제 3 장
1. 흑진주조개의 건강성 조사
가. 서 론
일반적으로 이매패류의 생식소 발달은 수온과 먹이의 영향에 크게 영향을 받는다. 온 대지방의 경우, 수온은 gametogenesis를 시작하게 하는 cue인 반면, 먹이는 생식소의 발달 을 촉진․성숙시키는 인자로서 유생의 생존에도 그 영향이 있다. 그러나 열대지역의 경 우, 수온이 흑진주조개의 성숙을 결정한다는 보고도 있다(Saucedo et al. 2001). 온대지방 이매패류 서식지에 비해 열대지역 환초 환경의 경우, 수온은 안정적인데 반해 먹이조건 은 좋지 않다. 이런 지역에 서식하는 흑진주조개, P. margaritifera의 서식밀도는 그리 높 지 않은데 그 이유로 먹이원의 부족을 꼽기도 한다. 이 흑진주조개를 이용한 흑진주 산 업은 세계적으로 고부가가치 수산양식 산업으로 각광을 받고 있으나, 근래에 들어서는 양식장 오염, 어장의 노후화, 질병 및 유생 확보 등의 여러 가지 문제로 인해 양식에 어 려움이 있다고 보고되고 있다.
이매패류 유생의 초기성장과 생존율은 모패가 만들어 준 알의 질에 따라 그 수준이 좌우된다고 보고되고 있다. 2002년 한-남태평양연구센타에서 실시한 흑진주조개 종묘생 산 결과(unpublished data)에 따르면 수정란에서 자패 착생까지의 생존율은 0.7% 정도였었 다. 이 종묘생산은 자연에서 채집된 암․수 개체들을 이용하여 실시했던 연구로서, 이런 낮은 수준의 생존율을 보인 것은 환초 지역에서 채집된 암컷 개체의 포란수와 알의 질을 무시할 수가 없다. 이는 해수로부터 충분한 영양원을 받지 못했다는 간접적인 증거가 되 며, 그 결과 생식소의 충분한 성숙을 이루지 못한 것으로 해석할 수 있다.
그러므로 이 연구의 목적은 먹이가 흑진주조개의 생식소 성숙과 유생의 생존에 어떤 영향을 미치는지에 대한 연구로서, 흑진주 양식산업을 위한 모패와 유생 사육에 효율적 인 자료를 제공하는데 있다.
나. 재료 및 방법 (1) Sampling
이 연구에 사용된 흑진주조개, P. margaritifera 모패는 마이크로네시아 연방 축주의 연승수하식 양식장에서 2007년 4월 25일에 채집하였다(그림 3-1-1). 실험에 사용된 모패
는 nursery에서 유생을 키운 후, 2002년 5월에 착생한 치패가 성장한 것으로서 그 크기는
50-120 mm 였다. 흑진주조개가 채집된 시점의 생식소와 건강상태를 파악하기 위해 83개
체 중 23개체를 사용하였다.
그림 3-1-1. 남태평양 마이크로네시아 연방국 축주에 위치한 흑진주조개의 채집 장소
및 실험 지역 (2) 모패 관리
채집된 모패는 패각위의 debris를 모두 제거한 후, 100L 용량의 유수식 실험수조 두개 에 각각 60개체씩 분리 수용하였다(그림 3-1-2). 두 수조 모두 동일한 필터(10 µm-filter)를 사용하였고 환수율(66.7 ml/sec) 또한 같게 조정하였고, 수온은 Saucedo et al. (2001)이 제 안했던 진주조개 성숙 온도인 28-29°C를 유지하였다. 수온과 염분은 YSI 85 (Yellow Spring, Ohio, USA)를 이용하여 매일 측정하였다. 모패에 급이할 먹이는 현장 사정상 live feed를 사용하지 못하고, algal paste (a mixed diet of Isochrysis, Pavlova, Thalassiosira weissflogii and Tetraselmis, shellfish diet 1800TM)를 Uriarte et al. (2004)의 방법에 따라 하 루에 200 cells/?l․day (100 ml per day in each tank)를 한쪽 수조에만 급이하여 feeding과 non-feeding으로 다르게 분리 실험하였다(그림 3-1-3).
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그림 3-1-2. 실험을 위해 사용된 개체들과 수조 및 여과기의 모습
그림 3-1-3. 실험에 사용된 feeding (A)과 non-feeding (B) 실험구 내 개체들의 모습
(3) Biometric measurement and condition index
채집된 모패들의 실험 전후 생식소의 발달 상태와 패각근의 생화학적 분석을 위해 순치 하루 후인 2007년 4월 26일에 20개체, 한 달 후인 5월 25일과 2달 후인 6월 24일에
각각 10개체씩을 두 실험 수조에서 꺼내 실험하였다. 흑진주조개의 크기는 각정부길이
(Hinge length, HL)와 각장(Shell Height)을 vernier caliper를 이용하여 0.01 mm까지 측정하 여 기록하였다. 패각을 포함한 전체무게(total weight, TW)를 측정하고 개각 후, 패각중량 (shell wet weight, SW), 습중량(tissue wet weight, TWW), 근육무게(muscular weight, MW)를 0.01 g까지 측정하고 기록하였다(그림 3-1-4). 이 기록을 사용하여 건강도(condition index, CI)는 SW와 TWW의 비(ratio)로 나타냈으며, 에너지저장도(muscular condition index, MCI) (Saucedo et al. 2001)는 변형된 식인 TDW와 MDW의 비로 나타냈다. 조직학적 관찰을 위 해서 육질의 수직 횡단면을 폭 2 cm 정도로 절개하였고, 이 부분을 Davidson's fixative에
48시간 고정한 후 수돗물로 수세하여 70% ethanol로 치환하여 보관하였다.
그림 3-1-4. 흑진주조개, P. margaritifera의 외부 및 내부 형태와 개각 후 육질과 패각으로 분리한 모습.
(4) 모패 생식소의 조직학적 관찰
70%-ethanol에 고정되어 있던 육질의 수직 횡단면을 ethanol series를 통해 탈수과정, xylene 용액에서 투명과정을 거치고 100%-paraffin으로 봉입하여 5 µm 두께로 조직파라핀 절편법을 실시하였다. 이 후 절편조직은 염색은 Harris hematoxylin과 eosin Y 용액을 이 용하여 비교염색 하였고, 디지털카메라가 장착되어 있는 광학현미경을 이용하여 흑진주 조개 생식소 조직의 발달상태를 그림으로 저장하여 분석에 이용하였다. 흑진주조개 생식 소의 발달단계는 Kang et al. (2003, 2004)의 criteria를 따라 정량적으로 구분하였다[(1) early active, (2) late active, (3) ripe, (4) spawning, (5) spent and (6) absorbing]. 생식소 부 분의 임의의 조직 5군데에서 관찰된 각 부분을 사진촬영 하여 각 발달단계에 따른 난모 세포의 크기를 image processing software를 사용하여 정량하였다. 6개의 발달단계에 맞는 난의 평균크기(±표준편차)의 범위를 이용하여 실험 전후 두 실험구 개체들이 갖는 생식 소 내 변화를 산정하였다.
다. 결과 및 고찰 (1) 수온 및 염분 변화
실험 기간 중의 수온과 염분은 각각 28.2~31.2ºC와 33.8~34.5 ppt의 범위를 보였다. 실
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험을 수행한 실험실이 비록 실내에 위치하고 있으나, 냉방기를 갖추고 있지 못해 대기 온도 및 수온의 변화를 조절할 수는 없었다. 마이크로네시아의 일반적인 수온을 나타내 고 있으며, 염분은 안정적인 모드를 보였다(그림 3-1-5).
25.0 26.0 27.0 28.0 29.0 30.0 31.0 32.0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59
Day
Water Temperature
33.0 33.5 34.0 34.5 35.0
Salinity
Water Temperature Salinity
그림 3-1-5. 실험기간 동안의 수온과 염분의 변화 (28.2-31.2ºC, 33.8-34.5 ppt).
(2) 여과 전후 해수 내 식물플랑크톤 비교
실험을 위해 10 µm의 필터로 여과한 해수에는 Synechocystis sp. and Gloeobacter sp. 단 두 종만이 관찰되었으며, 여과하지 않은 실험구의 해수에는 Achnanthes longipes, Caloneis bacillum, Navicula sp., Nitzschia socialis, Anabaena sp., Gloeobacter sp., Merismopedia sp., Microcystis sp., Oscillatoria sp., and Synechocystis sp. 등의 종들이 혼재하고 있었다(표
3-1-1). 온대지역의 일반적인 해수에 비해 열대지역 자연해수 내 식물플랑크톤의 양이 현
저하게 낮은 것을 관찰할 수 있었으며, 이로 인한 흑진주조개의 번식 및 자연 성장과 치 패의 성장에도 영향을 끼칠만한 수준의 양으로 생각된다. 그러므로 먹이조건이 흑진주조 개 모패의 성장 및 번식에 대한 연구의 필요성을 재확인하는 계기가 됐다.
Treatments Total vol. (ml) Cells/ml Cells/L in the original Vol.
Filtered 1,000 903 45,133
Non-filtered 1,000 1,597 79,850
표 3-1-1. 서로 다른 환경에서의 플랑크톤 변화.
(3) 실험에 사용된 흑진주조개 모패의 생물학적 지수
실험에 사용된 흑진주조개의 크기는 각장(Shell Height, SH), 각고(Shell Length, SL)을 전체 무게 등이 유사하여 실험적인 유의차는 없었다. 초기의 무게는 190 g 정도였으나 (표 3-1-2), 실험을 개시한 후 한 달째 되는 시기에는 두 실험구 모두 무게가 늘었으나, 두 달 후에는 두 실험구 모두의 흑진주조개 모패의 무게는 비슷한 크기임에도 불구하고 줄었다. 이는 체내의 생리적인 현상에 의해 체중이 감소한 원인이 가장 큰 원인으로 생 각된다.
N SH (mm) SL (mm) TW (g)
Initial 20 115.4±9.9 108.0±9.0 190.5±45.7
One month AF 117.7±6.1 107.9±6.7 204.9±30.9
NAF 116.3±6.1 107.6±6.8 207.4±28.8
Two months AF 112.4±6.9 105.0±6.8 192.6±31.5
NAF 113.9±10.5 106.5±11.3 192.8±43.1 표 3-1-2. 실험에 사용된 흑진주조개 모패의 생물학적 지수. AF: 급이군, NAF: 미급이군,
N: 실험 개체수, SH: 각장, SL: 각고, TW: 총중량
(4) 실험 기간 중 흑진주조개 생식소의 변화
실험에 사용된 흑진주조개의 생식소 발달은 그림 3-1-6과 같이 각 단계별로 특징을 가진 그림으로 표현 가능하다. Fig. 는 흑진주조개 난소의 계절에 따른 연중 생식소의 변 화를 나타낸 그림이다. 그림 3-1-6-A는 발달기의 난모세포로 여포내에 성장하는 난모형 성세포 및 난원세포들이 공종하는 것을 관찰할 수 있다. 그림 3-1-6-B는 성숙기의 세포 모양으로서 여포에는 성숙한 난자로 가득 채워지고 여포 내 난자의 축적으로 여포 내부 가 발달 및 확장되었다. 완숙한 알 (mature oocytes)을 포함하고 있다. 성숙기 난의 크기는 평균직경이 40～50 µm 정도로 여포를 가득 채웠고, 난 내에 핵이 관찰된다. 그림 3-1-6-C는 산란기에 일부 난자의 방출이 일어나 여포 내의 빈 공간 (lumen, LM)이 형성 되고 방출되지 않은 알들이 잔존하였다. 방란 후의 성숙난이 존재하며, 방란에 의한 빈 공간이 관찰된다. 산란 후 개체의 생식소로서 성숙난과 초기 성장하는 early vitellogenic oocyte (EV), vitellogenic oocyte (VO), 비어있는 여포 공간 등이 관찰된다. 그림 3-1-6-D 는 소모기의 상태를 나타낸다. 여포에는 잔존 난 (relict ova, RO)이 일부 관찰되지만 일 부 영양세포를 제외하고는 소엽이 거의 비어있는 상태이다. 또한 여포(follicle, F)가 현저 하게 수축되어 있고, 식세포작용이 이루어지고 있는 상태이다.
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그림 3-1-6. 흑진주조개 난소의 생식소 발달 구분. (A) 발달기, (B) 성숙기, (C) 산란/부분산란기, (D) 소모기. Scale bar: 100 μm.
실험초기에는 발달기, 성숙기 및 부분산란하는 개체들의 비율이 각각 12.5%, 62.5%,
25%였다. 마이크로네시아 흑진주조개 특성상 4월부터 산란을 시작하는 특성을 고려했을
때, 이상적인 결과이다. 먹이를 급이하고(AF) 급이하지 않는 실험구(NAF)의 실험기간에 따라 생식소의 변화를 볼 수 있었는데 AF에서는 먹이를 충분히 공급한 한 달 후, 대부분 의 개체들이 산란 또는 소모기의 특성을 가진 반면 먹이를 급이하지 않은 NAF에서는 성 숙상태로 남아 있었다(71.4%)(그림 3-1-7).
먹이를 지속적으로 공급한 AF에서는 두 달 후, 재성숙(21.4%)하는 경향을 보였고, 나 머지는 한달 전과 유사한 생식소 상태를 나타내었다. 먹이를 공급하지 않은 NAF에서는 성숙한 알들의 비율이 급격히 낮아졌으며(36.4%) 이 시기의 알들은 흡수되거나 퇴화하는 상태가 우세(63.5%) 하였다.
이는 먹이를 지속적으로 섭취한 흑진주조개들은 산란과 성숙을 주기적으로 할 수 있 는 에너지가 충분한 것으로 판단되어지며, 정상적인 번식활동이 가능할 것으로 생각된다.
그러나 먹이조건이 극히 낮은 NAF 실험구에서는 에너지원이 부족하여 성숙한 상태로 한 달간 유지하다가 두 달째 들어서는 성숙한 알들을 체내로 다시 흡수하는 흡수기의 개체들 을 많이 관찰한 바, 이는 정상적인 번식활동이 제한된다는 사실을 반증한다고 볼 수 있다.