GCxGC TOF MS LC qTOF MS
그림 2-3-16. 플라스틱 내 비극성 및 극성물질 분석 전처리방법
(2) 플라스틱 내 함유물질 기기분석 방법 확립 (가) GC×GC-ToF 기기분석 방법
시료분석은 Agilent사의 6890 가스크로마토그래피에 LECO사의 2단계 모듈레이터(cryogenic modulator)와 비행시간형질량분석기가 장착된 GC×GC-ToF를 사용하여 분석하였다. GCxGC에 장착된 일차원 컬럼(1D)은 비극성의 Rtx-5MS(30m × 0.25㎜ I.D. 필름두께 0.25㎛)을 사용하고, 이차원 컬럼 (2D)은 Rxi-17(1m × 0.15㎜ I.D. 필름두께 0.15㎛)를 사용하였다. 1차 컬럼의 오븐 온도 프로그램은 초 기온도 50℃(1분간 정치), 승온 4℃/min, 최종온도 310℃로 설정하였다. 2차 컬럼의 오븐온도 조건은 초 기온도 70℃(12분간 정치), 승온 4℃/min, 최종온도 330℃로 20℃로 설정하였다. 주입구의 온도는 300℃, 이온화원 온도는 250℃로 설정하였다. 상세한 GC×GC의 모듈레이터의 조건과 기기분석 조건은 표 2-3-8에 제시하였다.
Autosampler Agilent 7683 Autosampler
Gas Chromatograph Agilent 6890/LECO Dual Stage, Quad Jet Modulator Injection 2 μL Splitless @ 300 ℃
Carrier Gas He @ 2 mL/min, Corrected Constant Flow Columns 1st dimension
(1D) Rtx-5 MS, 30 m × 0.25 mm i.d. × 0.25 μm (Restek, Bellefonte, PA, USA)
2nd dimension
(2D) Rxi-17 Sil MS, 1 m × 0.15 mm I.d. × 0.15 μm (Restek, Bellefonte, PA, USA)
Modulation 6 s with temperature maintained +30 ℃ relative to 2nd oven
Transfer Line 280 ℃
Mass Spectrometer LECO Pegasus BT 4D Ion Source Temperature 250 ℃
Ionization Mode EI
Mass Range 50-900 m/z
Acquisition Rate 200 spectra/s (GC×GC) 표 2-3-8. Pegasus BT 4D GC×GC-TOF 기기조건
(나) LC-qToF 기기분석 방법
액체크로마토그래피(Nexera X2, Shimadzu, Japan)와 비행시간질량분석기(TripleTOF 5600, AB SCIEX, Singapore)를 이용하여 시료 분석을 하였다. LC 조건에서 이동상은 두 가지로 진행하였다. 첫 번 째로 이동상 A는 물(HPLC grade, 0.1% formic acid), 이동상 B는 아세트니트릴(0.1% formic acid)이었 고, 두 번째는 이동상 A는 물(HPLC grade), 이동상 B는 메탄올을 사용하였다. 시료 5㎕를 Gemini C18(50 x 2.00mm, 5㎛) 칼럼에 주입하여 분리하는데 사용하였다. qTOF MS의 조건은 대기압이온화 방 식(Atmospheric-pressure chemical ionization, APCI(positive/negative), 전자분사 이온화 방식 (Electrospray ionization, ESI(positive/negative)의 두 가지 이온화 방법을 사용하였다. APCI, ESI 모드 에서 Source 온도 600℃, CE(Collision energy) ±35V로 하였고, DP(declustering potential)값은 APCI
Liquid Chromatograph Nexera X2, Shimadzu
Column Gemini C18 (50 x 2.00, 5㎛) Mobile Phase A: water (0.1% formic acid)
B: ACN (0.1% formic acid) A: water B: Methanol
Injection vol. 5 ㎕
flow rate 0.6 mL/min
Mass spectrometer TripleTOF 5600, AB SCIEX
Source Temp. 600℃
DP(declustering potential) 80V, -200V ±80V
CE(Collision energy) ±35V
ISVF
(Ionspray voltage floating) Positive 5500 Negative -4500
Ionization Mode APCI (+/-) ESI (+/-) Mass Range TOF MS 100-2000 m/z
IDA-MSMS 50-1000 m/z 표 2-3-9. LC-qTOF MS 기기분석 조건
(3) 분석자료 처리 방법 확립
(가) GCxGC-ToF 분석자료 처리방법 (Data processing method)
GCxGC/ToF 기기분석 자료는 ChromaTOF v.4.51의 데이터 처리 및 통계 패키지를 사용하여 수행하였 다. 분석자료의 처리(peak picking)를 위해서는 baseline collection, peak picking 방법 설정, 질량라이 브러리 검색, 정량적 확인을 위한 총이온크로마토그래피(total ion chromatography, TIC) 또는 unique mass에 기초한 면적이나 높이 계산이 필요하다. ① Baseline 오프셋은 노이즈에 의한 영향을 최소화하기 위해 노이즈의 위 부분으로 설정하였다. ② Peak find 방법은 true signal deconvolution
®
(TSD®
) 기능을 활용하여 선택된 피크의 정확한 조각이온(purification)을 통해 라이브러리를 검색하고 미지화합물을 유추 하였다(그림 2-3-17). TIC에서 피크의 deconvolution을 위해서는 피크 폭 설정과 부가 설정(머무름시간, match score 등)이 필요하다. 1D 및 2D 피크 폭은 크로마토그램에서 관찰된 폭에 기초하여 각각 24(분 석물질의 슬라이스 수(3-4) × 모듈레이션 시간(6s)) 및 0.1로 하였다. 2D에서 유사도 800 이상인 화합 물과 신호 대 잡음비(S/N) 컷오프를 최소 60으로 하여 설정한 값에 해당하면 동일한 화합물로 간주하였 다. ③ 질량라이브러리 검색은 질량범위 40-900, 매칭도 700이상으로 설정하고, NIST 17, Wiley 10 그 리고 실험실에서 구축한 custom library를 이용하여 식별하였다. 매칭도가 700이상은 화합물명으로 나타 내고, 매칭도가 700미만은 미지의 화합물(unknown peak no#)로 표시하였다. ④ 선택된 화합물은 unique mass에 기초하여 면적 계산을 하였다.그림 2-3-17. ChromaToF 프로그램의 TSD
®
기능을 이용한 피크 deconvolution크로마토그래피 정렬(alignment)은 ChromaTOF의 statistical compare를 사용하여 수행되었다. 크로마 토그램에서 피크가 동일한 화합물로 인식되려면 머무름시간과 질량스펙트럼이 최소 일치 기준(minimum match criteria)을 충족해야 한다. 정렬을 위해서 첫번째 컬럼의 머무름시간(1tR)은 6s(1 모듈레이션) 이상 차이가 날 수 없으며, 두번째 컬럼에서 머무름시간(2tR)은 동일한 물질에서 100ms 이하이다. 예로, 각 시 료에서 동일하게 검출된 1,3,5-triphenyl cyclohexane은 다음과 같은 머무름시간(1tR = 2820s, 2tR = 2.61-2.64s)을 가진다. 정렬된 피크에 대한 질량스펙트럼은 최소 일치 임계값(threshold)을 충족해야하는 데, 본 연구에서는 스펙트럼 매칭을 위해 mass threshold를 10%로 하고, 최소 유사도는 60%로 설정하였 다. 머무름시간에 대한 매칭 임계치는 모듈레이션 동안 최대 2개의 peak, 최대 머무름시간 차이는 0.2s로 설정하여 정렬된 결과를 얻었다. 그리고 각 시료의 정렬된 결과에 대해 질량 스펙트럼 매치 스코어를 이용 하여 피셔 비율을 산출하였다. 전 데이터 프로세싱 과정의 흐름도와 주요 분석 파라미터를 그림 2-3-18 에 요약하여 제시하였다.
그림 2-3-18. GCxGC ToF 분석결과 데이터프로세싱 과정
(나) LC-qToF 분석자료 처리방법 (Data processing method)
LC-qTOF는 IDA(Information Dependent Acquisition)모드에서 작동하여 MS와 MS/MS 정보를 동시에 획득하였다. MS의 질량범위는 100-2000m/z이고, MS/MS는 50-1000m/z로 설정하였다. 획득된 자료는 PeakView™ 소프트웨어에 내장된 MasterView™ 소프트웨어를 사용하여 표적 및 비표적 스크리닝 분석을 수행하였다(그림 2-3-19). 분석자료 처리(Peak picking)는 background peak, 피크 선택 방법설정, 라 이브러리 검색 등이 요구된다. Full scan을 통해 얻어진 신호 정보에는 상당한 양의 noise signal이 포함 되어 있어 control 시료에 대한 분석결과를 바탕으로 background peak 정보를 제거하여 실제 시료에 존
재하는 물질의 피크를 선별해야 한다. 피크탐색 방법은 MasterView™의 peak picking 알고리즘을 활용하 여 선택된 피크의 정확한 조각이온을 통해 라이브러리 검색과 미지의 화합물을 잠정적으로 식별하였다. 라 이브러리 검색은 SCIEX All-in-on과 NIST 2017, 그리고 실험실에서 구축한 자체 라이브러리(In-house library)를 이용하였다. 본 연구에서는 라이브러리 점수(library score), formula finder score 70 이상을 보고하였다.
그림 2-3-19. MasterView
™
소프트웨어를 이용한 자료처리(4) 자체(In-house) 라이브러리 구축 (custom library)
(가) GCxGC-ToF를 이용한 자체 라이브러리 구축 (custom library)
PCBs 22종, OCPs 27종, PAHs 65종, n-알칸 35종, 플라스틱 첨가제인 PBDEs 7종(BDE 209 제외), HBCDs 3종, 유기인계난연제 10종, 프탈레이트류 3종, 벤조페논류 3종, 산화방지제 4종, UV 안정제 5종 의 화합물을 GC×GC-TOF를 활용하여 분석 후 custom library에 저장하였다(표 2-3-10, 그림 2-3-20). 과불화화합물(Perfluorinated compounds, PFCs), 단쇄염화파라핀(short chain chlorinated paraffins, SCCPs)는 극성 화합물로 기체크로마토그래피 분석을 위해 silylation 과정이 요구되거나, 전기 이온화(electron ionization, EI) 방식으로 분석에 한계가 있는 물질로 라이브러리를 구축하지 못하였다.
표 2-3-10에 custom library에 구축된 표적물질에 대하여 요약하였다.
Chemical Group Compound Name
PeCB, HCB, α-HCH, β-HCH, γ-HCH, δ-HCH, α-chlordane, γ
표 2-3-10. GC×GC-ToF로 구축된 custom library
Chemical Group Compound Name
Polychlorinated biphenyls
PCB8, PCB18, PCB28, PCB29, PCB44, PCB52, PCB66, PCB87, PCB101, PCB105, PCB110, PCB118, PCB128, PCB138, PCB153, PCB170, PCB180, PCB187, PCB195, PCB200, PCB206, PCB209
Polycyclic aromatic hydrocarbons 41 kind of PAHs (2 to 7 benzene ring, and alkyl substituted PAHs), 24 kind of Nitro-PAHs (Nitro substituted PAHs)
Saturated hydrocarbons
(CnH2n+2) n-alkanes (C8 to C40)
Polybrominated diphenyl ethers
BDE 28, BDE 47, BDE 100, BDE 99, BDE 154, BDE 153, BDE 183, BDE 209
Brominated flame retardants (Hexabromocyclododecane)
α-HBCD, β-HBCD, γ-HBCD
Novel brominated flame retardants PBT, PBEB, DPTE, HBBz, HCDBCO, BTBPE, OBIND, DBDPE
Organophosphorus esters Tris(2-chloroethyl) phosphate (TCEP), Tris(1-chloro-2-propyl) phosphate (TCPP), Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate (TDCPP), Triisobutyl phosphate (TIBP), Tributyl phosphate (TBP), Tris(2-butoxyethyl) phosphate (TBEP), Triphenyl phosphate (TPhP), 2-Ethylhexyl diphenyl phosphate (EHDPP), Tricresyl phosphate (TpCP), Tris(2-ethylhexyl) phosphate (TEHP) Siloxanes D4, D5, D6, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16, L17 Benzophenone derivatives 2,4-2OH-BP, 2-OH-4MeO-BP, 2,2',4,4'-4OH-BP
Bisphenol analogues Bisphenol F, Bisphenol S, Bisphenol A, nonyl phenol
Perfluoroalkyl acids (PFAAs) PFBA, PFPeA, PFHxA, PFHpA, PFOA, PFNA, PFDA, PFUnA, PFDoA, PFTriA, PFTA, PFBS, PFHxS, PFOS, PFOSA
Phthalates
DEHP, DnOP, DBP
Benzotriazole ultraviolet stabilizers UVMC80, UV320, UV326, UV327, UV328 Antioxidant Irganox 1076, Irganox 1010, 2,4-DTBP, BHT
그림 2-3-20. GC×GC-ToF를 이용한 custom library구축(예, PCB와 OCPs 화합물) (나) LC-qToF를 이용한 자체 라이브러리 구축 (custom library)
브롬계 난연제 8종, 페놀류 5종, 신규 방오제 14종, 프탈레이트류 3종, 산화방지제 4종, UV 안정제 5 종, 벤조페논 3종의 화합물을 LC-qTOF를 활용하여 자체 라이브러리를 구축하였다. 유기인계 난연제, 실 록산 등은 액체크로마토그래피 분석에는 한계가 되는 물질로 자체 라이브러리로 구축하지 못하였다. 구축 된 화합물의 이동상과 사용된 칼럼, 이온화방법, 분자량을 표 2-3-11에 자세하게 나타내었다.
Compounds MW Formular Mode Method file column Benzophenone 2,4-2OH-BP 214.22 C13H10O3 APCI (-) A: water, 100% B: MeOH 100% Sciex neg (DP 80) Gemini 5um C18 110A, 50x2mm
2-OH-4MeO-BP 228.25 C14H12O3 APCI (-) A: water, 100% B: MeOH 100% Sciex neg (DP 80) Gemini 5um C18 110A, 50x2mm 2,2',4,4'-4OH-BP 246.22 C13H10O5 APCI (-) A: water, 100% B: MeOH 100% Sciex neg (DP 80) Gemini 5um C18 110A, 50x2mm
Phenols BPF 200.23 C13H12O2 APCI (-) A: water, 100% B: MeOH 100% Sciex neg (DP 80) Gemini 5um C18 110A, 50x2mm
Bisphenol S 250.27 C12H10O4S APCI (-) A: water, 100% B: MeOH 100% Sciex neg (DP 80) Gemini 5um C18 110A, 50x2mm Bisphenol A 228.29 C15H16O2 APCI (-) A: water, 100% B: MeOH 100% Sciex neg (DP 80) Gemini 5um C18 110A, 50x2mm
PCP 266.34 C6HCl5O APCI (-) A: water, 100% B: MeOH 100% Sciex neg_2 (DP 80) Gemini 5um C18 110A, 50x2mm
NP 220.35 C15H24O APCI (-) A: water, 101% B: MeOH 101% Sciex neg_2 (DP 81) Gemini 5um C18 110A, 50x2mm
brominated flame retardants HBCDs 641.7 C12H18Br6 APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI neg DP200 25min Gemini 5um C18 110A, 50x2mm TBBPA 543.87 C15H12Br4O2 APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI neg DP200 25min Gemini 5um C18 110A, 50x2mm BTBPE 687.64 C14H8Br6O2 APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI neg DP200 25min Gemini 5um C18 110A, 50x2mm PBCD 560.783 C12H17Br5 APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI neg DP200 25min Gemini 5um C18 110A, 50x2mm DTBP 206.32 C14H22O APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI neg DP200 25min Gemini 5um C18 110A, 50x2mm TBP 330.8 C6H3Br3O APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI neg DP200 25min Gemini 5um C18 110A, 50x2mm TBBPA-DBPE 943.62 C21H20Br8O2 APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI neg DP200 25min Gemini 5um C18 110A, 50x2mm HCDBCO 540.7 C13H12Br2Cl6 APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI neg DP200 25min Gemini 5um C18 110A, 50x2mm UV stabilizer UV 320 323.1998 C20H25N3O APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI pos DP80 Gemini 5um C18 110A, 50x2mm UV 326 315.1138 C17H18ClN3O APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI pos DP80 Gemini 5um C18 110A, 50x2mm UV 327 357.1608 C20H24ClN3O APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI pos DP80 Gemini 5um C18 110A, 50x2mm UV 328 351.2311 C22H29N3O APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI pos DP80 Gemini 5um C18 110A, 50x2mm UV MC80 290.1882 C18H26O3 APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI pos DP80 Gemini 5um C18 110A, 50x2mm Phthalates DBP 278.1518 C16H22O4 APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI pos DP80 Gemini 5um C18 110A, 50x2mm DEHP 390.277 C24H38O4 APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI pos DP80 Gemini 5um C18 110A, 50x2mm DnOP 390.277 C24H38O4 APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI pos DP80 Gemini 5um C18 110A, 50x2mm Antioxidants 2,4-DTBP 206.1671 C14H22O APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI pos DP80 Gemini 5um C18 110A, 50x2mm Iganox1076 530.4699 C35H62O3 APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI neg DP200 25min Gemini 5um C18 110A, 50x2mm Irganox 1010 1176.784 C73H108O12 APCI (-) A: water,(0.1% fomic acid) B: ACN (0.1% formic acid) APCI neg DP200 25min Gemini 5um C18 110A, 50x2mm BHT 220.35 C15H24O APCI (-) A: water,(0.2% fomic acid) B: ACN (0.2% formic acid) APCI neg DP200 26min Gemini 5um C18 110A, 50x3mm
Antifouling Chlorothalonil 263.8816 C8Cl4N2 ESI (+) A: water, 100% B: MeOH 100% sciex pos Gemini 5um C18 110A, 50x2mm
Copper Pyrithione 314.9323 C10H8CuN2O2S2 ESI (+) A: water, 100% B: MeOH 100% sciex pos Gemini 5um C18 110A, 50x2mm Dichlofluanid 331.9623 C9H11Cl2FN2O2S2 ESI (+) A: water, 100% B: MeOH 100% sciex pos Gemini 5um C18 110A, 50x2mm Diuron 232.017 C9H10Cl2N2O ESI (+) A: water, 100% B: MeOH 100% sciex pos Gemini 5um C18 110A, 50x2mm Econea 347.9277 C12H5BrClF3N2 ESI (+) A: water, 100% B: MeOH 100% sciex pos Gemini 5um C18 110A, 50x2mm Irgarol 1051 253.1361 C11H19N5S ESI (+) A: water, 100% B: MeOH 100% sciex pos Gemini 5um C18 110A, 50x2mm Octhilinone 213.1187 C11H19NOS ESI (+) A: water, 100% B: MeOH 100% sciex pos Gemini 5um C18 110A, 50x2mm Sea-Nine 211 281.0408 C11H17Cl2NOS ESI (+) A: water, 100% B: MeOH 100% sciex pos Gemini 5um C18 110A, 50x2mm Zinc Pyrithione 315.9319 C10H8N2O2S2Zn ESI (+) A: water, 100% B: MeOH 100% sciex pos Gemini 5um C18 110A, 50x2mm Ziram 303.9175 C6H12N2S4Zn ESI (+) A: water, 100% B: MeOH 100% sciex pos Gemini 5um C18 110A, 50x2mm TCMS Pyridine 292.8639 C6H3Cl4NO2S ESI (+) A: water, 100% B: MeOH 100% sciex pos Gemini 5um C18 110A, 50x2mm
TCPM 274.9308 C10H4Cl3NO2 ESI (+) A: water, 100% B: MeOH 100% sciex pos Gemini 5um C18 110A, 50x2mm
Thiram 239.9883 C6H12N2S4 ESI (+) A: water, 100% B: MeOH 100% sciex pos Gemini 5um C18 110A, 50x2mm
Tolylfluanid 345.978 C10H13Cl2FN2O2S2 ESI (+) A: water, 100% B: MeOH 100% sciex pos Gemini 5um C18 110A, 50x2mm Mobile phase
표 2-3-11. LC-qToF로 구축된 custom library
(5) 플라스틱 시료 내 표적물질 및 비표적물질 탐색 기법 확립
(가) GC×GC-ToF를 이용한 플라스틱 시료 내 표적물질 및 비표적물질 탐색
플라스틱 시료 내 표적과 비표적 화합물에 대한 탐색 방법은 ChromaToF로 데이터 프로세싱 후 생성되 는 피크 테이블(peak table) 및 화합물질 표(compound table)를 활용하였다. Peak table에는 NIST 17, Wiley 10, 자체 라이브러리에서 700 이상으로 매칭된 화합물의 경우 화합물명(CAS번호, 구조식, exact mass)으로 제시되며, 700 미만인 화합물은 unknown#(peak#)으로 제시된다(표 2-3-12). Compound table은 ChromaToF 프로그램 내 Statistical compare라는 보조프로그램을 활용하여 검출된 화합물명, 머 무름시간(평균, 편차)을 기준으로 정렬(alignment)과정을 수행하여 피크면적(평균, 편차), S/N비(평균, 편 차), 검출빈도수(count), fisher ratio 등이 통계 처리된 결과이다.
플라스틱 시료 내 표적물질 및 비표적물질 탐색 방법에 대한 모식도를 그림 2-3-21에 나타내었다. 대 상화합물 탐색 방법은 Matlab 2016b를 활용하여 Custom library에서 구축된 물질의 질량조각이온, CAS 번호, 화합물명, 구조식에 대하여 해당 시료의 peak table에서 대상 화합물을 검색하는 스크립트를 구성하 여 각 시료의 대상화합물을 나열하였다. 본 연구에서는 대상 화합물에 대하여 정량을 수행하지 않았다.
비표적물질 탐색은 ChromaToF 프로그램 내 Statistical compare를 활용하여 반복 분석된 분석 결과 (peak table)에 대하여 우선적으로 정렬하였다. 이를 통해 불필요한 피크를 줄이고, 분리가 잘된 피크에 대하여 높은 질량 정확도 가지는 화합물을 얻을 수 있다. 정렬은 1D 머무름시간(6초), 2D 머무름시간(0.1 초), 질량스펙트럼 match score를 700으로 설정하여 수행하였다. 부가적으로 S/N비를 100으로 설정하여 비교적 낮은 시그널을 가지는 화합물은 제외하였다. 모든 분석 시료에 대하여 동일한 정렬을 수행하였다.
예상 화합물(suspected compounds)은 조각이온 스펙트럼이 NIST 및 Wiley 라이브러리로 검색결과 매 칭도가 700 이상, 확률은 5000 이상에 해당되는 화합물, 그리고 자체 라이브러리에 구축된 화합물의 질량 스펙트럼과 유사한 특정 모체 조각이온을 가지고, 선택이온(extracted mass ion) 및 다차원 크로마토그램 의 정렬특성에서 그룹으로 분류되는 화합물로 정의하였다(그림 2-3-22). 미지 화합물(unknown