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저작자표시-비영리-변경금지 2.0 대한민국 이용자는 아래의 조건을 따르는 경우에 한하여 자유롭게 l. 이 저작물을 복제, 배포, 전송, 전시, 공연 및 방송할 수 있습니다.. 다음과 같은 조건을 따라야 합니다:. 저작자표시. 귀하는 원저작자를 표시하여야 합니다.. 비영리. 귀하는 이 저작물을 영리 목적으로 이용할 수 없습니다.. 변경금지. 귀하는 이 저작물을 개작, 변형 또는 가공할 수 없습니다.. l l. 귀하는, 이 저작물의 재이용이나 배포의 경우, 이 저작물에 적용된 이용허락조건 을 명확하게 나타내어야 합니다. 저작권자로부터 별도의 허가를 받으면 이러한 조건들은 적용되지 않습니다.. 저작권법에 따른 이용자의 권리는 위의 내용에 의하여 영향을 받지 않습니다. 이것은 이용허락규약(Legal Code)을 이해하기 쉽게 요약한 것입니다. Disclaimer. 약학석사학위논문. Botanical Origin of ADENOPHORAE RADIX 사삼의 식물학적 기원에 관한 연구. 2014 년 1 월. 서울대학교 대학원 천연물과학전공. 남. 은. 혜. 요 약. 사삼의 식물학적 기원에 관한 연구 서울대학교 대학원 천연물과학 전공 남은혜. 사삼은. 초롱꽃과에. 속하는. 잔대. Adenophora triphylla var.. japonica Hara 또는 당잔대 A. stricta Miquel의 뿌리를 사용하며, 한의학 에서는 주로 양음, 청폐의 목적으로 사용되는 약재이다. 그러나 많은 고문 헌에서는 사삼의 기원 식물을 더덕 Codonopsis lanceolata Trautv으로 기 록하고 있고, 이로 인해 기원 식물에 대한 문헌적 혼란이 계속 되어왔으며, 현재는 이 혼란이 유통과정에도 이르고 있어 사삼의 기원식물에 재정립이 요구되고 있다. 따라서 본 연구에서는 진화 속도가 빠른 nuclear ribosomal DNA 의 internal transcribed spacer (ITS)를 이용하여 현재 사삼이란 이름으로 유통되고 있는 약용식물들의 정확한 진위 여부를 감별하고, 또 그 유사 생 약들과의 계통학적 유연관계에 대한 규명을 시도하였다. 또한, 2차적으로 i. 해부학적 분석법을 실행하여 식물의 내부 구조와 조직계를 파악함으로써 DNA 분석법에 의한 결과에 근거를 제시, 또는 보완하고자 하였다. 그 결과 ITS 1의 크기는 218-293 bp, ITS 2는 217-272 bp로 나타났으며, G+C 함량은 평균 57.2%의 수치를 보였다. 한편, 사삼으로 가 장 많이 유통되고 있는 것은 최근에 개정된 공정서에 고시된 것과 같이 A.. triphylla var. japonica 와 A. stricta 종이 가장 많은 것으로 나타났고, 이 들의 종간 변이율은 1.0-3.0%이며, 이 밖에도 몇 개체의 약재가 사삼의 위품으로 증명되었다. 또한, 사삼의 기원이라 기재된 더덕은 잔대속 보다는 도라지속과 단계통군으로 유집되어, 이 두 속이 오히려 더욱 밀접한 유연관 계를 가지고 있음이 나타났다. 따라서, 본 연구는 ITS 구간이 사삼으로 유통되고 있는 약재의 감 별에 매우 효율적으로 사용될 수 있을 것으로 판단하며, 본 연구에서 수행 한 사삼의 분자 계통학적 연구 결과 또한 한약재의 규격화와 표준화에 이바 지 할 수 있을 것이라 기대한다.. Key words: 사삼, Adenophora, 더덕, DNA분석법, nuclear ribosomal DNA, ITS Student Number: 2012-21582. ii. 목 차. 요 약 …………………………………………………………..……………… i 목 차 …………………………………………………….………….………… iii LIST OF TABLES ……………………………………………………………… v LIST OF FIGURES ……………………………………………………….…… vi. I. 서. 론 ……………..………………………………………….………........ 1. II. 재료 및 방법 ………….………………..……………………………...…... 7. 1. 재 료 ………………………………………………………………. 6. 2. 방 법 …………...………………………………………………….. 13. 2-1. DNA의 추출 …………….………………………………….... 13. 2-2. PCR 증폭 및 정제 …………………………………….……. 14. 2-3. 염기서열 및 계통학적 분석 …………………….………….. 18 2-4. 해부 구조 관찰 ………………………………………………... 21. III. 결. 과 …………………….………………………..………………….... iii. 24. 1. 계통학적 비교 분석 …………………………………………….. 22. 1-1. 염기서열 및 변이 분석 ………………………..………….... 22. 1-2. 분지 분석 …………………….…………………………….... 37. 2. 해부학적 형질 분석 ……….……………………………………. 40. IV. 고. 찰 ……………………………………………………………………. 46. V. 참고문헌 …………………………………………………….……………. 49. 영문 초록 ……………………………………………………………………. 56. iv. LIST OF TABLES. Table 1. Materials list of Adenophora radix used in this study. Table 2. Materials list for comparative analysis. Table 3. sequence of primers used in this analysis. Table 4. The sequence of primers used in this analysis. Table 5. Accession numbers & DNA source information for ITS sequences in the GenBank. Table 6. TBA dehydration steps. Table 7. The divergence rates between each sect.. v. LIST OF FIGURES. Fig. 1. Crude drugs used as Adenophora radix. Fig. 2. Structure of ITS regions for the analysis and their primers for PCR amplication. Fig. 3. Aligned sequences of ITS 1 regions from 65 taxa. Fig. 4. Aligned sequences of ITS 2 regions from 65 taxa. Fig. 5. The 50% majority-rule consensus tree of most-parsimonious 893 trees based on ITS. sequences resulting from the combined phylogenetic analysis of the. SSU and LSU rDNA for the 65 taxa. Fig. 6. Transverse section of roots of the Adenophora species. Fig. 7. Transverse section and longitudinal section of Adenophora radix. Fig. 8. Transverse section of roots of crude drugs used as Adenophora radix.. vi. Ⅰ. 서론 오늘날에는 동양뿐만 아니라 세계 각 국에서도 자연치료에 대한 관 심과 이해가 높아짐에 따라 한약재 또한 새로운 치료 의약으로 각광을 받 게 되었다. 더욱이 우리나라에서는 최근 몇 년 동안 기능성 식품 소비의 증가와 함께 한약재에 대한 수요가 급격하게 증가하고 있음에도 불구하고, 품질 규격화에 대한 기준 미확립과 범람하는 외국산 약용작물 등의 영향으 로 약재의 오인과 오칭이 발생하고, 또 이로 인해 유통과정에서의 혼재와 오용에 당면해 있는 것이 사실이다.1-5) 본 연구대상 한약재인 사삼은 이러한 문제로 화두에 오르는 대표적 인. 약재이다.. 우리나라의. 공정서에. 사삼은. 초롱꽃과에. 속한. 잔대. Adenophora triphylla var. japonica HARA 또는 당잔대 A. stricta Miquel 의 뿌리라고 기재되어 있으며, 한의학에서는 주로 양음, 청폐의 목적으로 사용되는 약재이다. 6,7) 초롱꽃과는 Jussieu (1791)에 의해 처음 과가 설정되었으며,8) 분 류체계에 관해서는 de Candolle (1830)이 21속 234종을 기재한 것을 시초로 하여,9) 그 이후 많은 학자들의 정립이 이루어져 왔고,10-14) 전 세 계에 약 70속 2,000여 종이 북반구의 온대지역을 중심으로 넓게 분포함 이 보고되었다.15) 우리나라의 초롱꽃과에 관해서는 Oh (1981)가 9속 29 종 19변종 12품종으로, 총 60종류가 자생하는 것으로 정리하였고, Yoo (1995)는 외부형태학적 형질과 RAPD 분석 등을 수행하여 8속 25종 9 1. 변종 8품종으로 정리한 바 있다.16,17) 현재 2012년에 개정된 우리나라 공정서에는 위와 같이 사삼으로써 의 약용 식물이 A. triphylla var. japonica 와 A. stricta 종으로 명시 되 어 있지만, 개정이 되기 전, 사삼은‘잔대와 기타 동속근연식물의 뿌리’ 라고. 기재되어. 있었으며,. 더불어. 잔대와. 동속식물인. 모시대. A.. remotiflorus Miquel 의 뿌리를 제니의 약명으로 별도로 정의하고 있었 다. 잔대속은 초롱꽃과 내에서 점진적 분화 과정을 통해 가장 최근에 분 지된 속으로, 종내 변이가 심하고, 계속해서 종 분화를 활발히 일으키고 있다고 보고된 바가 있으며,17,18) Lee (1994)는 이전 연구들을 종합해 우 리나라에만 총 40여종의 잔대속 식물이 자생하고 있다고 정리하였다.19) 이 뿐만 아니라, 사삼이 우리나라의 경우 재배가 거의 이루어지지 않고, 전국 산야에서 자생하는 종의 채집이 유통으로 이어지고 있는 실정으로 말미암아,20) 위와 같은 개정 전 공정서의 고시는 사삼으로서의 약용 식물 범위가 모호할 뿐만 아니라, 혼란을 야기하기에 충분하다고 판단된다. 선행 연구를 통해 잔대속에 속한 사삼 A. triphylla var. japonica 와 A. stricta, 제니 A. remotiflorus 의 외부 형태를 살펴보면, 이들은 종모양의 통꽃으로 끝이 5개로 갈라지는 꽃부리를 갖고 있는 등 굉장히 형태적으로 유사하나, 몇 가지 차이를 확인할 수 있는데, 외부형태에 관 한 세부 내용은 Table 1과 같다. 고문헌인 향약집성방(1433)과 동의보감(1613)을 비롯한 많은 문 헌에서 사삼의 기원 식물을 더덕으로 기록하고 있음을 이전 연구를 통해 2. 서 알 수 있고, 중국의 공정서에는 북사삼이라 하여 우리나라의 해변에 자생하며 산형과에 속하는 갯방풍 Glehnia littoralis Miquel 을 수재하고 있는 등 사삼의 기원 식물에 대한 문헌적 혼란이 계속 되어왔다.20-24) 이 로 인해 우리 나라의 실제 임상에서도 더덕의 뿌리가 사삼으로 이용되거 나 공공연히 판매되고 있는 등 이 혼란이 현재의 유통과정에 직접적으로 이르고 있어, 사삼에 대한 기원식물의 재정립이 요구되고 있다.20,23,25) 식물 계통학자들은 초기의 식물 외부 형태적 형질을 이용한 분류에 서부터 시작하여, 식물 분류학에 좀 더 확실한 계통학적 의미를 부여할 수 있는 도구를 찾기 위해 DNA의 직접적인 비교 분석에 이르렀다. DNA 를 통한 분자 계통학적 접근법은 유전 물질 자체의 직접적인 비교 분석으 로, 환경의 특성에 의해 쉽게 변이를 나타낼 수 있는 식물의 형태학적 표 현형에 의한 분류보다 재현성과 객관성이 뛰어나고, 아주 적은 양의 시료 와 단순한 과정의 실험으로 결과를 확인 할 수 있는 효율적인 방법이 다.26,45) 핵. 게놈은. 식물. 세포가. 갖고. 있는 3개의 게놈(Chloroplast,. Mitochondrion, Nucleus) 중 가장 크기가 크며(1.1 x 106–110 x 109), 양친으로 부터 유전되는 유전자이고,27) 그 중에서 Ribosomal DNA (rDNA)는 수많은 전사 단위들과 Intergenic spacer (IGS)의 반복된 배 열로 충분한 복제 서열을 가져 추출과 염기 서열의 결정이 비교적 쉽고, 구간에 따라 진화의 변이 속도가 달라서 연구에 많이 이용되는 유일한 핵 유전자이다.28,29) 18s(식물의 경우), 5.8s 그리고 26s의 Exon 사이에 존 3. 재하는 Internal transcribed spacer (ITS)는 Coding gene에 비해 변이 속도가 빠르지만, 전사되는 중요성으로 말미암아 IGS 보다는 진화의 속 도가 느리다는 장점으로 종과 속 수준 이하의 관계에서 계통을 연구하는 데 유용하게 사용되고 있다. 30-33) 하지만 DNA 분석법은 시료가 한약재라는 특성으로 고려해 볼 경 우, 고온을 이용한 건조법, 일광 건조법 등의 다양한 전처리 과정으로 부 터7) 발생될 수 있는 DNA의 변형과 미생물이나 균류의 침습으로 인한 식물체 유전자 감별의 어려움, 또는 해충에 의해 시간이 경과함에 따라 발생할 수 있는 2차적 약재의 변질 등의 문제는 한약재의 진위여부를 판 별하는데 장애요인으로 작용하기도 한다. 그래서 이러한 문제를 최소화 함과 동시에 DNA 분석법으로 인한 결과를 뒷받침하기 위하여 본 연구에 서는 해부학적 분석법을 함께 시행하였다. 해부학적 분석법은 식물의 내 부 구조와 조직계를 파악하게 하는 초 육안적인 식별로써,34) DNA 손상 을 유발할 수 있는 여러 가지 경우의 수에는 영향을 받지 않는다는 장점 이 있지만, 해부학적 분석법을 통해 식물체가 나타내는 형태학적 변이만 으로 종 수준 이하까지의 분류에는 변별력이 부족한 경우가 더러 있다. 따라서, 한약재의 감별에 이 두 분석법을 병행하면 더 신뢰성 있는 결과 를 얻을 수 있을 것이라 기대한다. 본 연구에서는 사삼이 잔대 뿐만 아니라, 앞에서 서술한 다양한 약 용 식물들의 뿌리와 함께 현재 시장에서 혼용되고 있는 점에 착안하여 이 에 대한 해답을 찾고자 시도하였다. 따라서, 잔대, 모시대, 길경, 그리고 4. 갯방풍의 비교시료와, 실제로 시장에서 사삼으로 유통 되고 있는 생약시 료들을 수집하였으며, 1차적으로 분자계통학적 분석법을 통하여 이들의 감별을 위한 분자 마커를 제시하고, 명확한 분계조로 분류함과 동시에, 2 차적으로는 해부학적 분석법을 통해서 위의 결과에 근거를 제시, 또는 보 완하고자 하였다. 이로 인해 국내에서 사삼이란 약재로 사용되는 식물과 그 근연 식물들과의 각 종, 속간 유전적 거리 및 관계를 명확히 정리함으 로써, 사삼의 기원 식물을 재확인하고, 혼재를 예방하고자 한다.. 5. Table 1. Morphological characters of Adenophora genus. (Yoo, 1994) A. triphylla var. japonica. A. stricta. A. remotiflorus. 29 – 173.7 cm. 21.7 – 140.1 cm. 29.2- 160.4 cm. Shape. campanulate, sympetalous. campanulate, sympetalous. campanulate, sympetalous. Inflorescence. Panicle. Raceme. Panicle. Scale. Length 0.7 – 1.8 mm. Length 1.1 – 3.0 mm. Length 0.9 – 3.6 mm. Breadth 0.6 – 1.6 mm. Breadth 0.7 - 1.8 mm. Breadth 0.6 – 1.6 mm. Pistil. Long pistil outside corolla. Back-rolled stigma. Cauline leaf. Verticillate(3-4 leaves). Alternate. Alternate. elliptical. long-oval. ovate, cordate. kidney-shaped. circular kidney-shaped. kidney-shaped. Height Flowers. Leaves. Radical leaf. 6. Ⅱ. 재료 및 방법. 1.. 재료. 본 연구에 사용된 시료는 잔대속 식물 3종 9개체, 길경 1개체, 그리 고 갯방풍 1개체의 비교 시료와, 시중에 사삼으로 유통되는 생약 45종을 포함하였다. 사삼은 재배 기간에 비하여 수확량이 적고, 전국적(강원도부터 제주도까지)으로 넓게 자생하고 있어서 재배보다 야생종을 채취하여 유통되 는 것이 많으며, 국산 약재의 유통 또한 많지 않아서 수입(중국)산의 비중 이 상당히 높다. 따라서, 수집된 사삼의 국내 건조 유통품은 10 종이며, 중 국산 생약은 35종으로, 상세한 정보는 다음과 같다(Table 2). 사삼의 종간 유전자 변이를 판단하기 위하여 수집한 비교 시료로서,. Adenophora triphylla var. japonica는 강원도 인제군에서 4년간 재배한 품 종을 포함하였고, Platycodon grandiflorum은 진안군에서 무농약 유기농으 로 3년간 재배하여 건조한 도라지를 포함하였다(Table 3). 사용된 시료의 증거표본은 서울대학교 약학대학 천연물과학연구소 자원식물표본관(NPRI)에 소장되어 있다(Fig. 1).. 7. Table 2. Materials list of Adenophora radix used in this study. Voucher specimen is kept in the herbarium of National Products Research Institute, Seoul Natioinal University (NPRI) Species Adenophora sp.. Abbreviation. Collection Location. Data. 12E2001. Geumsan-gun, Korea. 12E2002. Yeongju-si, Korea. 12E2003. Jeongseon-gun, Korea. 12E2004. Bonghwa-gun, Korea. 12E2005. Hongcheon-gun, Korea. 12E2006. Hongcheon-gun, Korea. 12E2007. Andong-si, Korea. 12E2008. China. 12E2009. China. 12E2010. China. 12E2011. China. 12E2012. China. 2012.01.11. 12E2013. China. 2012.02.01. 12E2014. China. 2012.03.19. 12E2015. Gamsuk, China. 2012.04.03. 12E2016. jilin, China. 2012.03.30. 12E2017. China. 2012.02.01. 12E2018. China. 2012.03.17. 12E2019. China. 2012.01.02. 2011.10.20 2012.01.05. 8. Table 2. Continued.. Species Adenophora sp.. Abbreviation. Collection Location. Data. 12E2020. China. 2012.01.03. 12E2021. China. 2012.01.04. 12E2022. China. 2012.02.28. 12E2023. China. 2012.04.27. 12E2024. China. 2012.04.27. 12E2025. China. 2012.05.07. 12E2026. China. 2012.05.08. 12E2027. China. 2012.05.08. 12E2028. China. 2012.06.05. 12E2029. China. 2012.06.05. 12E2044. Honam, China. 2012.04. 12E2045. Korea. 2012.08.24. 12E2046. Gangwon-do, Korea. 2012.08.24. 12E2047. Korea. 2012.08.27. 12E2048. China. 2012.08.09. 12E2050. China. 2012.08.24. 12E2051. China. 2012.08.27. 12E2052. China. 2012.08.27. 12E2053. China. 2012.08.27 9. Table 2. Continued.. Species Adenophora sp.. Abbreviation. Collection Location. Data. 12E2054. China. 2012.08.28. 12E2055. Jilin, China. 2012.08.28. 12E2056. China. 2012.08.30. 12E2057. China. 2012.08.30. 12E2061. China. 2012.08.13. E01. 2012.08.19. E02. 2012.08.19. E03. 2012.08.27. 10. Table 3. Materials list for comparative analysis. Voucher specimens are kept in NPRI. Species. Abbreviation. Collection Location. Data. Platycodon grandiflorum. P01. Korea. 2012.08.28. Adenophora triphylla var. japonica. 12E1001. Korea. 2012.08.28. Glehnia littoralis. 12E1002. Korea. 2012.08.30. A. remotiflorus. 12E2058. Muju-gun, Korea. 2012.08.13. A. remotiflorus. 12E2059. Muju-gun, Mt. Dugyusan, Korea. 2012.08.19. A. remotiflorus. 12E2060. Muju-gun, Mt. Dugyusan , Korea. 2012.08.19. A. remotiflorus. Mo01. Muju-gun, Mt. Sambong, Korea. 2012.08.18. A. remotiflorus. Mo02. Muju-gun, Mt. Sambong, Korea. 2012.08.18. A. triphylla var. japonica. S01. Heilong-Jiang, China. A. triphylla var. japonica. S02. Mt. Myungii, Korea. A. trachelioides. AdenoT. Beijing medicinal botanical garden, China. 11. 2012.07.30. Fig. 1. Crude drugs used as Adenophora radix. A. Codonopsis lanceolata, B. Glehnia littoralis, C. Platycodon grandiflorum, D. A. triphylla var. japonica, E. A. stricta, F. Gypsophila patrinii, G. A. trachelioides., H. Platycodon grandiflorum. 12. 2. 방법. 2-1. DNA의 추출. DNA의 추출은 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany)를 이 용하여 수행하였다. Heat block은 65℃로 가열시키고 buffer AP1을 65℃ 로 미리 데워두었다. 추출에 앞서 시료의 마쇄는 TissueLyser (Qiagen, Germany)를 이용하였고, 잎의 경우 30 frequency/sec로 2분간, 생약의 경우 같은 속도로 3분에서 5분간 마쇄하였다. 마쇄한 미세분말은 잎의 경 우에는 약 30 mg, 생약의 경우에는 약 60 mg씩 취해 1.5 ml 크기의 Eppendorf tube에 각각 담고 buffer AP1 용액 400 ㎕ 와 4 ㎕의 RNase A를 첨가한 뒤 65℃ heat block에서 잎의 경우에는 1시간, 생약 의 경우에는 2시간 방치하였으며, 방치 중에도 15분에 한번씩 tube를 흔 들어 바닥에 가라앉은 미세분말을 buffer AP1과 섞어주는 과정을 반복하 였다. 적정 시간 경과 후 130 ㎕의 buffer AP2를 첨가하여 흔들어준 뒤 얼음에서 10분간 방치하였다. 10분 경과 후 탁상용 원심분리기에서 13,500 rpm으로 2분간 원심분리 시켜 상등액을 2 ml collection tube에 장착시킨 QIAshredder spin column에 옮긴 뒤 13,500 rpm으로 2분간 원심 분리하였다. QIAshredder spin column을 통과한 flow-through fraction을 새로운 1.5 ml Eppendorf tube에 옮긴 후에 1.5배의 buffer AP3/E를 첨가하여 섞어준 뒤, 이 혼합용액을 600 ㎕씩 2 ml collection 13. tube에 장착한 DNeasy mini spin column에 넣고 1분 방치 후 2분 동안 13,500 rpm으로 원심분리를 하였다. 이 과정을 두번 반복한 뒤 DNeasy column에 500 ㎕의 buffer AW를 가하여 2분간 13,500 rpm 에서 원심 분리 하는 과정을 두 번 반복한 후, 아무것도 가하지 않는 DNaesy column을 다시 3분간 원심분리 과정을 수행하고, 15분간 건조시켜 여분 의 ethanol 성분을 제거하는 과정을 수행하였다. 65℃로 미리 데운 buffer AE 50 ㎕를 DNaesy column의 membrane에 가한 후 13,500 rpm 에서 1분간 원심분리 하였다. 추출된 DNA의 농도는 10 mg/ml Ethidium Bromide (EtBr)로 처리한 0.7% agarose gel에서 0.25 ug λ DNA-Hind III와 밝기를 상대 비교하여 추정하였다.. 2-2. PCR 증폭 및 정제 핵 ribosomal DNA의 ITS 유전자를 primer ITS 4, 5를 사용하여 PCR을 진행하였지만(Fig. 2), 몇몇 시료에서 비 특이적 증폭이 발생하여 Gardes & Bruns (1993)에 의한 primer ITS1F와 ITS4B를 응용 하였 다.35,36). 시료에. 따른. 특성을. 고려하여. plant. exon에. 맞게. primer. sequence에 변형을 준 후, 임의로 이름을 ITS 1N (forward), ITS 4N (reverse)으로 지정하고 PCR을 진행하였으며(Table 4), 각 시료에 적용한 primer 및 기타 조건은 다음과 같다(Table 5).. PCR 증폭은 반응액에 5. pmol/㎕의 primer를 각각 3 ㎕, 시료에서 추출한 total genomic DNA 용 14. 액 3 ㎕, 10X buffer 5 ㎕, 2.5 mM dNTP 4 ㎕, 25 mM MgCl2 3 ㎕, 그리 고, 5 units/㎕ EX Taq polymerase (Takara Co., Japan) 0.3 ㎕를 가하 고, 최종 반응액의 양이 50 ㎕가 되도록 28.7 ㎕ 의 DDW를 첨가하였다. 95℃에서 3분간 전처리한 후에 94℃에서 30초 denaturation, 52-54℃ 에서 annealing, 72℃에서 1분간 extension으로 이루어진 온도 변화 과 정에서 Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems Co., C.A.) 를 사용 하여 35회 반복하였으며, 72℃에서 7분간 최종 처리하였으며, 증폭된 DNA는 0.7% agarose gel로 전기영동 한 후, 생성된 PCR 산출물의 크기 와. 농도는. Ethidium. bromide로. 염색된. DNA를. UV. light에서. GeneRulerTM 100bp ladder marker (Fermentas Life Sciences Inc, EU) 를 사용하여 상대 비교로 확인하였다. 증폭된 PCR 산물은 High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Germany)를 사용하였고, 생산자 매뉴얼을 일부 수정하여 정제하 였다. 50 ㎕의 PCR 결과물에 250 ㎕의 Binding buffer를 가하고 잘 섞은 후, 수집 튜브위에 장착한 필터 튜브에 가하고, 탁상용 원심분리기에서 13,500 rpm으로 2분간 원심분리하였다. 여과액을 버리고, 필터 튜브에 500 ㎕의 세척 용액으로 같은 방법으로 필터 튜브를 세척하였다. 다시 200 ㎕의 세척 용액을 가하고 같은 방법으로 필터 튜브를 재 세척한 후, 15분간 건조하여 여분의 ethanol 성분을 제거하는 과정을 수행하였다. 새 로운 1.5 ml 튜브에 장착하고 50 ul 추출 완충용액을 더하여 13,500 rpm 으로 2분간 원심분리함으로써 정제된 PCR 산물을 확보하였다. 15. Fig. 2. Structure of ITS regions for the analysis and their primers for the PCR amplification.. Table 4. The sequence of primers used in this analysis.. Primer. Direction. Sequence. ITS 5. Forward. 5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3'. ITS 4. Reverse. 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'. ITS 1N. Forward. 5'-CCT TAT CAT TTA GAG GAA GTA A-3'. Ref. White et al.,1990 〃 Motified from Gardes & bruns, 1993. ITS 4N. Reverse. 5'-TAG GGG ACT TGG GCC CGG TCC G-3'. 16. 〃. Table 5. The primer pairs applied to each sample. Annealing condition Primer pair. Abbreviation Temp.(℃). Second 12E1001, 12E1002, 12E2002, 12E2004,. ITS 5 - 4. 52. 30. 12E2006, 12E2009, 12E2010, 12E2011, 12E2019, 12E2022, 12E2024, AdenoT 12E2013, 12E2020, 12E2023, 12E2025,. 52. 30. 12E2026, 12E2044, 12E2049, 12E2050, 12E2051, 12E2053, 12E2054, E03, P01. ITS 5 - 4N 54. 40. 12E2008, 12E2027, 12E2045, 12E2061. 58. 30. 12E2046 12E2001, 12E2005, 12E2007, 12E2012, 12E2014, 12E2015, 12E2016, 12E2017, 12E2018, 12E2028, 12E2029, 12E2047,. ITS 1N - 4N. 52. 40 12E2048, 12E2052, 12E2055, 12E2056, 12E2057, 12E2058, 12E2059, 12E2060, E01, E02. 17. 2-3. 염기서열 및 계통학적 분석. 염기서열. 결정은. ABI. BigDye. Terminator. v3.1. Cycle. Sequencing Kits (Applied Biosystems, CA)와 DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (BIO-RAD Inc.)를 이용하여 Thermal cycle sequencing 방법을 수행하였으며, 이와 같은 방법은 함께 반응한 5 pmole/ ㎕. 농도의. PCR primer와 정제된 PCR product 50 ㎕를. 1.5 ml. Eppendorf tube에 동봉한 후, Macrogen Ltd. (Seoul Geumcheon-gu)에 발송하여 수행하였다. Thermal cycle sequencing은 동봉하여 보냈던 PCR 과 동일한 primer를 사용하였으며, ABI PRISM 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems, CA)로 염기서열을 분석하였고, 분석된 염기서열은 반드시. 양방향의. 분석을. 통하여. 검증하였다.. 결정된. 염기서열은. Sequencher ver 4.5 (Gene Codes Inc., MI)를 사용하여 최종 확인하였으 며, Clustal X 1.64b를 이용하여 일차적으로 정렬한 후 최종 육안으로 확인 하였으며,37) 정렬된 염기서열은 MacClade 3.08a 를 이용하여 계통분석을 위한 data matrix를 편집한 후,38) PAUP 4.0b10 를 이용하여 유전적 유사 도 및 계통 분석을 수행하였다.39) Parsimony analysis는 최대절약분석 (Maximum Parsimony :MP)으로 Tree Bisection Reconection (TBR) branch swapping을 적용하고, Simple addition sequence, MULTREES 옵 션으로 Heuristic search 방법을 통해 분지도를 획득하였다.40) 본 분석의 외군으로는. 다른. 과에 속하여 상대적으로 유전적 거리가 먼 18. 갯방풍. (Glehnia littoralis)을 설정하였다. 한편으로는 이전에 보고된 염기서열의 데이터베이스와 비교 분석을 위하여 NCBI GenBank에서 blast search program을 이용하여 염기서열의 유사성이 상대적으로 높은 분류군을 탐색 한 후, 함께 계통 분석을 수행하였다(Table 6). MP분석에 있어서 발생한 Gap은 결여 형질로 처리하고 모든 염기서열에 동일한 가중치를 부여하였다.. 19. Table 6. Accession numbers & DNA source information for ITS sequences in the GenBank. Accession. Specimen. Author(s). Jounal. HQ704526. Adenophora remotiflora. Kim & Yoo. Unpublished data. KF175316. A. trachelioides. Wu,D.. Unpublished data. AY548193. A. triphylla var. japonica. Choi et al.. Unpublished data. HQ704529. A. stricta. Kim & Yoo. Unpublished data. AB699584. Platycodon grandiflorum. Onoda et al.. Unpublished data. KC282659. Codonopsis lanceolata. Wang et al.. Unpublished data. KF040355. C. pilosula. Zhao & Chen. Unpublished data. JN589076. Gypsophila patrinii. Greenberg &. Taxon 60, 1637 -. Donoghue. 1652 (2011). Daniel &. Unpublished data. FJ593179. Glehnia littoralis. Knoess. 20. 2-4. 해부 구조 관찰. 해부조직학적 연구에 사용된 약재 시료는 건조된 뿌리이므로 매우 단단하여 수지 embedding법을 응용하여 해부형태적 특징을 관찰하였다. 우선 뿌리 재료의 일부분을 취하여 10% 암모니아수에 12시간 이상 처리한 후, 제3 부틸알콜(TBA)과 에탄올, 그리고 물을 비율 별로 혼합한 6 단계 의 TBA 탈수 과정을 거쳐 조직 속의 수분을 완전히 제거하였으며, 매 단 계 마다 진공 펌프를 실행하여 조직 속의 공기도 완전히 제거한 후, 각 단 계별 최소 12시간 이상 처리하였다(Table 7). TBA 탈수 과정을 통하여 탈 수가 끝난 재료는 최종적으로 순수 에탄올로 치환하여 12시간 이상 처리 후, 다시 에탄올과 Technovite 7100 resin (Kulzer Co., Germany)용액을 3 : 1, 1 : 1, 1 : 3의 비율로 혼합한 용액의 순서대로 12시간 이상 처리 후, Infiltration solution (Technovite 7100 resin : hardener Ⅰ= 00:00)의 순서로 옮겨, resin의 비율을 단계적으로 올려줌으로써 침투가 용이하도록 하였다. 또한, 각 단계 별로 초음파 발생과 동시에 5분가량 중탕을 실행 하 였으며, 더불어 진공펌프를 사용하여 약 20-30분 진공 상태에서 기체를 완전히 제거함으로써 시료 조직 속으로 resin의 침투를 완료하였다. 수지 침투 완료 후, Preparation solution 15ml에 hardenerⅡ를 1ml의 비율로 혼합하여 Histoform S나 Q의 Embedding mold 안에 23ml 넣어 준 후, Resin 침투가 끝난 시료를 그 mold안에 위치시키고 실온 (approx. 23℃)에서 5시간 이상 굳혀주었다. 그리고 그 위에 histo-block 21. (Kulzer Co., Germany)을 setting 한 후, Technovite 3040 (Kulzer Co., Germany)용액과 3040 powder를 혼합하여 fume hood 안에서 histoblock에 부착한 후, 1시간 경과 후 Embedding mold로부터 histo-block을 분리하여. 절편을. 용이하게. 하도록. 가는. 톱으로. trimming. 하였다.. Microtoming은 rotary microtome (Model RM2235. Leica, Germany)을 이용하여 박편을 제작하였다. 재료가 약간 단단하였으므로, disposable knife (Patho cutter Ⅱ, Kai Industries Co., Japan)를 사용하여 3-5 um의 두께로 박편을 제작한 후, 박편을 slide glass 위에 부착시키고, 0.5% Toludine blue 염색액으로 1분간 염색한 후 흐르는 물에 10분간 탈색하였 다. 탈색 후 slide glass를 건조시키고 xylene으로 세척한 후 fume hood 안에서 봉입 용액인 Entellan (Merck Co., Germany)으로 mounting 하여 영구슬라이드를 만들었다. 사진촬영은 디지털카메라가 부착된 현미경 사진 장치(Olympus BX-50, Olympus, Japan)를 사용하였고, 해당 부위를 저배 율(x40)에서부터 고배율(x400)로 촬영하여 비교하였다.. 22. Table 7. TBA dehydration steps.. Step. TBA : EtOH : DW. 1. 10 : 50 : 40. 2. 20 : 50 : 30. 3. 35 : 50 : 15. 4. 55 : 45 : 0. 5. 75 : 25 : 0. 6. 100 : 0 : 0. 7. 0 : 100 : 0. 23. Ⅲ. 결과 1. 계통학적 비교 분석. 1-1. 염기의 서열 및 변이 분석. 본 연구에서 다룬 전체 56개의 시료와 NCBI의 GenBank Blast search를 통해 가장 Identity가 높은 9개의 sequence를 참조하여 총 65개 염기서열의 ITS 1, 5.8s, ITS 2 전체 길이는 597-727 base pair (bp)의 범위로 나타났고, 정렬된 염기서열은 총 868 bp였으며(including gap), 전 체적으로는 도라지절이 778-779 bp로 가장 길었고, 갯방풍(Glehnia. littoralis)이 671 bp로 가장 짧게 나타났다. 한편, DNA의 구조 및 물리적 특성을 결정하는 구아닌(G)과 시토신(C)의 함량은 평균 57.2%였다. 유전 자의 크기는 ITS 1과 ITS 2가 각각 218-293 bp와 217-272 bp로, ITS 1이. ITS. 2보다. 다소. 길었으며,. 5.8s의. 크기는. GenBank의. JN589076(Gypsophila patrinii)의 160 bp를 제외하고 모두 162 bp로 동 일하였다. 정렬된 313 bp의 ITS 1 염기서열에서 111개의 염기서열이 변화가 없었고, 나머지 202개의 site에서 염기서열의 변화가 있었으며, 그 중 152 개가 2 이상의 분류군에서 공유되어 계통학적 해상력을 가지는 공유 파생 형질(parsimony-informative characters)이었다.41) 정렬된 ITS 1 염기서 24. 열에서 관찰된 indel은 17군데이었으며, 대부분의 indel은 1-3 bp의 크기 이나, 77 site에서 도라지절의 9 bp로 가장 큰 insertion이 나타났다(Fig. 3). 또한 5.8s의 162 bp에서는 149 개의 염기서열이 변화가 없었고, 13개의 site에서 변화가 있었으며, 그 중에 4개가 공유 파생형질이었다(Fig. 4).. 25. [ HQ704529 12E2014 12E2054 12E2017 12E2026 12E2024 12E2009 12E2044 12E2018 12E2027 12E2005 12E2057 12E2019 12E2029 12E2051 12E2015 12E2053 12E2046 12E2050 12E2025 12E2010 12E2020 AY548193 12E2006 E01 12E2002 12E2045 12E2004 12E2003 S02 12E1001 12E2007 S01 12E2047 12E2023 12E2008 12E2011 12E2016 12E2052 12E2013 12E2012 12E2021 HQ704526 12E2058 12E2059 12E2060 mo1 mo2 KF175316 AdenoT 12E2055 12E2048 12E2056 AB699584 12E2022 P01 KC282659 12E2001 E03 E02 KF040355 JN589076 12E2028 FJ593179 12E1002. 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100] TCGAACCCT-GCA-TAGCAGAACAACCC-GCGAACACGTTGAAA-AACACATTTGGGGGATG--CGTG-CACGGGA---------CAAGGCGACAGCTCC [84] .........-...-..............-...............-.................--....-.......---------............... [84] .........-...-..............-...............-.................--....-.......---------............... [84] .........-...-..............-...............-.................--....-.......---------............... 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[92] ----------------.......G....-..........-...C-.....C----.....C.--..G.-.TT.CCC---------GTG.C.CCTT..CGT [65] .....A...-...-C........G....-..........-...C-.....C----.....C.--..G.-.TT.CCC---------GTG.C.CCTT..CGT [79] .....A...-...-C........G....-..........-...C-.....C----.....C.--..G.-.TT.CCC---------GTG.C.CCTT.YCGT [79] .....A...-...-C........G....-..........-...C-.....C----.....C.--..G.-.TT.CCC---------GTG.C.CCTT..CGT [79] .....A...-...-C........G....-..........-...C-.....C----.....C.--..G.-.TT.CC----------.GT...CC.TTGC.G [78] .....A...-..C-A........G....-.T....GT...T.CG-....-------------------------------------------..G...AG [53] .........-...-A........G....-.T........AA...C...CG.G.GTT.A..G.AC.AA.-.T.CT.TT---------TGAT.CT.TCGA.G [87] .....T...-...A........TG....-..T........-----....-...A...C..-.--.A.--.GG....---------.CTT.GT----.... [74] .....T...-...A........TG....-..T........-----....-...A...C..-.--.A.--.GG....---------.CTT.-----.TCT. [73]. Fig. 3. Aligned sequences of ITS 1 regions from 65 taxa. The bar(-) indicates gaps and dot(.) indicates matched sequences to the first taxon. 26. [ HQ704529 12E2014 12E2054 12E2017 12E2026 12E2024 12E2009 12E2044 12E2018 12E2027 12E2005 12E2057 12E2019 12E2029 12E2051 12E2015 12E2053 12E2046 12E2050 12E2025 12E2010 12E2020 AY548193 12E2006 E01 12E2002 12E2045 12E2004 12E2003 S02 12E1001 12E2007 S01 12E2047 12E2023 12E2008 12E2011 12E2016 12E2052 12E2013 12E2012 12E2021 HQ704526 12E2058 12E2059 12E2060 mo1 mo2 KF175316 AdenoT 12E2055 12E2048 12E2056 AB699584 12E2022 P01 KC282659 12E2001 E03 E02 KF040355 JN589076 12E2028 FJ593179 12E1002. 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200] C--CGTGCATGCAGCC-CCCTTCCT-TGTGGTGCCGGAGCAATCGAGCGAAAGCAC-----GTGAGCTTCGGCCCCC-AAG--AAACAAA--CCCCGGCG [170] .--.............-........-..............................-----................-...--.......--........ [170] .--.............-........-..............................-----................-...--.......--........ 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[140] .GA.....GC..-C.G-...AA..A-CT.....G.A.G.------..T.TGC.TG.-----..CG--Y.....G..-------....G..--........ [154] .GA.....GC..-C.G-...AA..A-CT.....G.A.G.------..T.TGC.TG.-----..CG--Y.....G..-------....G..--........ [154] .GA.....GC..-C.G-...AA..A-CT.....G.A.G.------..T.T--..GT-----.C.WCG......G..-------....G..--........ [154] TCG-.C.......C..G...AA..A-CT.....G------..GG....--.T..GT-----.C.TCG......G..-------....G..--........ [154] G--G....T.YGT...-..--..---------...C.....GGG.....CTCA.TG-----...G.G.G.TT..AG.-T.CAT....G..--........ [131] .TTT..CG....-.---.AT..A..-C.A.T--..TTTCGG.C.TT.T...T.TGT----------.A.T...G.----.T--T.....--C.......A [162] -----..TT...GAAT-....GGTA-G....C-------..C..CC.G.TGGC...-----T--------....TG.-..---..T..TT--.GGGC... [141] .--T..T--...GAAT-..-C.GG.-A.--...G.----..C..C--------.GG-----...GC.ACT....TG.-..---..T..TT--.GGGC... [141]. Fig. 3. Continued. 27. [ HQ704529 12E2014 12E2054 12E2017 12E2026 12E2024 12E2009 12E2044 12E2018 12E2027 12E2005 12E2057 12E2019 12E2029 12E2051 12E2015 12E2053 12E2046 12E2050 12E2025 12E2010 12E2020 AY548193 12E2006 E01 12E2002 12E2045 12E2004 12E2003 S02 12E1001 12E2007 S01 12E2047 12E2023 12E2008 12E2011 12E2016 12E2052 12E2013 12E2012 12E2021 HQ704526 12E2058 12E2059 12E2060 mo1 mo2 KF175316 AdenoT 12E2055 12E2048 12E2056 AB699584 12E2022 P01 KC282659 12E2001 E03 E02 KF040355 JN589076 12E2028 FJ593179 12E1002. 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300] CAATTCGCGCCAAGGAAATCTTTAAACTCAAGG-GCGTGCTCTCCTCACGTTGCCCCCGTTTGCGG---GTGCGCGACTGGGTGTTTGCCCGCTCCTTAG [266] .................................-................................---............................... [266] .................................-................................---............................... [266] .................................-................................---............................... [266] .................................-................................---............................... [267] .................................-................................---............................... [266] .................................-................................---............................... [266] .................................-................................---............................... [266] .................................-.T..............................---............A.................. [265] .................................-................................---............................... [266] .................................-..............T.................---....................T.......... [265] .................................-..............Y.................---....................Y.......... [265] .................................-................................---............................... [266] .................................-................................---............................... [266] .................................-................................---............................... [266] .................................-................................---..A............................ [266] .................................-................................---..A............................ [266] .................................-................................---............................... [264] .................................-................................---............................... [266] .................................-................................---............................... [266] .................................-................................---............................... [266] .................................-................................---............................... [266] .......T.........................-................................---.......G....................... [265] .................................-................................---............................... [265] .................................-................................---............................... [265] .................................-................................---............................... [264] .................................-................................---............................... [265] .................................-................................---............................... [265] .................................-................................---............................... [265] .................................-................................---............................... [265] .................................-................................---...Y........................... [266] .................................-................................---............................... [265] .................................-................................---............................... [265] .................................-................................---............................... [265] .................................-................................---............................... [264] .................................-................................---............................... [267] .................................-................................---............................... [265] .................................-................................---............................... [265] .................................-................................---............................... [265] .................................-................................---............................... [265] .................................-................................---............................... [265] .................................-................................---............................... [266] .................................-................................---....................T.......... [265] .................................-................................---....................T.......... [265] .................................-................................---....................T.......... [265] .................................-................................---....................T.......... [265] .................................-................................---....................T.......... [265] .................................-................................---....................T.......... [265] ..................A..............-................................---...T.T......................... [266] ..................A..............-................................---...T.T......................... [266] ..................A..............-................................---...T.T......................... [266] ..................A..............-................................---...T.T......................... [266] ..................A..............-................................---...T.T......................... [266] .G..C.............A.A.A.CT..AG.A.A...CC.CG.....C...C.....-..CC....TGC.C.T...G.....C.G.G...-......CG. [184] .G..C.............A.A.A.CT..AG.A.A...CC.CG.....C...C.....-..CC....TGC.C.T...G.....C.G.-.G........CG. [280] .G..C.............A.A.A.CT..AG.A.A...CC.CG.....C...C.....-..CC....TGC.C.T...G.....C.G.G..-.......CG. [281] .G..C.............A...--.......A.A...GC.CG.....CT..C.....-...C....----..T...CAC..T..GGC.GTT...T..... [233] .G..C.............A...--.......A.A...AC.CG.....CT..C.....-...C....----..T...CAC..T..GGC.GTT...T..... [247] .G..C.............A...--.......A.A...AC.CG.....CT..C.....-...C....----..T...CAC..T..GGC.GTT...T..... [247] .G..C.............A...--.......A.A...AC.CG.....CT..C.....-...C....----..T...CAC..T..GGC.GTT...T..... [247] .G..C.............A...--.......A.A...CCACG.....C...C.....-...C....----..T...CAC..T..GG..GT....T..... [247] .G.AAA...T.......CA-----------.A.C..C.TG..C.TG.T..--------...A..C.----....G.---...A.G.-...ATG..T.--[201] ...CGT.T..........A.--.......-.A.AAG--....GTT...T.A..........C....----..T..TCA....A-.G..---...T...TA [249] G...--..........--....A.....G..TT-.TAC.---...GT.T------......AA...---.CT.----.G.C..C...C.----------[209] G...--..........--....A.....G..T--------.G.A.GTC...AT...--...AA...---.----.TC.G.C..C...C.----------[209]. Fig. 3. Continued.. 28. [ HQ704529 12E2014 12E2054 12E2017 12E2026 12E2024 12E2009 12E2044 12E2018 12E2027 12E2005 12E2057 12E2019 12E2029 12E2051 12E2015 12E2053 12E2046 12E2050 12E2025 12E2010 12E2020 AY548193 12E2006 E01 12E2002 12E2045 12E2004 12E2003 S02 12E1001 12E2007 S01 12E2047 12E2023 12E2008 12E2011 12E2016 12E2052 12E2013 12E2012 12E2021 HQ704526 12E2058 12E2059 12E2060 mo1 mo2 KF175316 AdenoT 12E2055 12E2048 12E2056 AB699584 12E2022 P01 KC282659 12E2001 E03 E02 KF040355 JN589076 12E2028 FJ593179 12E1002. 310 ] TGAAAA-CACAAA ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......-...... ......A...... ......A...... ......A...... ......A...... ......A...... ---..CA-.T... .--..T-...... --....-.....--....-.....-. [278] [278] [278] [278] [279] [278] [278] [278] [277] [278] [277] [277] [278] [278] [278] [278] [278] [276] [278] [278] [278] [278] [277] [277] [277] [276] [277] [277] [277] [277] [278] [277] [277] [277] [276] [279] [277] [277] [277] [277] [277] [278] [277] [277] [277] [277] [277] [277] [278] [278] [278] [278] [278] [196] [292] [293] [246] [260] [260] [260] [260] [210] [259] [218] [218]. Fig. 3. Continued. 29. [ HQ704529 12E2014 12E2054 12E2017 12E2026 12E2024 12E2009 12E2044 12E2018 12E2027 12E2005 12E2057 12E2019 12E2029 12E2051 12E2015 12E2053 12E2046 12E2050 12E2025 12E2010 12E2020 AY548193 12E2006 E01 12E2002 12E2045 12E2004 12E2003 S02 12E1001 12E2007 S01 12E2047 12E2023 12E2008 12E2011 12E2016 12E2052 12E2013 12E2012 12E2021 HQ704526 12E2058 12E2059 12E2060 mo1 mo2 KF175316 AdenoT 12E2055 12E2048 12E2056 AB699584 12E2022 P01 KC282659 12E2001 E03 E02 KF040355 JN589076 12E2028 FJ593179 12E1002. 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100] CGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCT [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] .................................................................................................... [100] ............................A.....................A...............................................T. [100] .........A.......................................................................................... [100] .........A.......................................................................................... [100]. Fig. 4. Aligned sequences of 5.8s regions from 65 taxa. The bar(-) indicates gaps and dot(.) indicates matched sequences to the first taxon. 30. [ HQ704529 12E2014 12E2054 12E2017 12E2026 12E2024 12E2009 12E2044 12E2018 12E2027 12E2005 12E2057 12E2019 12E2029 12E2051 12E2015 12E2053 12E2046 12E2050 12E2025 12E2010 12E2020 AY548193 12E2006 E01 12E2002 12E2045 12E2004 12E2003 S02 12E1001 12E2007 S01 12E2047 12E2023 12E2008 12E2011 12E2016 12E2052 12E2013 12E2012 12E2021 HQ704526 12E2058 12E2059 12E2060 mo1 mo2 KF175316 AdenoT 12E2055 12E2048 12E2056 AB699584 12E2022 P01 KC282659 12E2001 E03 E02 KF040355 JN589076 12E2028 FJ593179 12E1002. 110 120 130 140 150 160 ] TTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCTTTAGGCCGAGGGCACGTCTGCATGGGCGTCACGCAT [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] ................................T............................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .................................A............................ [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] .............................................................. [162] ..........................................................A... [162] ..........................................................A... [162] ..........................................................A... [162] ..........................................................A... [162] ..........................................................A... [162] .........................A.................................... [162] .........................A.................................... [162] .........................A.................................... [162] .........................G.................................... [162] .........................G.................................... [162] .........................G.................................... [162] .........................G.................................... [162] .........................G.................................... [162] ..........................C--...TA.............C.............. [160] ............................T..................C.............. [162] .........................AC.....T.........C....C....T......... [162] .........................AC.....T.........C....C....T......... [162]. Fig. 4. Continued. 31. 한편, 정렬된 294 bp의 ITS 2 유전자에서는 102개의 염기서열이 같았고, 나머지 192개의 site에서 염기서열의 변화가 일어났으며, 그 중 102개가 공유 파생 형질이었다. 정렬된 ITS 2 염기서열에서 관찰된 indel 은 13군데가 있었으며, 대부분의 indel은 1-5 bp의 크기이나, 243 site에 서 더덕절의 27 bp로 가장 큰 deletion이 나타났다(Fig. 5). 단일 염기변이는 속 수준 내에서 굉장히 뚜렷하게 나타났고,. Adenophora속 내의 triphylla절은 단일 염기변이가 ITS 1의 155 site와 5.8s의 134 site, ITS 2의 81, 158 site에서 특징적으로 관찰되었으며,. stricta절은 ITS 1의 113 site에서 단일 염기변이를 관찰할 수 있었다. 또 동속의 remotiflorus절은 단일 염기변이가 ITS 1의 290 site와 ITS 2의 235 site에서 특징적으로 관찰되었고, trachelioides절은 단일 염기변이가 ITS 1의 86, 92, 107, 149, 191, 219, 273, 275 site와 5.8s의 159 site, ITS 2의 125, 200, 291 site에서 특징적으로 관찰되었다. 군외군을 포함한 염기 변이는 Adenophora속 내에서의 개체별 변 이가 0.0-3.4%이며, Adenophora와 Codonopsis와의 속간 변이는 16.720.6%,. Adenophora와. Platycodon은. 18.7-26.2%,. Adenophora와. Glehnia는 21.2-24.2%로 나타났다(Table 8). 한편, 45종의 한약재를 분 석한 결과, 사삼으로 가장 많이 유통되는 A. triphylla var. japonica와 A.. stricta의. 종간 변이율은 1.0-3.0%이며, 사삼과 한국 제니의 종간 변이율. 는 0.5-2.2%로 나타났고, 또 한국 제니와 중국 제니와의 종간 변이는 1.7-1.8%를 보였다. 32. [ HQ704529 12E2014 12E2054 12E2017 12E2026 12E2024 12E2009 12E2044 12E2018 12E2027 12E2005 12E2057 12E2019 12E2029 12E2051 12E2015 12E2053 12E2046 12E2050 12E2025 12E2010 12E2020 AY548193 12E2006 E01 12E2002 12E2045 12E2004 12E2003 S02 12E1001 12E2007 S01 12E2047 12E2023 12E2008 12E2011 12E2016 12E2052 12E2013 12E2012 12E2021 HQ704526 12E2058 12E2059 12E2060 mo1 mo2 KF175316 AdenoT 12E2055 12E2048 12E2056 AB699584 12E2022 P01 KC282659 12E2001 E03 E02 KF040355 JN589076 12E2028 FJ593179 12E1002. 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100] CGCGTCGCCCCCCC-----AAGCATCTTGCACCTCCAAG--TGCCCGCTTGC---TTGGT---GGGGAGCGTACATTGGCCTCCCGTGCCTCGCA--GTT [85] ..............-----....................--...........---.....---................................--... 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