미확인 반달곰 추적을 위한 마커 시스템 개선 연구. 성별 판별을 가능하게 하는 20종의 MS 마커와 SRY 및 ZFXY 유전자를 사용합니다.
멸종위기종이란?
국외 멸종위기 종 복원 현황
국내 멸종위기 종 복원 현황
Microsatllite 마커
국내·외 MS 마커를 활용한 선행연구
개인별 추적 효율성 평가 및 개인별 대립유전자 유형 데이터베이스 구축. ③ 기존보다 개선된 마커 세트를 이용하여 개인별 대립유전자 유형을 판별합니다. ④ 개인별 대립유전자 유형 프로파일 생성 및 DB 구축.
초위성 마커를 이용한 대립유전자 분석의 원리. MS 마커의 대립 유전자 결정 및 성별의 분자 결정. MS 마커의 대립 유전자 결정 및 성별의 분자 결정.
초위성 마커를 이용한 대립유전자 유형 분석 방법의 모식도. Multiplex PCR 대립유전자 유형 분석을 이용한 개인별 대립유전자 유형 분석. Multiplex PCR을 이용하여 개인별 대립유전자 유형을 분석합니다.
기존 MS 마커 15종을 이용한 대립유전자 분석 결과입니다. CERVUS 프로그램을 이용한 대립유전자 분석 결과입니다.
요점
개체식별능력이 뛰어난 마커선발
다중마커 증폭 조건의 최적화
개체추적 효율 평가 및 개체별 대립유잔자형 DB 구축
활용방안
기대효과
2세대가 증가함에 따라 아시아곰 복원사업에서는 가계도 및 유전자형 데이터베이스 구축이 필수적이며, 유전체 정보 보호를 위해 MS 마커 발굴이 이루어졌다. 우리는 아시아 흑곰 우수리쿠스(U. thibetanus ussuricus)의 게놈을 기반으로 새로운 마커를 선택하고 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 특정 표적 서열을 증폭시켜 가장 신뢰할 수 있는 대립유전자를 제공했습니다. ① 다음의 이상치 품질 관리 마커(대립유전자 수가 적은 마커)를 제거하고 교체합니다.
③ 최종 선택된 태그를 이용하여 개인 식별을 위한 태그 세트를 설정합니다. ② 멀티마커 증폭을 위한 물리적 조건(터치 조건, 주기 등)을 설정합니다. ② 유전적 다양성 지수를 기반으로 마커의 개체 식별 능력을 평가합니다.
신규 마커 선택을 통해 구축된 MS 마커 세트가 높은 빈도를 나타내는 다형성 마커로 구성된다면, 개인 간의 유전적 차이와 신원 불명의 개인을 식별하는 데 있어 신뢰도가 높은 정보를 기반으로 추적 능력이 향상될 것입니다.
DNA 추출
또한, 상대적으로 높은 다형성을 나타내며, PCR(Polymerase Chain Reaction) 기술을 이용한 증폭을 통해 대립유전자를 쉽게 분석할 수 있습니다. 대립유전자 유형 및 유전자형을 결정한 후, 이전에 확립된 가계 정보를 사용하여 대립유전자의 멘델 유전을 테스트했습니다. 멘델의 유전에서 벗어나지 않는 대립유전자를 나타내는 공간입니다.
성 결정 마커의 개발은 SRY 유전자와 ZFXY 유전자의 증폭 패턴을 활용했습니다. NGS 기법을 활용한 참조유전체 분석 과정입니다. 각 MS 마커에 대해 결정된 대립유전자를 사용하는 대립유전자의 빈도.
계산하여 유전적 다양성 지수를 계산하였습니다. PCR 산물의 확인은 아가로스 전기영동을 통해 수행되었습니다. 총 57개의 시료를 이용하여 15종의 초위성 마커를 이용하여 대립유전자 유형을 분석한 결과, CERVUS 3.0.6을 이용하여 각 마커에 대한 이형접합성(HExp) 및 다형성 정보 함량(PIC)을 분석하였다(표 5.3.2).
성 염색체 Y에 SRY 유전자의 존재를 확인하기 위한 구배 PCR 결과. 위성상 마커를 사용한 염소의 분자 유전적 검토.
초성위체 마커를 이용한 대립유전자형 분석 원리
유전적 다양성 평가 및 가계도 구축
가축을 비롯한 동물과 그 생산품을 식별하는 방법으로는 기존에는 혈액형 다형성 분석, 생화학적 지표 분석 등의 방법이 사용됐다. 그러나 이러한 기술은 분석에 사용되는 조직에 한계가 있다는 단점이 있다. DNA 다형성을 기반으로 한 다양한 유전자 분석 방법이 개발되었으며, 이러한 방법을 통해 품종 간 및 개체 간 식별이 수행됩니다. 인간의 경우, 현재 형사 및 민사 재판, 실종자 수색, 친자관계 등 밀접한 유전적 관계를 조사하는 데 광범위하게 사용되고 있습니다. 따라서 이 유전정보는 그 개인만이 갖고 있는 고유한 정보로 남게 됩니다.
선별된 15개의 마커를 이용하여 PCR 증폭 효율을 테스트하였으며, PCR 증폭 시 5'말단에 FAM, VIC, NED, PET 등의 형광물질을 표지하여 대립유전자를 판별하는데 사용하였습니다. 반달가슴곰 전장 게놈 서열 등록 정보(국립공원종보존센터 제공) 이는 디뉴클레오티드 반복 동형접합체의 전형적인 예이며, 대립유전자 거리가 4-bp입니다.
대립유전자 다양성 지수(이형접합성 비율, 다형성 정보의 양, 개별 발생 동일 비율)의 계산, Hardy-Weinberg 평형 테스트 및 친자 확인은 CERVUS 3.0.6을 사용하여 수행됩니다.
우수리아종 미확인개체 추적에 적합한 MS 마커 선발
MS 마커의 Multiplex PCR 조건 확립
Multiplex PCR을 이용한 개체별 대립유전자형 분석
추가적인 미확인 개체 식별을 위한 MS 마커 Primer Set
Usshuria 종의 미확인 개체를 모니터링하는 데 적합한 MS 마커 선택. Gradient PCR을 이용한 15종 MS marker의 DNA 증폭 검증 PCR 제품명(bp) Sequence. 그런 다음 피펫을 사용하여 조심스럽게 겔 홈에 적용한 다음 DNA를 양극으로 향하게 합니다.
각 프라이머는 온도에서 분리되는 단일 가닥에 특이적으로 결합합니다. PCR을 사용하여 DNA의 표적 영역을 증폭하는 데 일반적으로 사용됩니다. 미확인 물체의 추가 식별을 위한 MS Marker Primer Set 제작
형광물질의 출현으로 인해 기존 세트에 대한 개선이 필요하다고 판단되어 추가적인 MS 마커 선정을 실시하였습니다. 우리 연구팀은 20종의 MS 마커에 대해 동일한 조건에서 기울기 PCR을 수행했습니다. 다만, 15종의 MS 마커를 사용하였음에도 불구하고, 정체불명 개체의 출현으로 인해 기존 MS 마커 세트에 대한 개선의 필요성이 인식되어 이에 따라 5종의 MS 마커를 추가로 선정하였다.
성염색체 상 MS 마커를 이용한 개체 식별
