4. 연구방법
4.1. DNA 추출
○ 반달가슴곰 집단에서 부모와 자손의 친자확인은 microsatellite (MS)
marker의 유전자형을 비교하여 판독하였다. 북한, 중국, 러시아 등지에서
도입한 개체들의 혈액이나 털, 야생에서 출생한 개체들은 동면기 조사에서 수집한 어린 개체의 털이나 분변을 DNA 추출에 이용하였으며, 혈액이나 조직에서의 DNA 분리는 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany), 털은 QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germany), 분변은 QIAamp PowerFecal DNA Kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 spectrophotometer로 정성-정량한 후 중합효소연 쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 위한 주형으로 이용하였다.
4.2. 초위성체 마커를 이용한 대립유전자형 분석 원리
○ 가축을 포함한 동물 및 그의 생산물의 동정을 위한 방법으로 기존에는 혈액형 및 생화학적인 지표의 다형성 분석방법 등을 사용하였으나 이런 기 법들은 분석을 위해 사용되는 조직들이 한계가 있다는 단점을 가지고 있지 만 최근 들어 DNA 다형성에 기초한 다양한 유전적 분석방법들이 개발되 었으며, 이를 이용하여 품종 간 및 개체간의 동정이 이루어지고 있다.
○ MS 마커는 1-5 bp의 일정 염기서열이 반복되는 특징을 갖으며, 포유류 의 게놈 전체에서 대략 50,000-100,000 좌위에서 나타난다. 또한 이들은 상 대적으로 높은 다형성을 나타내며, polymerase chain reaction(PCR) 기법을 이용한 이들의 증폭을 통하여 쉽게 이들의 대립유전자형을 분석할 수 있 다. 현재 소에서 약 천개의 MS 좌위가 밝혀져 있으며, 이들의 특성 및 염 색체상의 위치파악이 이루어졌다. 이들 중 품종 간, 개체 간 다형성이 높은
MS 마커들을 선별하여 혈통검정을 위한 수단으로서 사용되고 있다 (Barendse 등, 1994; Kappes 등, 1997). 이 과정에서 여러 개의 primer를 혼 합하여 증폭하는 multiplex PCR 기법이 사용되고 있으며, 이를 통하여 효율 적인 혈통검정 및 연관지도 작성 등이 수행되고 있다. 이러한 분석을 통하 여 인간을 포함한 포유류, 어류, 식물 등을 대상으로 이루어지는 집단유전 분야에서 유전적 다양성에 기초한 집단 간, 집단 내 유전성분과 연관성 분 석을 위한 중요한 DNA marker로서 사용되어지고 있다(Achmann 등, 2004;
Ayub 등, 2003; Borrell 등, 2004; Fang 등, 2005; Jakse 등, 2004; Metta 등, 2004).
○ 최근 fingerprinting란 용어가 사회적 이슈가 되고 있는데, fingerprinting이 란 사람 손의 지문이 사람마다 다르듯이 사람이나 동물의 DNA 중 특정한 부분들이 개체마다 다르므로 지문과 같은 역할을 하는 것에 비교되어 fingerprinting이란 이름으로 불리어 진다.
○ 사람의 경우 현재 형사와 민사소송, 실종인물의 수색과 친자관계 같은 밀접한 유전적 관계의 조사 등에 중요하게 이용되고 있다. 동물의 경우 생 산이력제에 적용되어 개체를 판별하는데 사용되어 소비자들이 안심하고 제 품을 구입할 수 있도록 기초자료로 활용되고 있다.
○ DNA 중 fingerprinting으로 사용되는 부분의 특징은 동일한 염기서열 2
개가 10에서 15회 정도 반복이 되는 부분을 이용하는데, 이를 별도로 MS
마커라고 부른다(그림 4.2.1).
그림 4.2.1. MS 마커의 특징
(A)
(B)
DNA marker
Forward Primer Reverse Primer (A)
(B)
DNA marker
Forward Primer Reverse Primer
그림 4.2.2. MS 마커를 이용한 Primer 디자인 방법
○ MS 마커 여러 개 이용하여 DNA를 증폭시켜(그림 4.2.2) 자동염기서열 분석장치를 이용하여 전기영동을 실시하면, 그 개체가 가지고 있는 고유의 유전정보를 얻을 수 있고, 각 개체의 유전정보는 숫자로 표시되는데 이 숫 자는 동일한 2개의 염기서열의 반복되는 횟수에 따라 달라진다. 그러므로 이 유전자정보는 그 개체만이 가지고 있는 고유의 정보로 변함이 없다.
4.3. MS 마커 대립유전자형 결정 및 분자 성 판별
○ 지리산 반달가슴곰 집단에서 개체의 대립유전자형 결정에 이용한 MS marker들은 NGS으로 결정한 전장 유전체 서열(whole genome sequence, NM-14-04-05, 그림4.3.1, 그림 4.3.2)의 정보를 이용하여 선발하였다. 선발한 15개의 marker를 이용하여 PCR 증폭 효율을 시험하였으며, PCR 증폭 시 FAM, VIC, NED, PET 등의 형광물질로 5‘-말단을 표지하고 대립유전자형 결정에 이용하였다.
○ PCR은 Maxime PCR Premix-iTaq (Intron Biotechnology Inc., South Korea) 을 이용하여 20 ul 반응액을 조성하여 Mastercycler Nexus Gradient (Eppendorf, Germany)를 이용한 Touch-down PCR로 증폭하였다. 대립유전자 형 유전자형을 결정한 후, 기존에 구축된 가계 정보를 이용하여 대립유전 자의 Mendelian inheritance를 시험하였다.
○ Mendelian inheritance에서 벗어나지 않는 대립유전자형을 나타내면서, 방
사 1세대에 대한 유전적 다양성(이형접합율, 다형정보량, 동일개체출현율,
부권부정율 등)이 높은 marker를 다시 선정하여, 기존 15종의 MS marker에 5개를 추가 선발하여 Set1, Set2로 분류하여 최종 20종의 MS marker를 가 계도 구축과 유전적 다양성 평가에 이용하였다.
○ 성판별을 위한 마커 개발은 SRY 유전자와 ZFXY 유전자의 증폭 양상을 이용하였다. NCBI database에 보고된 곰과 동물의 SRY (AM748310, NW_007925176), ZFXY 유전자 서열 (AB261810, AB261818)을 수집한 후,
그림 4.3.1. NGS 기법을 이용한 참조유전체 분석 작업 과정
그림 4.3.2. 반달가슴곰 전장 유전체 서열 등록 정보(국립공원생물종보전원 제공)
그림 4.3.3. 초위성체마커를 이용한 대립유전자형 분석 방법 모식도
그림 4.3.4. GeneMapper version 4.0 이용한 예시 1
그림 4.3.5. GeneMapper version 4.0을 이용한 분석 중 잘못된 예
그림 4.3.6. Dinucleotide repeat homozygote의 전형적인 유형
그림 4.3.7. Dinucleotide repeat homozygote의 전형적인 유형의 예시이며, 대립유전자의 거리는 4-bp
○ MS 마커와 SRY, ZFXY 유전자에 대한 PCR 산물을 ABI-3130xl 염기서열 분석장치(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 크기별로 분류하여 전기영 동을 실시하고 GeneMapper version 4.0 (Applied Biosystems, USA; 그림 4.3.3, 그림 4.3.4)를 이용해 크기와 포식자의 표류별로 분류한 후 Microsoft Excel (Microsoft, USA)을 이용하여 자료를 취합하였다(그림 4.3.5, 그림 4.3.6, 그림 4.3.7).
4.4. 유전적 다양성 평가 및 가계도 구축
○ MS marker별로 결정된 대립유전자형을 이용하여, 대립유전자형의 빈도
를 산출하고 유전자 다양성 지수를 산출하였다.
○ 또한 대립유전자형의 조합에 따라 1, 2세대 암컷, 수컷을 후보 부모로 선정하고, 2, 3세대 개체들을 자손으로 친자확인을 시험하였다.
○ 대립유전자형의 다양성 지수(이형접합율, 다형정보량, 동일개체출현율) 산출과 Hardy-Weinberg 평형 시험, 친자확인은 CERVUS 3.0.6. (Kalinowski et al., 2007) 프로그램을 이용하였다.
Locus name 1
Locus name 2 Locus name 1
Locus name 2
그림 4.4.1. CERVUS Input data의 형태
Input number of MS to be analyzed
Input the column position of the 1
stallele
Choose a genotype file to be analyzed
Give a name of result file
Input number of MS to be analyzed
Input the column position of the 1
stallele
Choose a genotype file to be analyzed
Give a name of result file
그림 4.4.2. CERVUS program의 분석을 위한 실행 모습
표 4.4.1. CERVUS program Outcome data의 예시
Locus k N HObs HExp PIC
BM143 7 273 0.458 0.627 0.583
BM302 8 269 0.502 0.579 0.507
BM415 8 266 0.263 0.293 0.281
BM1329 8 269 0.572 0.653 0.602
BM1818 7 270 0.17 0.239 0.228
BM2830 8 269 0.617 0.652 0.605
BM4621 7 257 0.681 0.735 0.705
BM6526 12 272 0.68 0.751 0.716
BMS1248 9 271 0.579 0.602 0.559
CSRD247 9 268 0.623 0.685 0.644
ILSTS008 7 271 0.421 0.444 0.411
ILSTS028 9 272 0.415 0.709 0.663
INRA006 15 272 0.636 0.704 0.663
INRA011 19 270 0.833 0.807 0.782
INRABERN192 8 270 0.456 0.467 0.441
MAF065 10 269 0.602 0.681 0.633
MCM53 11 266 0.707 0.777 0.744
OarAE54 10 253 0.549 0.677 0.64
OarFACB48 8 269 0.747 0.804 0.773
OarFCB11 9 272 0.662 0.627 0.554
OarFCR304 18 265 0.608 0.786 0.755
OarHH56 7 268 0.41 0.502 0.472
OMHC1 10 272 0.787 0.735 0.707
P19(DYA) 11 273 0.495 0.546 0.516
SPS113 7 256 0.469 0.548 0.521
SRCRSP5 10 271 0.494 0.602 0.568
제 5 장 연구결과
5.1. 우수리아종 미확인개체 추적에 적합한