83예의 반일치 조혈모세포이식 후 생착 성공하였으며 재발하지 않았고 급성 이식편대숙주병 및 만성 이식편대숙주병이 발생하지 않고 분석 시점까 지 생존한 상태였던 23예의 이식 후 시기별 림프구아군의 면역 재구성을 분 석하였다(Figure 2).
83명 대상 환자 전체 결과와 같이 이식 이후 림프구의 비율 자체는 점 차 증가하기 때문에 무사건 환자군에서 림프구아군의 절대 세포수가 증가하 는 경향을 조금 더 뚜렷하게 볼 수 있었다.
γδ T 세포가 정상 공여자의 절대 세포수만큼 증가하는데 최소 90일이 소요되었다. 환자의 림프구에서 γδ T 세포가 차지하는 높은 비율이 정상 공 여자의 참고치만큼 감소하여 회복되는데 1년 이상이 소요되는 것으로 보였 다. T 세포, αβ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포도 절대세포수 와 림프구아군에서 차지하는 비율 모두 정상 공여자의 참고치까지 최소 1년 이상 소요되는 것으로 관찰되었다. 그러나 NK 세포에서 절대 세포수는 14 일-30일 이내에 빠르게 회복되었다(Table 10~12).
25 (A) T cell
(C) γδ T cell
(D) CD4+ T cell
(E) CD8+ T cell (B) αβ T cell
26
Figure 4. Serial changes of absolute counts and percentage of lymphocyte subpopulations in 23 patients without events after haplo-HSCT. Absolute counts were calculated by multiplying the frequency of each individual cell subset by WBC count. (A) T cell (B) αβ T cell (C) γδ T cell (D) CD4+ T cell (E) CD8+ T cell (F) NK cell (G) B cell (H) WBC count (I) αβ T cell (blue box) and γδ T cell (red box) proportions in T cell. Green area is reference range (1st-3rd quartile) of each cell population, respectively.
(F) NK cell
(G) B cell
(H) WBC count (I) αβ and γδ T cell % in T cell
27
Table 10. Median absolute counts of each cellular component in 23 patients without events
Days after trans-
plantation
Number of cells (/uL) (1st-3rd quartile)
T cell αβ T cell γδ T cell CD4+ T cell CD8+ T cell NK cell B cell
14 20
(4-65)
2 (1-9)
18 (4-60)
1 (0-3)
2 (1-5)
172 (25-354)
2 (0-4)
30 111
(55-216)
19 (5-94)
61 (23-123)
3 (1-12)
12 (3-59)
302 (91-611)
0 (0-2)
60 155
(25-242)
49 (6-147)
59 (14-117)
8 (2-20)
35 (3-144)
331 (51-642)
0 (0-12)
90 217
(86-326)
107 (28-174)
91 (32-114)
10 (7-34)
88 (20-143)
181 (92-513)
0 (0-2)
180 118
(42-363)
70 (12-239)
51 (21-94)
32 (7-91)
36 (4-179)
221 (28-466)
1 (0-39)
365 634
(227-1,198)
433 (169-900)
86 (56-247)
161 (59-414)
277 (111-443)
224 (140-952)
83 (31-256)
≥365 1,675 (550-1,718)
1,170 (473-1,423)
245 (114-541)
327 (134-791)
595 (398-703)
741 (295-1,401)
130 (34-286) Absolute counts were calculated by multiplying the frequency of each individual cell subset by lymphocyte count.
28
Table 11. Median proportion of each cellular component in 23 patients without events
Days after trans-plantation
Proportion of cells (%) (1st-3rd quartile)
T cell αβ
T cell
γδ T cell
CD4+
T cell
CD8+
T cell NK cell B
cell
14 8.89
(4.23-21.01)
0.92 (0.24-2.21)
5.75 (2.27-13.94)
0.34 (0.08-0.75)
0.72 (0.22-1.32)
39.98 (33.54-46.91)
0.62 (0.33-1.57) 30 20.79
(10.84-31.37)
4.61 (0.72-17.99)
7.66 (4.42-14.78)
0.76 (0.17-2.31)
2.94 (0.82-13.49)
49.52 (33.95-56.86)
0.13 (0.00-0.30) 60 15.52
(7.90-23.06)
5.94 (1.39-14.68)
5.73 (3.57-16.48)
0.78 (0.25-2.65)
3.45 (1.65-13.29)
45.39 (25.79-59.27)
0.04 (0.01-1.28) 90 26.44
(14.97-43.41)
11.50 (2.40-24.75)
11.32 (4.25-16.10)
1.64 (0.97-4.68)
9.23 (2.59-21.47)
28.52 (21.18-49.09)
0.05 (0.00-0.27) 180 25.52
(13.04-63.26)
18.75 (8.61-41.73)
4.56 (4.05-15.02)
8.62 (4.28-17.05)
10.51 (2.08-24.25)
34.66 (28.52-44.43)
0.19 (0.08-4.47) 365 40.21
(27.37-49.91)
34.67 (18.14-40.27)
6.82 (4.66-10.91)
12.37 (6.81-15.98)
16.09 (11.72-21.94)
23.84 (16.52-37.11)
6.68 (2.17-11.38)
≥365 46.42 (45.59-59.65)
38.51 (33.34-51.33)
7.71 (6.89-14.61)
14.51 (10.25-21.40)
18.99 (16.81-36.13)
20.05 (16.90-37.86)
7.74 (1.97-14.06)
* Proportions were calculated in lymphocyte population.
29
Table 12. Median proportion of αβ T cell and γδ T cell in 23 patients
Days after transplantation
Proportion of cells (%) (1st-3rd quartile) αβ T cell γδ T cell
14 10.48( 5.62-33.22) 84.48(61.28-91.40) 30 28.91( 7.94-68.97) 70.67(29.66-87.21) 60 41.16(19.83-66.43) 52.77(32.04-72.17) 90 52.13(28.57-70.07) 46.33(26.99-67.92) 180 61.68(45.92-87.71) 38.00(11.89-52.40) 365 80.11(60.72-89.96) 19.42( 9.37-39.07)
≥365 84.99(68.11-86.05) 14.61(12.93-31.48) Proportions were calculated in lymphocyte population.
30 고찰
조혈모세포이식이 필요한 환자에서 HLA가 완전히 일치하는 공여자를 구하는 것이 쉽지 않다. 그에 대한 대안으로 반일치 조혈모세포이식은 거의 모든 환자에게 적용 가능하며, 기증자를 찾거나 취득하기 위한 비용이 들지 않는다(11). 따라서 반 일치 조혈모이식의 비중은 점점 증가하고 있다. 그러나 반일치 조혈모세포이식은 HLA 완전 일치 조혈모세포이식에 비하여 이식편대숙주병이 심하다는 단점이 있으 며, T 세포 제거를 통해 이식편대숙주병을 효과적으로 예방할 수 있지만 이식편에서 T 세포를 제거하면 생착율이 떨어지고 질병 재발률이 증가하며 면역 재구성이 지연 되어 감염과 관련된 사망률이 높아진다. 따라서 신속한 면역 재구성, 악성 질환 퇴치 및 항백혈병 효과를 달성하는 동시에 치료와 관련된 독성 및 수용 가능한 이식편대숙 주병 비율을 낮추기 위해서는 적절한 균형이 필요하다(12). T 세포를 제거하기 위한 생체 외 기술은 CD34+ 조혈모세포 전구 세포의 선택에서 CD3+ 세포의 제거에서 최근에는 αβ T 세포의 제거로 진화했다. 이식편에서 αβ T 세포를 제거하면 상대적 으로 γδ T 세포와 NK 세포의 비율이 늘어나게 되며, 이식 후 γδ T 세포 비율이 상대 적으로 높아지면 면역 회복을 돕고 재발을 막는 효과가 있다(4).
αβ T 세포와 γδ T 세포는 체세포 V, D, J 유전자 재배치를 이용하여 다양한 항 원 수용체를 생성하는 유일한 세포이다. T 세포의 δ사슬은 TCR α 유전자를 연구하 던 중 우연히 발견되었으며 발견된 뒤로부터 10년 이상이 흘렀다. γδ T 세포, αβ T 세포는 원시 척추 동물을 제외하고 모두 존재하며, 이는 각 세포군이 면역 능력을 유 지하는데 필요하다는 것을 암시한다. γδ T 세포는 태아의 흉선 개체 발생 중 나타나 는 첫 번째 T 세포이다. αβ T 세포의 출현 및 발달이 진행됨에 따라 γδT 세포의 상 대적 비율이 감소한다.
αβ T 세포와 γδ T 세포는 항원 특이적 레퍼토리와 작동 기능의 발달뿐만 아니 라 항원 인식 및 활성화 요구 조건에서도 명확하게 구별된다. γδ T 세포는 αβ T 세 포에 의해 인식되지 않는 항원에 반응할 수 있고 항원 처리없이 세포 면역 기능을 중 재할 수 있다(13-17). 흉선과 림프절에서 주로 발견되는 αβ T 세포와는 달리, γδ T 세포는 상피 및 점막과 관련된 림프 조직에서 불균형하게 나타나는데, 여기서 피부의 표피 보전 및 장 상피의 항상성 조절 등의 유지 관리를 포함하는 등 부분 특이적인 기
31 능을 수행한다(18).
γδ T 세포는 CD3 양성 T 세포의 0.5~16 % (평균 약 4 %)를 차지하는 것으로 밝혀졌다(19). γδ T 세포는 폐에도 낮은 빈도로 존재하나 다른 점막 부위에 훨씬 더 많으며, 생식계에서 T 세포의 50~70%, 장내 상피 T 세포 중에서 20~40 %, 피부 진 피 T 세포의 50~70 % 로 존재한다(20).
γδ T 세포와 αβ T 세포는 유사한 사이토카인 세트를 생성하고 활성화되면 세 포 독성 반응을 일으킨다. αβ T 세포는 세포 용해 반응 뿐만 아니라 항체의 개발에 도움이 되는 주된 제공자이다. 또한 αβ T 세포는 감염된 세포를 제거하는 데 필수적 이다. 마우스 실험에서 γδT 세포가 결핍 된 마우스는 대개 αβT 세포가 결핍 된 마우 스보다 면역력이 뛰어나다는 보고가 있었다(21). 그러나 다발성 경화증(multiple sclerosis) 환자에서 초기 감염과 침투 시기에 γδ T 세포의 비율은 급격하게 팽창하 였으며, 후기에는 변화가 없었다(22). Ferrick DA 의 연구에서 중요한 초기 반응자 및 사이토카인 생산자로서 γδ T 세포는 αβT 세포 반응이 나타나기 하루 전에 나타 났으며 적절한 사이토카인을 생성함으로써 감염을 초기에 구별하고 일차 면역 반응 을 수립하는 역할을 함을 알았다(23).
다양한 연구에서 밝혀졌듯 αβ T 세포와 γδ T 세포 모두 면역에서 중요한 역할 을 담당하나, γδ T 세포는 항원 제시 없이도 면역 반응을 일으킬 수 있고 αβ T 세포 가 이식편대숙주반응을 일으킬 수 있는 데 반하여 항백혈병 효과 및 초기 면역반응을 수립하므로 조혈모세포이식에서 αβ T 세포를 제거하고 상대적으로 γδ T 세포를 높 은 비율로 주입하는 것은 이식 후 환자의 면역 재구성에 도움이 될 수 있을 것으로 보 인다.
이러한 이점에도 불구하고 αβ T 세포를 제거한 반일치 조혈모세포이식 이후에 γδ T 세포의 회복이나 정상 참고치에 대한 연구가 거의 없었다. 따라서 이번 연구에 서는 환자와 연령대가 비슷한 정상 소아 공여자의 정상 참고치를 계산하여 환자의 중 앙값과 비교해 보고자 하였으나, 본 연구 대상 환자의 공여자 중 형제/자매 비율이
19.3% 밖에 되지 않았고 과립구집락자극인자의 영향이 없다고 보여지는 기준으로
삼은 백혈구 수치가 10,000 (/uL) 이하인 이식을 위한 시술 전 혈액을 형제/자매 공 여자 수만큼 충분히 확보하지 못하여 부모를 포함한 26명의 공여자를 대상으로 참 고치를 구하였다.
Rituximab은 만성 이식편대숙주병에 주요한 역할을 하는B세포를 제거하며,
32
장기이식 후 림프증식 질환(post-transplant lymphoproliferative disorder) 예방을 위한 표적 치료제로서 이식 이후 환자마다 상태에 따라 다른 일정으로 사용되었다
(24-28). B세포는 약물의 영향으로 인하여 고갈 상태를 유지하였기 때문에 이식 후
180일까지 림프구에서 차지하는 비율도 절대 세포수도 거의 증가하지 않았다.
γδ T 세포 수가 증가한 환자의 경우 조혈모세포이식 후 정상 γδ T 세포수를 가 진 환자와 비교하여 감염 확률이 유의하게 낮았고 세균 감염은 γδ T 세포가 상승한 환자에서 관찰되지 않았으며, 무사건 생존율은 조혈모세포이식 후 정상 γδ T 세포 재 구성 환자들에 비해 γδ T 세포 재구성이 향상된 환자들에서 유의하게 높았다는 보고 가 있다(29, 30). 또한 부분적으로 일치하지 않거나 반일치 조혈모세포이식 후 공여 자 유래 γδ T 세포의 수가 증가한 환자는 백혈병 없는 생존율 (leukemia-free survival)과 전체 생존율(overall survival)에서 유의하게 이점이 있음이 밝혀졌다는 보고도 있다(31). 따라서 γδ T 세포는 조혈모세포이식 이후에 매우 중요한 역할을 한 다고 볼 수 있는데 지금까지 대부분의 연구는 T 세포 전체 혹은 CD4+ T 세포, CD8+
T 세포, NK 세포에 주로 초점을 맞추었으며, 이식 후 경과에 따른 γδ T 세포 면역 재 구성은 거의 조사되지 않았다(32, 33).
그러나 또 다른 연구에서는HLA 불일치 가족 공여자 혹은 HLA 일치 비혈연 공 여자로부터 T 림프구를 제거한 골수를 이식 받은 후 1 년 동안 말초 혈액 γδ T 세포 를 조사한 결과, 백분율과 절대 수치가 점진적으로 증가했지만 이러한 증가는 건강한 기증자에서 발견된 수준을 결코 초과하지 않았으며, γδ T 세포 회복 패턴과 이식편 대숙주병의 유의 한 연관성은 없었다고 보고하였다(34). 본 연구는 T 세포 제거가 아 닌 αβ T 세포만을 선별적으로 제거하는 반일치 조혈모세포이식을 대상으로 하였으 므로 αβ T 세포가 사라지면 상대적으로 γδ T 세포와 NK세포의 비율이 증가한 채 환자에게 이식되기 때문에 정상 공여자의 γδ T 세포 참고치와 비교해보면 전체 환자 에서나 무사건 환자에서나 모두 이식 초기부터 건강한 기증자에서 볼 수 있는 수준을 넘는 아주 높은 비율을 유지하다가 감소하는 것을 볼 수 있었다.
본 연구에서 연속적으로 이식 후 림프구아군의 면역 재구성을 모니터링을 한 결과 이식 후 1년 이내에 정상 참고치만큼 수치가 회복되지 않는 세포군이 있었다.
따라서, 이식 후 1년 이후에도 면역 회복에 관한 주기적인 관찰이 필요하다. 또한 소 아 환자 림프구아군의 정확한 참고치를 위해서 정상 소아 공여자의 연령대별, 성별에 따른 검사 데이터를 수집하고, 그에 따른 분석도 필요할 것으로 보인다.
33 결론
본 연구는 소아 환자에서 αβ T 세포를 제거한 반일치 조혈모세포이식 후 γδ T 세포를 비롯한 림프구아군의 변화를 모니터링한 최초의 연구로서, HLA반일치 조혈 모세포이식을 받은 83명의 소아 환자들을 대상으로 하여 유세포분석을 시행하였다.
이식 후 림프구아군의 면역 재구성을 정상 공여자를 검사하여 림프구아군의 참고치 를 분석하였으며 이식 후 무사건 상태를 유지한 환자의 시기별 연속 데이터를 비교함 으로써 정상 참고치까지 도달하는 시기를 분석하였다. 8가지 다색 유세포분석 검사 방법을 사용하여 단 하나의 튜브로 간단하게 T 세포, αβ T 세포, γδ T 세포, CD4+
T 세포, CD8+ T 세포, NK 세포, B 세포의 7가지 림프구아군의 구성을 확인할 수 있었으며, 본 연구를 통해서 이식 후 환자의 면역 재구성을 확인하는데 있어서 유세 포분석 방법이 이후의 치료 과정을 보다 쉽게 모니터링하는데 도움이 될 수 있음을 밝혔다. αβ T 세포를 제거한 반일치 조혈모세포이식에 있어서 γδ T 세포의 절대세 포수는 30일경부터 정상치에 도달하므로 이식 직후부터 최소 한달 이상 γδ T 세포 모니터링이 필요할 것으로 보인다.