제 5 장 연구결과
5.1. 우수리아종 미확인개체 추적에 적합한
5. 연구결과
5.1. 우수리아종 미확인개체 추적에 적합한 MS 마커 선발
○ 반달가슴곰 우수리아종을 대상으로 초위성체마커를 이용한 기존의 개체 추적의 대립유전자형 분석은 15종의 MS 마커를 기반으로 시행되었으며, PCR 증폭 효율이 좋은 28종의 MS 마커의 적용테스트를 통해 15종의 MS 마커를 선발하였다 (표 5.1.1).
표 5.1.1. PCR 증폭 효율이 우수한 28종 초위성체 마커 정보 리스트
Name PCR product(bp) Sequence
ABB222 108-128
F:GCATGGTTGCACCAACTACA R:CAGGGGAAAAACATAAAAGTGA
ABB413 150-166
F:TCTCTGCATTCTTTCCAGCA R:GGAAAGCGTTCGATGTCATT
ABB206 193-213
F:CCATTGTTTGAAGGCCTGAC R:CCAGAGAATCATCCCAAAAGA
ABB205 132-162
F:CAGTGAGCCCACAAAAACATT R:TGGCTGACCACATGTTCATT
ABB308 222-240
F:CTTAGGAGGCTGCTGTGAGC R:CCAGTGAAGCTATCTGGTTCTG
ABB601 275-287
F:TGGACAACAGCAGTGCAGTAA R:GAAAACCAACAGGCATCCAT
ABB401 111-139
F:GCCAAGACATAGAAACAATGTGG R:TGGCAGGATTTCCTTCTTTT
ABB201 189-205
F:TGTTCCCATTCATGTTCACAA R:AAGGTGGGAAACCAACCAAC
표 5.1.1. 계속
○ 15종의 MS marker를 대상으로 Gradient PCR 기기를 이용하여 55~66℃
까지 온도를 설정하였으며, 15종의 MS 마커의 증폭여부를 검증하여 마커 별 최적의 PCR 온도를 설정하였다 (그림 5.1.1).
그림 5.1.1. Gradient PCR을 이용한 15종의 MS 마커 DNA 증폭 검증 Name PCR product(bp) Sequence
ABB213 163-173
F:AATTGCAAGCATGGACAGTG R:TGCCTATTCTACACAAATGGAAA
ABB208 211-231
F:CACAAATTCCTGTGGCCAAT R:CCAAGACATGGAAGCAACCT
ABB209 283-293
F:ATCCACTTTTCTCCGTTGGA R:TGGCAATATCATTCATCTTTGTT
ABB214 129-147
F:CTGCAACAGTCAAGACATGGA R:TTGTCATAAATGGCAAAATTTCA
ABB503 183-198
F:TTTTGCCATCAGGACTCTCC R:ATTCAACTTTCCAGGCTCCA
ABB502 261-271
F:AACACGACCACCCAAGATTC R:ACGAATGCCAACCAAGGATA
ABB413 ABB601
ABB212 ABB213
그림 5.1.1. 계속
○ PCR 산물의 확인은 Agarose 전기영동 방법을 이용하여 수행하였다. 먼
ABB214 ABB206
ABB401 ABB209
ABB503 ABB222
ABB308 ABB201
ABB208 ABB205
ABB502
고 Agarose 분말 2g과 0.5X TBE buffer 100㎖를 flask 에 담은 후 Microwave oven을 이용하여 agarose가 완전히 용액상태가 되도록 서서히 가열한다. 용액을 60℃까지 식힌 후 EtBr을 최종농도 0.5㎍/㎖이 되도록 가 하고 잘 혼합한 후 Comb이 agarose가 용해된 용액을 모두 부었을 때 주형 의 밑바닥으로부터 0.5-1.0cm 정도 떨어져서 홈을 형성할 수 있도록 고정 시키고 상온에서 식힌 agarose용액을 주형에 붇는다. 이때 gel은 3-5mm정도 의 두께가 되게 하고 기포가 생기지 않도록 주의한다. 상온에서 20-30분 동안 정체하여 Agarose gel이 완전히 굳은 후 comb을 제거하고 gel을 electrophoresis tank로 옮겨 담고 Loading dye 2㎕에 PCR product 5㎕를 혼합
한 후 pipet을 이용하여 gel 홈에 조심스럽게 분주 후 DNA가 양극 쪽으로
(- → +) 이동해 갈 수 있도록 도선을 연결하고, 전극간의 거리 1cm당 1-5V의 전압을 가한다. Electrophoresis가 끝나면 전기를 끄고 도선을 제거 한 후 Agarose gel을 자외선 하에서 관찰하여 PCR 산물을 확인한다(그림 5.1.2).
그림 5.1.2. Agarose gel 전기영동 방법 모식도
○ PCR의 원리는 기본적으로 DNA 복제의 과정에서 나타나는 일련의 과 정에 바탕으로 두고 있다. 즉, DNA 복제와 마찬가지로 주형은 DNA를 사 용하며, DNA 복제과정 초기에 나타나는 두 가닥의 분리와 합성과정에서 분리된 두 가닥의 유지는 그에 적당한 온도를 적용함으로서 가능하다. 또 한 복제과정에서 프라마제에 의해 제공되는 프라이머는 인위적으로 실험자 가 제작하여 첨가하고, DNA 중합효소 대신에 일반적으로 PCR에 사용하는
Taq DNA 중합효소를 첨가하여 주면 DNA 복제과정과 동일한 결과를 얻을
수 있는 것이다. PCR의 장점은 크게 두 가지로 말할 수 있다. 첫째는 전체 DNA를 주형으로 사용하지만 실험자가 원하는 표적영역만을 선택적으로 증폭할 수 있다는 것이다. 이를 이해서는 그 표적영역에 대한 염기서열 정 보를 조금이라도 알고 있어야 하며, 그 정보를 이용하여 표적영역의 양 끝 에 결합할 수 있는 한 쌍의 프라이머를 인위적으로 제작하여 첨가해야만 우리가 원하는 표적영역만을 증폭할 수 있다. 둘째는 상당히 많은 양의 DNA 절편을 얻을 수 있다는 것이다. 증폭에 필요한 모든 요소들을 첨가한 후의 초기 합성은 다른 쪽 프라이머에 상보적인 서열을 지나치며 일어나지 만 연속적인 반응에 따라 양쪽 프라이머에 의해 합성된 DNA 절편의 양이 지수적 (2n)으로 증가하게 된다.
○ PCR은 온도에 따라 변성 (denaturation), 프라이머 결합 (annealing), DNA 합성 (extension) 과정이 하나의 주기를 이루어 반복되는데, 그림 5.1.3은 각 과정에서 나타나는 현상들을 부여주고 있다. 먼저 변성 단계에서는 온도를 올려서 DNA 이중가닥을 분리시켜 단일가닥을 생성한다. DNA의 당-인산골 격은 공유결합인 인산디에스테르 결합으로 되어 있기 때문에 염기 사이의
온도에서 분리된 단일가닥에 각각의 프라이머가 특이적으로 결합한다. 마 지막으로 DNA 합성 단계에서는 효소반응조건의 최적온도에서 DNA 중합 효소에 의해서 프라이머로부터 신장반응이 일어난다. 이 세 단계를 20~30 회 정도 반복해서 반응시키게 되면 우리가 원하는 많은 양의 표적 DNA 절편을 얻을 수 있다.
그림 5.1.3. 표적 DNA 증폭을 위한 PCR의 원리
○ PCR을 사용한 DNA의 표적영역의 증폭에 있어서 일반적으로 사용되는
반응조건은 그림 5.1.4에서 확인할 수 있으며, 조금 더 세부적인 사항들을 설명하고자 한다. DNA의 변성은 높은 온도일수록 잘 일어나지만, Taq
DNA 중합효소 역시 높은 온도에서는 활성이 떨어질 수 있기 때문에 보통
94~96℃에서 30~60초로 반응시켜 이중가닥을 단일가닥으로 분리시킨다. 그
러나 최초의 변성단계는 확실한 변성을 유도하기 위해서 약 2~5분간 시간 을 주어야 하지만 보통 2분을 사용한다.
○ 프라이머 결합반응은 PCR에 있어서 매우 민감한 반응이며 최종적인 결 과에 제일 중요하게 작용한다. 이 반응의 온도는 프라이머의 길이, G-C 함 량, 그리고 pH 및 이온농도 등 많이 인자들의 영향을 받는다. 하지만 보통 프라이머 길이와 G-C 함량을 가지고 적당한 온도를 설정한다. 현재 프라이 머의 서열정보는 주면 제작사를 통하여 손쉽게 제작할 수 있으며, 제작사 를 통하여 적절한 온도를 받아볼 수 있다. 일반적으로 제작사가 권장하는 결합온도인 Tm (melting temperature) 온도에서 ± 2℃ 정도에서 조건을 잡는 다. 또한 이 단계에서의 시간은 보통 30~60초 동안 진행하게 되면 무난하 다. 마지막으로 DNA 합성은 일반적으로 72~74℃에서 시행된다. 하지만 시 간은 PCR 산물의 크기에 따라 다소 달라진다. Taq DNA polymerase가 1분 에 약 2,000~4,000 뉴클레오티드를 합성할 수 있다고 알려져 있기 때문에 PCR 산물의 크기가 1 kb 미만일 경우에는 30~60초로, 그리고 1 kb 이상일 경우에는 1 kb 당 1분 정도로 반응하면 충분하다. 또한 최종 합성단계에서 는 시간을 5~10분 정도로 시간을 주어 충분한 합성을 유도하다.
그림 5.1.4. PCR 반응에 대한 시간 및 온도
5.2. MS 마커의 Multiplex PCR 조건 확립
○ 15종의 초위성체마커의 정방향 Primer에 형광 표식 물질(FAM, VIC, NED 그리고 PET)을 부착하여 Primer를 제작하였고 형광 표시물질이 부착 된 15종의 MS 마커 Primer를 이용하여 각각의 마커를 적정 비율로 함량을 조절하여 Primer Mix 조합 설정한 후 Multiplex PCR을 위해서는 1회에 증 폭시키고자 하는 Primer들의 미세한 함량 조절과 적절한 PCR 온도 등을 설정하였다 (표 5.2.1).
표 5.2.1. 15종의 MS 마커 정보 리스트
No. Name Label Repeat Motif PCR product(bp)
1 ABB413 FAM GTTT 150-166
2 ABB601 FAM TGTTTT 275-287
3 ABB212 FAM AC 245-263
4 ABB213 FAM GT 163-173
5 ABB214 FAM CA 129-147
6 ABB206 VIC CA 193-213
7 ABB401 VIC TGTC(TATC) 111-139
8 ABB209 VIC CA 283-293
9 ABB503 VIC CAATA 183-198
10 ABB222 NED GT 108-128
11 ABB308 NED CAA 222-240
12 ABB201 NED CA 189-205
13 ABB208 NED TG 211-231
14 ABB205 PET AC 132-162
5.3. Multiplex PCR을 이용한 개체별 대립유전자형 분석
○ Multiplex-PCR을 수행 후 PCR 산물을 ABI Prism○R 3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems, USA)을 이용해 전기영동하고, GeneMapper○R version 4.0(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 크기와 표식자별로 분류한 후 Microsoft Excel(Microsoft, USA)을 이용하여 자료를 취합하였다.
○ ABI Prism○R 3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems, USA)를 이용한 대립유전자형 분석 방법은 PCR 반응이 끝난 PCR 산물을 적정량 희석시켜 96 well plate에 순서대로 deionized formamade와 1:10 비율로 섞은 것을 10
㎕씩 분주한다. 분주 후 96 well plate를 PCR 증폭기기에 장착하여 95℃에 서 2분간 denaturation 시킨 후 96 well plate set을 조립하여 Ice에 5분간 정 체시킨다. Plate set의 장착은 septa와 sample plate를 결합한 다음 plate base 와 결합하고, 마지막으로 plate retainer를 결합한다.
그림 5.3.1. 96 well plate set 조립 순서
○ 결합된 Plate는 ABI 3130XL Genetic Analyzer 장착하고 Spectral calibration을 확인 후 sample 정보란으로 이동하여 분석할 각 샘플의 위치 를 설정하고, dye set, 저장 folder를 지정한 후 분석을 실시한다(그림 5.3.2).
○ 표 5.3.1은 기존 ABB222, ABB413, ABB206, ABB205, ABB308, ABB601, ABB401, ABB201, ABB212, ABB213, ABB208, ABB209, ABB214, ABB503, ABB502 15종 MS 마커에 대해 ABI 3130XL Genetic Analyzer로 분석한 결 과이다.
표 5.3.1. 기존 15종의 MS 마커를 이용한 대립유전자형 분석결과
ID 201 205 206 208 209 212 213 214 222 308 401 413 502 503 601
RM01 193 205 152 152 195 209 223 227 283 283 248 254 165 167 131 141 114 114 222 234 111 131 150 162 266 266 183 193 281 287 RM02 191 191 132 132 201 211 209 223 285 289 248 254 163 165 129 141 110 118 225 228 127 131 150 162 266 266 183 188 281 281 RM03 193 193 132 152 209 211 209 223 283 283 248 250 163 173 133 141 114 114 222 222 127 127 150 162 266 271 183 193 281 281 NM-12 191 205 132 152 209 209 211 231 285 285 254 258 163 163 141 141 118 118 222 231 115 127 154 162 266 266 188 193 281 281 NM13 191 205 152 162 195 209 209 229 285 285 258 258 163 163 141 141 114 118 222 231 115 127 162 162 266 271 188 188 281 281 NM-14 191 203 150 150 205 205 211 227 285 293 254 254 165 165 129 131 114 116 222 228 131 131 158 162 266 266 183 183 275 281 RM-15 193 193 158 160 209 211 211 211 283 287 254 256 171 173 129 133 110 120 234 240 127 131 150 162 271 271 188 193 281 281 RM199 191 201 132 132 209 209 209 209 285 291 258 258 163 163 129 141 110 110 225 234 131 131 158 158 261 266 183 188 275 287 KM-29 191 191 132 158 201 211 211 223 285 289 248 254 163 165 129 141 110 118 225 228 127 131 150 162 266 266 183 188 281 281 KM-30 191 191 132 158 211 223 285 289 248 254 163 165 129 141 110 114 222 228 131 131 158 162 261 266 183 188 275 275 KM-32 191 205 152 154 193 209 223 223 283 293 248 254 163 167 131 141 114 114 222 234 150 150 266 266 183 188 275 281 CM39 191 195 154 154 205 209 223 223 283 285 248 260 171 173 141 141 108 116 225 231 111 119 158 158 266 271 188 198 281 287 KM-40 191 191 132 152 211 227 285 289 248 254 163 165 129 141 110 114 222 231 127 139 158 162 266 266 183 193 281 281 KM-41 191 191 152 158 195 205 211 223 285 285 248 254 163 165 110 118 225 228 127 131 158 162 261 266 183 188 275 281 KM-42 191 193 132 158 209 211 211 211 283 291 254 256 163 173 129 141 110 110 225 225 123 131 150 158 261 271 183 193 275 281 KM-43 193 205 152 152 201 213 211 229 283 291 244 258 171 171 133 141 114 114 225 240 127 139 150 154 261 271 188 188 275 275 KM-45 191 205 152 152 209 209 223 229 283 293 254 254 165 173 131 141 114 114 222 234 111 131 150 150 266 266 188 193 275 287 KM-46 191 205 152 152 195 209 223 223 283 285 248 254 163 165 131 141 114 118 234 234 131 131 150 150 266 266 193 193 275 287 KM-51 183 193 132 152 213 213 211 225 285 285 254 258 163 163 133 141 114 114 222 222 131 131 150 150 261 271 183 193 275 287 KM-53 195 197 136 154 205 209 223 223 283 293 250 262 169 171 133 133 108 108 222 225 119 127 150 158 266 271 188 193 281 287 KM-54 195 197 136 154 205 209 223 223 283 293 248 260 169 171 133 147 108 108 222 225 111 127 150 158 266 271 188 193 281 287 KM-55 193 193 152 158 209 209 211 225 283 287 258 258 161 163 141 141 110 110 222 225 131 139 150 158 261 271 183 193 275 287 KM-57 191 201 132 152 201 201 223 223 285 289 248 254 163 173 129 133 110 120 222 234 131 131 150 162 261 261 183 183 275 275 UM11 191 205 152 152 201 211 225 229 285 291 244 258 163 163 133 141 114 114 225 240 135 139 150 150 261 271 188 193 275 275 UM12 191 191 132 158 201 211 211 223 285 289 248 254 163 165 129 141 110 118 225 228 127 131 150 162 266 266 183 188 281 281 UM13
(KM61)
191 193 132 152 201 211 211 211 283 287 244 258 173 173 133 141 114 114 225 240 127 131 150 150 271 271 183 188 275 281
표 5.3.1. 계속
ID 201 205 206 208 209 212 213 214 222 308 401 413 502 503 601
UM14 193 201 132 152 209 213 225 229 283 285 248 258 163 163 141 141 110 110 225 240 131 135 150 162 261 271 183 188 275 281 UF15 191 193 132 152 211 211 211 225 285 287 258 258 163 173 133 141 114 118 234 240 131 135 150 150 261 271 188 193 275 281 UM16 191 193 132 158 209 211 211 211 283 291 254 256 163 173 129 141 110 110 225 225 127 131 150 158 261 271 183 193 275 281 UM17 191 205 132 152 201 211 211 229 283 285 244 258 171 173 133 133 114 114 225 234 135 139 150 154 261 271 188 193 275 281 NM106 191 191 152 152 209 209 223 227 285 291 258 258 165 165 129 131 114 114 234 240 127 131 150 162 261 271 188 193 275 275 RF-04 191 191 152 154 209 209 223 229 285 293 254 256 163 173 131 141 114 118 222 234 123 131 150 150 261 266 188 193 275 275 RF-05 191 193 132 152 211 211 211 225 285 287 258 258 163 173 133 141 114 118 234 240 131 135 150 150 261 271 188 193 275 281 NF-08 191 201 132 152 211 211 211 229 285 285 248 254 163 165 131 133 114 114 127 131 271 271 188 193 275 287 RF-18 193 193 158 160 211 211 211 211 283 287 254 258 173 173 133 141 110 120 115 127 150 162 271 271 193 193 275 281 RF-21 201 201 132 152 203 211 211 229 289 293 248 254 163 173 129 133 110 120 222 225 111 131 150 150 261 271 193 193 275 287 RF-22 193 193 132 152 209 211 211 229 283 285 250 250 163 163 129 129 110 110 225 240 123 127 158 162 188 193 275 275 RF-23 193 193 132 152 209 211 211 229 283 285 250 250 163 163 129 129 110 110 225 240 123 127 158 162 271 271 183 188 275 281 RF-25 201 201 132 152 195 201 211 229 285 289 248 254 163 173 141 141 110 120 222 231 131 135 162 162 261 271 188 193 281 287 KF-27 191 201 152 152 211 211 211 211 285 291 254 254 165 173 131 141 114 118 222 225 127 131 150 154 261 271 188 193 275 275 NF-28 191 201 132 152 195 201 211 229 248 254 163 165 131 133 114 114 222 231 127 131 154 162 271 271 188 193 275 287 KF-31 191 191 132 132 207 207 291 293 258 258 171 171 129 141 110 110 222 231 135 135 158 162 266 271 193 193 281 287 KF-34 193 201 132 160 209 211 211 211 285 287 258 258 163 171 141 141 110 120 234 234 115 131 158 162 261 271 188 193 275 281 CF-36 193 203 132 158 205 205 223 227 285 293 248 254 163 171 141 141 114 114 225 234 127 131 162 162 266 271 183 193 275 281 CF37 191 197 152 152 195 205 211 223 291 293 258 258 165 169 129 133 108 110 222 237 127 131 146 150 266 271 193 198 275 287 CF38 189 191 152 154 211 211 215 223 283 291 248 260 169 173 139 141 110 114 234 240 111 127 158 166 261 261 188 193 275 287 KF-47 193 201 132 160 209 211 211 211 285 287 258 258 163 171 141 141 110 120 234 234 115 131 158 162 261 271 188 193 275 281 KF-48 193 201 152 152 201 209 223 229 285 293 248 258 163 171 129 133 110 120 222 222 131 131 150 150 261 271 183 193 275 287 KF49 193 201 152 152 201 209 223 229 285 293 248 258 163 163 129 133 110 120 222 222 131 131 150 150 261 271 183 193 275 287 KF-50 193 201 152 152 201 209 223 229 285 293 248 258 163 163 129 133 110 120 222 222 131 131 150 150 261 271 183 193 275 275 KF-52 193 201 152 152 201 213 223 225 283 289 248 258 163 173 129 133 114 120 222 222 131 131 150 150 261 271 183 193 275 275 KF-58 193 193 132 150 205 209 211 211 285 285 163 165 129 129 110 114 225 228 127 131 162 162 266 271 183 188 275 281 KF-59 191 193 132 132 205 209 211 229 248 256 163 171 129 141 110 114 222 240 111 131 150 162 271 271 183 188 275 281
○ 총 57개의 샘플을 이용하여 15종의 초위성체 마커를 이용해 대립유전자 형을 분석한 결과 마커별 다형성지수인 heterozygosity(HExp)와 polymorphic information content(PIC)를 CERVUS 3.0.6을 이용하여 분석하였다(표 5.3.2).
표 5.3.2. CERVUS program을 이용한 대립유전자형 분석결과
Locus k N HObs HExp PIC
ABB201 9 57 0.649 0.756 0.711
ABB205 8 57 0.684 0.695 0.64
ABB206 9 55 0.655 0.78 0.743
ABB208 8 55 0.691 0.746 0.701
ABB209 6 55 0.836 0.774 0.737
ABB212 9 56 0.714 0.773 0.729
ABB213 7 57 0.702 0.721 0.676
ABB214 6 56 0.714 0.705 0.65
ABB222 6 57 0.561 0.73 0.679
ABB308 7 55 0.764 0.785 0.746
ABB401 8 56 0.786 0.723 0.682
ABB413 6 56 0.625 0.68 0.616
ABB502 3 55 0.655 0.662 0.582
ABB503 4 57 0.86 0.676 0.6
ABB601 3 56 0.679 0.637 0.555
5.4. 추가적인 미확인 개체 식별을 위한 MS 마커 Primer Set 제작
○ 15종의 MS 마커를 활용함에도 개체수의 증가 등의 원인으로 인한 미확
인 개체의 출현으로 인하여 기존의 Set의 개선이 필요하다고 판단이 되어 추가적인 MS 마커 선발을 수행하였다. 기존 15종의 MS 마커 중 5종을 추
가 선발하였다 (그림 5.4.1 ~ 5.4.5).
그림 5.4.1. 기존 15종 MS 마커 외 추가 MS 마커 (ABB307)
그림 5.4.2. 기존 15종 MS 마커 외 추가 MS 마커 (ABB306)
그림 5.4.3 기존 15종 MS 마커 외 추가 MS 마커 (ABB203)
그림 5.4.4. 기존 15종 MS 마커 외 추가 MS 마커 (ABB211)
그림 5.4.5. 기존 15종 MS 마커 외 추가 MS 마커 (ABB207)
○ 이후 분석을 진행함에 있어 용이하게 사용할 수 있도록 2개의 Primer
을 위한 Touch-down PCR의 조건을 재확립하여 수행하였다.
표 5.4.1. 추가 미확인 개체 식별을 위한 1번 Primer Set
그림 5.4.6. 형광 표식 물질을 부착한 1번 Primer Set의 모식도
No. Name Lable Repeat Motif
PCR product(bp)
1 ABB222 FAM GT 108-128
2 ABB206 FAM CA 193-213
3 ABB212 FAM AC 245-263
4 ABB205 VIC AC 132-162
5 ABB308 VIC CAA 222-240
6 ABB601 VIC TGTTTT 275-287
7 ABB214 NED CA 129-147
8 ABB502 NED TGTTT 261-271
9 ABB401 PET TGTC(TATC) 111-139
10 ABB209 PET CA 283-293
표 5.4.2. 추가 미확인 개체 식별을 위한 2번 Primer Set
No. Name Lable Repeat Motif
PCR product(bp)
11 ABB413 FAM GTTT 150-166
12 ABB306 FAM ATA 229-244
13 ABB307 VIC TTG 137-155
14 ABB503 VIC CAATA 183-198
15 ABB207 VIC CA 292-306
16 ABB201 NED CA 189-205
17 ABB203 NED AT 238-258
18 ABB213 PET GT 163-173
19 ABB208 PET TG 211-231
20 ABB211 PET TA 320-334
표 5.4.3. 기존 15종 MS 마커에 추가된 20종 MS 마커 Touch-down PCR 조건
5.5. 성 판별 마커 분석 조건
○ 반달가슴곰 새끼는 생후 1년생에는 거의 어미곰과 같이 행동하는 특성 을 보여, 유전자 분석을 위한 시료 채취 자체가 쉽지 않고, 육안이나 무인 카메라에 의한 관찰만으로는 미성숙한 개체의 성 판별이 용이하지 않다.
따라서 분자적으로 성을 판별할 수 있는 SRY 유전자(196-bp)와 ZFXY 유전 자(수컷, 178/182-bp; 암컷, 182-bp)의 증폭 양상을 비교하였다.
○ 본 연구팀은 20종의 MS 마커와 동일한 조건으로 Gradient PCR을 진행
Temperature(℃) Time Cycle(repeat)
95 15 min 1
94
1 Step
1 min
5
61 1 min 15 sec
72 1 min
94
2 Step
1 min
5
60 1 min 15 sec
72 1 min
94
3 Step
1 min
59 1 min 15 sec 25
72 1 min
65 30 min 1
4 ∞ -