 内）に限定することで，生理的に正しい位置からの転写を 促進するという従来にない新しい概念の転写制御機構を提 唱するに至った（文献4, 及び図1）．
【本研究の経過報告】
本研究では，先に見出した Hmo1 による RPG プロモー ターにおける PIC 形成の位置決定の制御機構をより詳細 に解明するために，そのような機構に関わる因子を網羅的 に同定することを目指し，遺伝学的な探索を行った．
Hmo1 の主要な標的遺伝子の 1 つである RPS5 プロモー ターは，HMO1 の欠失により本来の転写開始点（ATG よ り－36 bp 上流）からの転写が減少し，本来 Hmo1 の結合 によって転写開始が抑制されている IVR 内に強い転写開 始点（同－215 bp）が生じることが明らかとなっている（図 2）．そこで RPS5 の開始コドンを欠失させ，替わりに本 来の転写開始点（－36 bp）の上流（－156 bp）に，新たな 開始コドンを挿入した改変型プロモーターを，出芽酵母の HIS3遺伝子の ORF に，フレームが合うように接続した レポーター遺伝子をプラスミド上に構築した（図2）．この プラスミドを持つ酵母株は，通常 His3 タンパク質が作ら れず，ヒスチジン欠損培地で生育不能であるが，HMO1 遺伝子破壊株では－215 bp の位置から転写された mRNA を鋳型にして ATG（－156）から機能を持った His3 タンパ
図1 リボソームタンパク質遺伝子プロモーターにおける Hmo1 の機能
— —10 ク質の翻訳が起こり，同培地での生育が可能となった．
スクリーニングでは，酵母野生株に対し変異源 EMS
（2％）処理を行った後に，このレポータープラスミドを形 質転換し，ヒスチジン欠損培地に塗布し，生育してきたコ ロニーを選択した．His3 タンパク質阻害剤である 3-AT
（0.2 mM）を含む同培地にて擬陽性のコロニーを除いた後，
残りの変異株を野生株と掛け合わせて四分子解析を行い，
His+の形質が 2 : 2 で分離したものを候補として，酵母ゲ ノムライブラリーを用いて原因遺伝子の同定を行った．そ の結果，いくつかの変異株については HMO1遺伝子に変 異が入っていることが確認された．他には，転写関連因子 ではなく，翻訳関連因子の変異が複数同定されたが，これ らの株ではおそらく開始コドンの認識に異常が起こり，欠 失させた本来の開始コドン付近の ATG 類似配列から機能 を持った His3 タンパク質が作られてしまったと推測され る．これらの変異は生育の高温度感受性を伴っているため，
以後はこれを指標に判別・除去することが可能である．現 在，残りの株についてライブラリースクリーニングや，全 ゲノムシークエンス解析などの手法により，原因となる変 異の同定を継続して行っている．
一方， 同様の改変型 RPS5 プロモーターを酵母の URA3 遺伝子につないだレポータープラスミドを別途作成した．
URA3遺伝子産物は，ウラシルの生合成に必須であると同 時に，5-FOA という薬剤を細胞内で毒に変換するため，
このレポータープラスミドを持つ HMO1欠損株は，Ura3 を発現し，5-FOA を含む培地で生育不能となる．この株 に対して，HMO1遺伝子破壊株から作成したマルチコ ピ ー ラ イ ブ ラ リ ー や， ヒ ト 培 養 細 胞（HeLa 細 胞 ） の
cDNA を酵母で発現誘導可能なライブラリー（構築済）を 形質転換し，5-FOA 含有培地にて生育可能なコロニーを 選択することにより，Hmo1 と同様の，あるいは重複した 機能を持つ因子の探索が可能であり，現在これらのスク リーニングを実施している最中である．
【今後の予定】
上記のスクリーニングで取得された因子，及びその変異 株については今後，ノーザン法やプライマー伸長法，
ChIP 法など多角的な手法を駆使することにより，RPS5 やその他の RPG プロモーターへの結合や，遺伝子破壊に よる RPG の転写量，及び転写開始点の変化，Hmo1 や PIC，ヌクレオソームの結合量や位置の変化を調べ，それ らが目的とする因子であるかを検討していく予定である．
これらの解析によって，申請者の見出した新しい転写開始 点決定機構の分子基盤の解明が進むと期待できる．
謝 辞
最後に，本研究を行うにあたり，ご援助を頂きました農 芸化学研究奨励会に深く感謝いたします．
参考文献
1） Warner, J. R. Trends Biochem. Sci., 24, 437–440 （1999）
2） Kasahara, K., Ohtsuki, K., Ki, S.W., Aoyama, K., Taka- hashi, H., Kobayashi, T., Shirahige, K., & Kokubo, T. Mol Cell Biol, 27, 6686–6705 （2007）
3） Kasahara, K., Ki, S.W., Aoyama, K., Takahashi, H., &
Kokubo, T. Nucleic Acids Res, 36, 1343–1357 （2008）
4） Kasahara, K., Ohyama, Y., & Kokubo, T. Nucleic Acids Res, 39, 4136–4150 （2011）
病原体レセプター抵抗性タンパク質による耐病性の制御機 構の解明
奈良先端科学技術大学院大学 河野洋治
抵抗性タンパク質は，病原体の侵入を感知する細胞内レ セプターとして働き，過敏感細胞死や酸化的バーストを伴 う植物の中で最も強い免疫応答を誘導する．抵抗性タンパ
ク質は農業上重要であり，新潟県のほぼ全域では抵抗性遺 伝子を導入したコシヒカリが食用として栽培され，耐病性 が増したことにより，コメ収量の増加に貢献している．現 在までに，主に遺伝学的手法を用いて，抵抗性タンパク質 による免疫に関与する分子の同定が試みられ，シャペロン タンパク質 Hsp90, コシャペロンタンパク質 RAR1, SGT1 などが報告されている．これらの分子は，抵抗性タンパク 質の安定性の制御が主な機能であり，シグナル伝達機構や 図2
