3.1 신규 유지문화합물 탐색 , 통계기법 개발 및 적용
3.1.1 신규 유지문화합물 탐색 기법의 개발 및 적용
가. PSI 기법을 이용한 유출된 유류의 분해도 측정
1) 유출된 유류의 분자 단계 연구 필요성
다양한 대체 에너지원의 개발에도 불구하고, 화석 연료는 여전 히 세계 1 차 에너지 소비의 80 % 이상을 차지한다. 최근 석유 수 요 증가로 인해 석유 탐사, 생산 및 운송 활동이 활발하게 이루어 지고 있다. 따라서 석유 제품 운송 중 예기치 않게 유류유출 사고 가 발생할 가능성이 매우 높다. Exxon Valdez 유류유출 사고 및 Hebei Spirit 유류유출 사고와 같은 이전의 대규모 유류유출 사고에 서 볼 수 있듯이, 유류유출의 영향은 오랜 기간 지속될 수 있으며 환경, 해양 생물 및 인간에게 심각한 피해를 줄 수 있다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다. 일단 기름이 한 번 바다에 노출되게 되면 바람, 파도 등에 의해 해양표층으로 퍼지게 된다. 그와 동시에 유 출된 유류는 증발, 분산, 생분해, 광분해 및 침전과 같은 다양한 과 정을 거치게 된다. 이러한 다양한 과정은 유출된 기름의 물리 화학 적 특성을 크게 변화시킨다. 특히 자외선(UV)에 노출된 기름 속 유 해 화학 물질의 독성을 매우 증가시킬 수 있기 때문에 유류유출 연구에서 광분해는 중요한 요소이다.
유출된 유류의 특성에 관한 연구는 해양에서의 거동특성을 규 명하는데 유용하며 ESI는 극성 화합물의 검출에 적절하다는 점은 이미 알려져 있다. 반면에 APPI와 APCI는 비극성 및 저극성인 분 석물의 검출에 유용하다. 그러나 적은 양의 시료만 이용할 수 있거 나 시료가 오염된 경우 이러한 방법을 적용하기 어렵다. 특히 유출 된 유류 분석의 경우 수십 년 동안 환경에 영향을 미칠 수 있으므 로 장기적인 추적 조사가 필요하다. 그러나 해양 환경에 유출된 유 류는 염분 및 부유물과 같은 환경 요인에 의해 오염이 발생할 수 있으므로 분석이 어려워진다. Paper spray ionization(PSI) 및 paper spray chemical ionization(PSCI)는 다양한 유형의 화합물을 직접 분 석하기 위한 빠르고 편리한 이온화 기술이다. PSI는 주로 ESI와 유 사하게 극성 화합물을 검출하는데 사용되며, APPI 또는 APCI와 유 사하게 비극성 화합물 검출에 적용 할 수 있으므로 환경 시료 분 석에 적합한 이온화 방법이다. 유출된 유류에 대한 PSCI의 적용은 이전 논문들에서 보고되었다. 그러나 유출된 유류의 분석을 위한 PSI의 적용은 아직 충분하게 연구되지 않았다. 이 과정에서 환경 샘플 분석을 위한 PSI-MS 사용의 이점을 확인하고 유출된 유류 시 료를 특성화하기 위해 PSI를 사용했다. 이 연구는 PSI-MS를 사용하 여 유출된 유류의 분해 작용을 분자 단계까지 조사한 최초의 연구 이다.
2) 재료 및 방법 (1) 시료준비
한국해양과학기술연구원(KIOST)에서 Hebei Spirit oil spill (HSOS) 에서 유출된 유류 시료를 제공받았다. 이 사고에서 약 10,900 톤의 원유(Kuwait export crude, Iranian heavy crude, and UAE Upper Zakum crude)가 해양으로 유출되어 서해안 일대로 확산되었다. 유 출된 유류 시료의 분해 단계는 유출된 지 7일과 19일 후에 구름포 해변에서 수집되었다. 대조군으로 유출된 비율에 따라 세 종류의 유류를 혼합했다.
광분해 실험을 위해 20 mL 바이알에 여과된 해수 10 mL을 넣 은 후 0.1 g의 Iranian heavy crude(IHC)를 부유시켰다. 시간에 따른 광분해 시료 확보를 위해 UV를 6, 12, 24, 48 및 72 시간 노출시켰 다. UV광은 자연광과 유사한 특성을 보이는 금속 halide 램프 (Philips MSD 250/2 30H)를 사용했다. 이 램프의 UV-A, UV-B 및 UV-C 광의 조사량은 각각 19.9, 1.91 및 0.21W / m2였다. UV 챔버 의 온도는 냉각 시스템을 사용하여 15-20 ℃로 유지되었다. 이 연 구에서 사용된 시료 목록은 표 3.1.1에 제시하였다.
인공적으로 분해된 오일 자연적으로 분해된 오일 샘플 이름
UV 노출
시간 샘플 이름 샘플링 지점
샘플링 날짜 (경과 시간) Weathered
Iranian Heavy
Control Iranian
Heavy
IO1 IC1 0시간 Oil
Mixture - Control
IO2 IC2 6시간 S1-1
태안의 구름포
해변
2007.12.14 ( 7 일 )
IO3 IC3 12시간 S1-2
태안의 구름포해
변
2007.12.26 ( 19일 )
IO4 IC4 24시간 - - -
IO5 IC5 48시간 - - -
IO6 IC6 72시간 - - -
표 3.1.1 실험에 사용된 시료 정보
(2) 질량 분석 및 데이터 처리
PSI-MS에 대한 장비 구성과 PSI의 이미지는 그림 3.1.1에 나와 있다. 약 50 μg의 유류 시료를 유리 파스퇴르 피펫 (Volac, Poulten and Graf Ltd., 영국)을 이용하여 종이 팁의 중앙에 직접 점적하였다. 정량적 실험을 위해 유출된 유류를 디클로로메탄에 용 해시키고 시료 1㎕를 종이 끝에 점적하였다. 종이가 건조된 후, 50 ppb 농도의 sodium dodecyl sulfate(Sigma Aldrich, Japan) 1 μL를
내부 표준물로서 시료에 첨가하였다. PSI의 염 내성을 시험하기 위 해 유류 시료를 톨루엔 : 메탄올 용액 (50:50, v / v)에 1000 ppm의 농도로 용해시키고 10㎕의 용액을 종이 끝에 점적하였다. 시료가 로딩된 종이를 기기의 오리피스 앞에 놓았다. 용매는 10 ㎕/min의 유속으로 실린지 펌프 (Fusion 100T, Chemyx, Stafford, TX, USA) 에 의해 종이 끝에 공급되었다. 유류 시료는 Q-Exactive 질량 분석 기(Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA)를 사용하여 분 석했다. Spray voltage 및 S-lens radio frequency (RF) 레벨은 각각 3900 V 및 50 V, 그리고 모세관 온도는 300 ℃로 설정되었다. 유출 된 유류 시료에서 얻은 데이터를 해석하기 위해 자동화된 피크-피 킹 알고리즘과 함께 소프트웨어 "Statistical Tool for Organic Mixture Spectra”를 사용했다. 분자식은 m/z 값 1 ppm 오류 이내 로 계산되었다. 유출된 유류 시료의 데이터에 얻은 데이터를 할당 시키는데 사용되는 일반적인 조건은 다음과 같다. CcHhNnOoSs (c값 무제한, h값 무제한, 0 ≤ n ≤ 3, 0 ≤ o ≤ 20, 0 ≤ s ≤ 3).
Double bond equivalent 값은 다음의 수식을 사용하여 계산되었다.
DBE = c – + + 1
그림 3.1.1 PSI의 대략적인 절차를 보여주는 개략도와 PSI의 소스 부분
3) 결과
유출된 유류 분석을 위한 PSI 의 잠재력 조사를 실행했다. 유류 분석에서의 PSI의 민감도 및 정량적 특성은 내부 표준물질이 도핑 된 유류 시료를 분석하여 평가했다. 2, 3, 4, 5, 7 및 9 μg의 유류 시료를 종이 팁에 각각 로드한 후 MS 분석을 실시했으며 각각의 스펙트럼을 확보했다(그림 3.1.2). 점으로 표시된 피크인 m/z 293.179, 297.153, 311.168, 325.184, 및 339.200는 백그라운드 피크 이다. 이 피크는 Blank 및 시료 모두에서 관찰되었고 정량 계산에
서 제외하였다. 서로 다른 양의 유류시료를 정량적으로 적재하기 위해 디클로로메탄에 용해시키고 1 ㎕의 유류 용액을 종이 팁에 도입했다. 각각의 스펙트럼으로부터 관찰된 유류의 피크와 표준 화 합물 간의 존재 비율은 다음의 수식을 사용하여 계산되었다.
존재 비율 =
∑
여기서 An과 ASTD는 각각 유출된 유류로부터 n 번째 피크의 존 재량과 스펙트럼에서 관찰된 내부 표준 화합물의 피크 존재량을 나타낸다.
그림 3.1.3에 제시된 각 스펙트럼으로부터 얻은 존재 비율을 계 산하여 그림 3.1.4에 나타내었다. 로딩된 유류 양과 존재 비율 간에 선형의 상관관계가 관찰되었다. 또한 질량 스펙트럼을 분석하기 위 해 2 μg의 유류 시료만 필요하다는 점이 주목할 만하다.
그림 3.1.2 sodium dodecyl sulfate (m/z 265.148)가 포함된 유류를 (-) PSI로 다양한 양을 분석한 스펙트럼. (a) 2μg, (b) 3 μg, (c) 4μg, (d) 5μg, (e) 7μg 및 (f) 9μg의 유류 시료를 종이 끝에 도입
그림 3.1.3 PSI-MS (-) 모드에서 분석한 스펙트럼 (a) 광분해된 IHC시료 (b) 유출된 유류시료
그림 3.1.4 내부 표준물로써 sodium dodecyl sulfate (50 pg) 를 첨가한 분해된 유류의 정량 분석 그래프 (오차막대는 3회 반복 분석의 표준 편차)
MS 신호에 대한 염의 함량의 영향을 확인하기 위해, 유류 시료 를 톨루엔:메탄올 50:50(v/v), 0.005%(g/g) NaCl 이 함유된 톨루엔:메 탄올 50:50(v/v) 및 0.05%(g/g) NaCl 이 함유된 톨루엔:메탄올 50:50 (v/v)을 준비했다. 얻어진 용액의 사진이 그림 3.1.5(a)에 표현되어 있다. 0.05% NaCl 용액은 바닥에 침전물이 있었고, 첨가된 염이 응 고되어 있었다. 3 개의 용액을 (-) ESI 및 (-) PSI MS 로 분석하고, 얻어진 스펙트럼을 그림 3.1.5에 나타내었다.
그림 3.1.5 (a) 0%, 0.005% 및 0.05% NaCl을 함유하는 톨루 엔:메탄올 50:50(v/v) 중에서 1000 ppm으로 희석된 시료 용액의 사진. (b) 각 시료 용액을 사용하여 (-) ESI로 얻은 스펙트럼. (c) 스프레이 용매로서 헥산:2-부탄올 50:50(v/v)을 사용하여 (-) PSI에 의해 얻어진 스펙트럼 (스펙트럼 변화를 명확히 나타내기 위해 스펙트럼의 Y축 스케일은 각각 ESI 및 PSI에 대해 6 × 106 및 1.8 × 107으로 고정)
(-) ESI MS 로 얻은 스펙트럼에서 0.005% NaCl을 용액에 첨가하 면 신호량이 현저하게 감소했다 (그림 3.1.5b (1) 및 (2) 참조). 또
한, 염이 첨가된 후 피크 봉우리의 분포가 크게 변화했다. 염을 첨 가하여 생성된 작은 미립자가 ESI 스프레이 바늘을 막게 하므로 0.05% NaCl 을 함유한 용액으로부터의 (-) ESI MS 스펙트럼을 얻을 수 없었다.
(-) PSI MS의 경우, 0.05% NaCl 을 함유한 용액으로부터 신호 감소 없이 스펙트럼을 얻을 수 있었다 (그림 3.1.5c). 또한 신호량이 동일하게 유지되었다. 또한 (-) PSI MS 스펙트럼은 유류 시료 10 μg이 사용되었으나 성공적으로 잘 얻어졌다. 그림 3.1.5의 데이터 는 (-) PSI가 (-) ESI MS보다 염 및 미립자 오염에 내성이 강한 민 감한 이온화 기술이라는 것을 명확하게 보여준다. 자연 환경에서 유출된 유류는 염이나 미립자에 의해 오염되기 쉬우므로 (-) PSI는 유출된 유류 시료에 대해 매우 효과적인 이온화 대안이 될 수 있 다.
다음으로 PSI MS를 사용하여 분해된 오일을 분석했다. 광분해시 료와 실제 유출된 유류 시료를 (-) PSI MS로 분석하고 얻어진 스펙 트럼을 그림 3.1.3a 및 2.1.3b에 나타내었으며 질량 스펙트럼은 그 림의 왼쪽 및 오른쪽 열에 표시되어 있다. 유출된 유류의 (-) PSI MS 스펙트럼에 대한 총 이온크로마토그램(TIC)은 그림 3.1.6에 제 시하였다. 50 μg의 유류 시료로 20 분의 시간 만에 스펙트럼을 얻 을 수 있다. 이것은 유출된 유류 분석에 PSI를 사용할 때의 장점이 다. 사고 후 사고유 및 유출유 확보가 힘든 점을 감안할 때, 소량 의 시료만으로 분석이 가능한 점은 PSI의 큰 장점이 될 수 있다.
그림 3.1.6 유출된 오일의 PSI (-) 모드 total ion chromatogram (TIC) (a) Oil Mixture (b) S1-1, (c) S1-2
광분해된 유류(그림 3.1.3a의 오른쪽 열)의 스펙트럼에서는 O3S1, O4S1 및 O5S1과 같은 산화된 황 클래스가 주로 검출되었다. 그림 3.1.3에서, O5S1 및 O6S1에 할당된 피크의 상대적 존재량이 증가하 였고, O3S1에 할당된 피크는 광분해에 대한 시간이 증가함에 따라 감소하였다. 이는 광분해가 진행됨에 따라 더 많은 산화 황 화합물