C1 생물전환 관련 원천 효소 및 균주 개발 세부과제명 CO를 이용한 2,3-BDO 생산을 위한 Acetogen 균주 개발. 국내외 기술개발현황은 연구개발계획서에 기재된 내용으로 대체함.
국가과학기술정보시스템 구매기관에 등록된 연구대상/장비 현황 연구대상/. 형질전환 방법 및 효율 향상 : Conjugal transfer를 통해 구축된 shuttle plasmid의 삽입 확인, DNA methylation을 핵심 인자로 규명, electroporation을 통해 형질전환 효율을 102 ~ 103 CFU/μg DNA 수준으로 향상. 연구개발 성과 활용방안(기대효과)
사업단 세부과제에서 대상균주를 대상으로 하는 본 사업의 수립을 위한 유전자 툴박스의 활용 확대에 기여할 수 있다. 프로젝트 그룹의 정제소 관리자를 위한 세부 작업의 발효 공정 개발에 대한 노하우를 제공할 수 있습니다.
연구개발과제의 개요
세부 목표 연구 분야 유전자 도구 상자 개발, acetogen 벡터 개발, 변환. 무작위 돌연변이 균주의 게놈 분석, in silico 대사 흐름 분석. 게놈 시퀀싱 및 돌연변이 분석, 영양 요구 등
연구수행내용 및 성과
LBFA 배지에 플레이팅한 후 콜로니 형성을 관찰하였다. Ÿ 항생제로는 polymyxin B(100 IU/mL)를 E. coli counterselection에 사용하였고 thiamphenicol(5 μg/mL)을 transconjugant selection에 사용하였다. 또한, pIM13 레플리콘의 pKLJM008은 접합에 의해 도입되지 않았음을 확인하였다.
Ÿ 본 연구에서는 AWRP 균주의 pyrF sequence에 따라 pMTL007 유전자를 re-targeting한 후 도입하여 결함 균주를 선별하였다. 균주를 원심분리에 의해 수집하고 티암페니콜을 함유하는 고체 LBFA 배지에 플레이팅하였다. 모든 공정은 혐기성 챔버에서 수행되었습니다.
Ÿ 추출된 genomic DNA를 이용하여 Illumina HiSeq을 이용한 NGS를 수행하였다. 돌연변이 균주는 야생형 균주에 비해 CO 내성이 개선되었기 때문에 모의 합성가스 대신 100% CO를 2.0 bar로 채웠다. 바이알을 30℃ 및 180 RPM의 진탕 배양기에서 성장시키고 종자 배양으로 사용하였다. 채워진 바이알은 종자 배양과 동일한 방식으로 진탕 배양기에서 30℃, 180 RPM에서 성장시켰다.
Ÿ 이 배양은 20mL의 PETC-MES 배지가 들어 있는 160mL 혈청 바이알에서 이중으로 수행되었습니다. 채워진 바이알은 종자 배양과 동일한 방식으로 진탕 배양기에서 30℃, 180 RPM에서 성장시켰다. 본 실험에서는 각 미량원소의 함량 증가로 발효 패턴의 변화를 확인하였다.
Ÿ 플럭스 계산은 CO 흡수 조건에서 세 가지 목적 함수(바이오매스, 2,3-부탄디올, 에탄올)에 대해 수행되었습니다. 13) AWRP 균주의 배양 패턴을 관찰하였다. 환원제로 L-Cysteine․HCl을 최종농도 0.5g/L로 사용하였다.
채워진 바이알을 시드 배양과 동일한 방식으로 진탕 배양기에서 30℃ 및 150 RPM으로 배양하였다. Ÿ 바이알 배양 결과를 바탕으로 2L 규모의 배양기에서 RM 배지의 조성을 일부 조정한 RMv2 배지를 사용하여 AWRP 균주의 배양을 관찰하였다. 따라서 실리콘이 아닌 고무로 된 튜브를 대체하여 가스발효를 진행하였다.
Ÿ RMv4 배지(표 4)를 이용하여 추가 배양 실험을 수행하여 배지에 아세트산나트륨이 없는 경우의 배양 결과를 확인하였다(도 31).
목표 달성도 및 관련 분야 기여도
국내에서 분리된 아세토겐 균주에 대한 유전공학이 가능한 수준까지 기술을 개발하는 것은 의문의 여지가 없습니다. 이 프로젝트를 통해 개발된 기술은 잠재적으로 다른 초산 생성 균주에 적용될 수 있습니다. 전기천공법에 의한 아세토겐 형질전환 기술은 유전공학에서 기본적이고 필수적인 과정이지만 많은 경우 어려운 문제이며, 본 프로젝트에서는 이를 개선하기 위한 방법을 개발하였다.
응용 분야는 모든 혐기성 미생물로 확장될 수 있습니다. 유용한 균주 및 재조합 표적 유전자 제공 환경의 미량 금속 조성에 따라 배양 및 대사체 프로파일이 크게 달라지는 것을 확인하였다.
무작위 돌연변이 균주의 게놈 시퀀싱에 의한 효과적인 변이체 조사. 2,3-BDO 생합성의 전구체인 pyruvate의 생합성이 가능한 대사 경로 비교 및 in silico 대사 흐름 분석을 통한 과발현 유전자 탐색. 인큐베이터 운영 및 스케일업이 용이한 시스템 구축 CO를 함유한 기체로 성장하는 혐기성 미생물을 연구하는 국내 연구기관은 많지 않습니다.
특히 아세토겐 균주를 발효조 수준의 발효를 수행하는 기술을 보유한 연구기관은 많지 않으나, 많은 연구지식을 보유하고 있어야 기술을 제공할 수 있다.
연구개발성과의 활용 계획 등
참고 문헌
연구목표 달성도 (종합)
