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2013年 2月 박사학위논문
Pr os t agl andi nE 2 불활성화 효소인 1 5-hydr oxypr os t agl andi n
de hydr oge nas e억제제의 창상치유효과
조선대학교 대학원
의학과
서 승 용
[UCI]I804:24011-200000263551
Pr os t agl andi nE 2 불활성화 효소인 1 5-hydr oxypr os t agl andi n
de hydr oge nas e억제제의 창상치유효과
Ef f e c tof15 -hydr oxypr os t agl andi n de hydr oge nas ei nhi bi t oronwound
he al i ng
20 1 3 年 2 月 2 5 日
조선대학교 대학원
의학과
서 승 용
Pr os t agl andi nE 2 불활성화 효소인 1 5-hydr oxypr os t agl andi n
de hydr oge nas e억제제의 창상치유효과
指導敎授 임 성 철,문 영 래 이 論文을 醫學博士 學位 請求論文으로
提出함
2 0 1 2 년 1 0 월
朝 鮮 大 學 校 大 學 院
醫 學 科
서 승 용
서 승 용의 博士學位論文을 認准함
委員長 朝鮮大學校 敎授 최 철 희 印
委 員 朝鮮大學校 敎授 조 훈 印 委 員 朝鮮大學校 敎授 한 송 이 印 委 員 朝鮮大學校 敎授 소 금 영 印 委 員 朝鮮大學校 敎授 임 성 철 印
2 0 1 2年 1 2月
朝 鮮 大 學 校 大 學 院
목 차
목 차 ···ⅰ
그 림 목 차 ···ⅲ
표 목 차 ···v
초 록 ···vi
제 1장 서 론
···1제 2장 실험 방법
···52.1동물 모델 제작 ···5
2.1.1약물제작 및 투약···5
2.1.2실험 방법 ···6
2.2조직학적 평가 ···6
2.3분자생물학적 평가 ···7
2.4통계학적 분석 ···10
제 3장 결과
···113.1육안적 평가 ···11
3.2조직학적 평가(H&E stain)···12
3.3조직학적 평가(Masson'strichromestain)···14
3.4분자생물학적 평가 ···15
제 4장 토론
···23제 5장 결론
···29참 고 문 헌
···30LI ST OF FI GURES
Figure1.ChemicalstructureofprostaglandinE2......................................................1
Figure2.Biosynthesisofprostaglandins...2
Figure 3.Summary of the chemicalstructures involved in the transformations of PGE2 in to its major urinary metabolite...3 Figure 4.A stereoview of3D structure of15-PGDH-NAD+-PGE2
complex.ThegreenmolecularissubstratePGE2,thered moleculariscofactorNAD+...4
Figure5.Structureofthe5-(2-chloro-3-(3-phenylpropoxy)
benzylidene)thiazolidine-2,4-dione(TD88)···6
Figure6.GrossfindingsofthecontrolgroupandTD88-treated groupattwodaysaftertreatment···11
Figure7.GrossfindingsofthecontrolgroupandTD88-treated groupatfourdaysaftertreatment.···12
Figure 8. Microscopic findings of the control group and TD88-treatedgroupatfourdaysaftertreatment. ···13
Figure 9.Microscopic findings ofthe dermaldefectsite in the controlgroupandTD88-treatedgroupatfourdaysafter treatment.···15
Figure10.qPCR analysisforPDGF-D atfourdaysafter
treatment···16
Figure11.ComparisonofqPCR dataforPDGF-D attwoandfour daysaftertreatmentbetweencontrolandtreatedgroups
···17
Figure12.qPCR analysisforCTGF atfourdaysaftertreatment
···18
Figure13.Comparison ofqPCR data forCTGF attwo and four days after treatment between control and treated groups···19
Figure14.qPCR analysisforTIMP-2atfourdaysaftertreatment
···20
Figure15.ComparisonofqPCR dataforTIMP-2attwoandfour days after treatment between control and treated groups···21
Figure16.qPCR analysisfortypeIV collagen atfourdaysafter treatment···21
Figure17.Comparison ofqPCR datafortypeIV collagen attwo and four days after treatment between controland treatedgroups···22
LI ST OF TABLES
Table1.Primersforreal-timePCR...9
Table 2. Histomorphometric analysis for reepithelialization rate aftertreatment···14
Table3.StatisticaldataforPDGF-D obtainedbyqPCR analysis
···17
Table4.StatisticaldataforCTGF obtainedbyqPCR analysis···18
Table5.StatisticaldataforVEGF obtainedbyqPCR analysis···19
Table6.StatisticaldataforTIMP-2obtainedbyqPCR analysis···
···20
Table 7.Statisticaldata fortype IV collagen obtained by qPCR analysis···22
ABSTRACT
Ef f ectof15-hydr oxypr ost agl andi n dehydr ogenasei nhi bi t oron woundheal i ng
SeoSeung-yong
Advisor:Prof.Lim Sung-chul,M.D.,Ph.D.
Coadvisor:Prof.MoonYoung-rae,M.D.,Ph.D.
DepartmentofMedicine,
GraduateSchoolofChosunUniversity
Prostaglandin E2 (PGE2) is known as an important mediator of various types of wound healing.It is degraded and inactivated by NAD+-dependent15-hydroxyprostagaladin dehydrogenase (15-PGDH).Thus, inhibitors of15-PGDH willbe valuable forthe treatmentofdiseases requiring elevated PGE2.The inflammatory process has directeffects on woundhealing.Hypertrophicscarformation isan aberrantform of wound healing and is an indication of an exaggerated function of fibroblasts and excess accumulation of extracellular matrix during wound healing.Various growth factors including TGF-β,PDGF-D, VEGF,andCTGF,typeIV collagen.TIMP-2andPG E2areimportant mediatorsofinflammation involving wound healing.Overproduction of TGF-β and suppression of PGE2 are found in excessive wound scarring compared with normal wound healing. If we make the condition downregulating growth factors and upregulating PGE2,the
woundwillhaveapositiveeffectwhichresultsinlittlescarformation after wound healing. 5-(2-chloro-3-(3-phenylpropoxy) benzylidene) thiazolidine-2,4-dione(TD88)isa newly synthesized 15-PGDH inhibitor basedonthiazolinedionestructure.WeevaluatedtheeffectofTD88onwound healing.In 10guineapigs(4controlgroup and 6experimentalgroup),we madefour1cm diameter-sizedcircularskindefectsoneachback.TD88and vehicle were applicated on the wound twice a day for 4 days in the experimentalandcontrolgroups,respectively.Tissuesampleswereharvested forquantitativePCR (qPCR)andhistomorphometricanalysesonthe2ndand 4th day after treatment. Histomorphometric analysis showed significant reepithelization in theexperimentalgroup.qPCR analysisshowed significant decreaseofgrowth factors(PDGF andCTGF)and TIMP-2,butsignificant increase oftype IV collagen in the experimentalgroup.Taken together TD88 could be a good effector on wound healing,especially in the aspects ofdownregulating growth factors and upregulating PGE2and thereby mightplay aroleintheprevention ofexcessivescarring.The hypertrophic scar/keloid treatment algorithms that are currently available are likely to be significantly improved in the future by high-qualityclinicaltrials.
---
Key words: 15-hydroxyprostagaladin dehydrogenase (15-PGDH), Prostaglandin E2,Wound healing,Growth factor,Scar,Guinea pig, qPCR,Histomorphometry
제 1장 서 론
창상(wound)은 누구나 신속하고 흉터(scar)없이 치유되기를 바란다.
비록 정상적인 창상치유과정이라 하더라도 염증반응은 필수적으로 수 반되며 경우에 따라 감염 등 불량한 창상치유 조건에 의하여 비정상 적인 창상치유과정이 발생하기도 한다.이와 같은 다양한 형태의 창상 치유과정에서 섬유모세포(fibroblast)의 증식이 과도하게 조장되면 과 다한 양의 세포외 기질(extracellularmatrix,ECM)이 생산되게 된다.
섬유모세포에 의해서 만들어지는 과도한 세포외 기질은 교원질 (collagen)로 창상의 치유후에도 잔존하여 치유부위가 비후되어 미용 상 문제를 야기하는 비후성 상흔(hypertrophicscar)이 형성되거나 심 한 경우는 구축이 일어나 운동제한 등 기능적 손상을 초래하기도 한 다[1-3].
O
HO
COOH
OH
Figure1.ChemicalstructureofprostaglandinE2
정상적인 창상치유과정에 관여하는 염증매개물 중에는 성장인자 (growth factor)와 프로스타그란딘(prostaglandin,PG)같은 사이토카 인(cytokine)이 있다. 성장인자는 transforming growth factor-β (TGF-β),vascular endothelialgrowth factor (VEGF),connective tissuegrowthfactor(CTGF),plateletderivedgrowthfactor(PDGF) 등이 주로 창상치유에 관여하며,PG은 PGE2(Fig.1)가 주로 관여하
는 것으로 알려져 있다.또한 ECM,특히 기저막을 구성하는 주성분으 로 알려진 제4형 교원질(typeIV collagen)과 ECM의 일부 구성성분의 분해를 조절하는 tissueinhibitorofmetalloproteinase(TIMP)가 창상 치유과정에 깊게 관여된다고 알려져 있다[4].
Figure2.Biosynthesisofprostaglandins.
그런데 과도한 양의 ECM을 만들어 내는 비정상적인 창상치유과정에 앞에 언급된 여러 성장인자와 PGE2가 큰 역할을 담당하는 것으로 밝 혀져 주목을 받고 있다.즉,정상적인 창상치유과정에 비하여 성장인 자가 과도하고 PGE2의 형성이 억제될수록 흉터가 심해진다는 사실이
다[4].이런 사실은 그동안 창상치유의 일반적인 paradigm으로 통증완 화를 위한 비스테로이드소염진통제(NSAIDs)나 cyclooxygenase-2 (COX-2)차단제를 처방했던 것과 크게 상충되는 사실이다 (Fig.2). 특히 이들 약제를 창상치유 후기 즉,세포 증식기(laterproliferative phase)에 투여할 경우 PGE22생성을 억제하여 흉터를 더 크게 조장하 게 된다[4].따라서 최선의 창상치유조건은 성장인자를 줄이고 PGE2를 높일 수 있는 환경을 조성해 주는 것이다.
Figure 3.Summary of the chemicalstructures involved in the transformationsofPGE2intoitsmajorurinarymetabolite.
최근 PG의 대사과정에 관여하는 화합물의 개발로 PGE2의 농도를 높 게 유지 가능한 시도가 계속되고 있는데 이중에서 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase(15-PGDH)억제제 (Fig.3) 를 이용하여 PGE2의 분해를 억제하고 PGE2의 농도를 높게 유지하는 방법이 있다[5-8].15-PGDH는 PGE2의 분해를 담당하는 효소인데
15-PGDH 억제제는 PGE2의 분해를 강력하게 억제하여(Fig. 4), PGE2의 농도를 효과적으로 높일 수 있음을 선행연구를 통하여 확인한 바 있다[5].
Figure 4.A stereoview of3D structure of15-PGDH-NAD+-PGE2
complex.Thegreen molecularissubstratePGE2,theredmolecular iscofactorNAD+.
이에 저자들은 guineapig을 이용하여 15-PGDH 억제제가 창상치유 에 어떠한 효과를 갖고 있는지를 파악하고자 창상치유정도와 창상내 각종 성장인자,교원질,교원질 조절인자 등의 변화를 비교하였다.
제 2장 실험 방법
2.1동물 모델 제작
실험에 사용된 동물은 10마리의 guineapig (250~350g)로 실험효 과를 보다 정확하게 확인하기 위해 호르몬 영향을 최소화 할 수 있는 수컷 성체를 사용하였다.실험에 사용된 동물은 외상 여부와 질병 상 태를 육안으로 판별해 건강한 동물을 선택했으며 환경적인 스트레스 요인을 최소화하기 위해 사육실의 온도는 21∼23℃를 유지하고 12시 간 간격의 명암 전환상태에서 물과 전용사료를 자유롭게 섭취하도록 하였다.
실험동물의 창상 유발을 위해 세보플루란(sevoflurane)호흡마취제 를 사용하여 마취를 시행했으며 등 부위에 있는 털을 제거하고 균일 한 크기의 창상을 유발하기 위해 직경 1cm 크기의 원형 칼날과 칼집 으로 구성된 펀치 형태의 도구를 이용해 창상을 유발했다.창상은 실 험동물의 척추를 기준으로 피부를 들어 올리고 원형 도구를 이용해 좌우를 관통시켜 표피 및 진피 층을 제거한 결손 창상을 마리당 4개 씩 유발하였다.이렇게 창상이 만들어진 guineapig은 4마리는 대조 군으로,6마리는 실험군으로 구분하여 분리하였다.
2.1.1약물제작 및 투약
본 실험에 사용된 15-PGDH 억제제는 5-(2-chloro-3- (3-phenylpropoxy)benzylidene)thiazolidine-2,4-dione (TD88)(Fig.5) 으로 실험군에는 TD88을 polyethyleneglycol에 25mM이 되게끔 용 해시키고 20% Tween 20으로 1:4의 비율로 희석하여 최종 농도가
5mM 되게 하여 사용하고,대조군에는 polyethylene glycol과 20%
Tween20을 1:4의 비율로 희석한 것을 vehicle로 사용하였다.
Figure 5. Structure of the 5-(2-chloro-3-(3-phenylpropoxy) benzylidene)thiazolidine-2,4-dione(TD88)
2.1.2실험 방법
대조군,실험군으로 구분된 동물은 지혈과 동시에 창상면에 대조군은 vehicle을,실험군은 TD88을 혈청분리관에 담아 두 방울씩 점적하고 매 12시간마다 같은 방법으로 점적하여 만 2 일 및 4 일째 희생될 때까지 계속하였다.대조군 2마리,실험군 3마리는 만 2일이 되는 시간에 경부척수를 마비시켜 희생 시킨 후 창상주변의 정상 피부조직 을 포함한 4각형의 피판을 얻었다.개체별 획득된 피판에 형성된 4개 의 원형창상중 1 개를 창상주변을 포함한 직경 약 1.5 cm의 조직을 얻어 신선상태로 deepfreezer에 보관하고 나머지 3개의 창상이 포함 된 피판은 핀으로 코르크판에 펴서 포르말린에 고정하였다.실험 4일 째에도 같은 방법으로 동물을 희생시키고 조직을 획득하였다.
2.2조직학적 평가
포르말린에 고정된 조직은 12시간후 수세과정을 거쳐 자동 조직가 공기를 이용하여 파라핀 블록을 제작하였다.파라핀 블록을 4㎛ 두께
로 박절해 H&E 염색과정을 거쳐 현미경 관찰 및 분석을 위한 슬라이 드를 제작하였다. 그리고 조직내 교원질 분포를 확인하기 위한 Masson'strichrome염색을 하였다.
H&E 염색된 조직 슬라이드는 현미경 관측을 통하여 직경 1 cm의 창상면의 회복정도를 평가하는데 이용하였다.회복정도의 비교는 창상 면의 상피재생정도로 비교하였는데 실험조작으로 제거된 표피의 재생 정도(reepithelization)를 측정하여 비교하였다.
재생정도 측정은 H&E 슬라이드를 MagnaFire digital camera system (Optronics,Goleta,CA,USA)을 이용해 이미지를 획득하고 Visus Image Analysis System (Image & Microscope Technology, Daejon,Korea)을 이용해 정확한 결손부위 장경을 측정하였다.
창상의 차유율(창상내 상피재생율)은 다음과 같이 계산하였다.
total length of reepithelialization
rate of reepithelialization (%) = x100 length of skin defect
또한 창상 수복 부위의 교원질 형성정도를 파악하기 위해 Masson's trichrome염색을 시행했다.Masson'strichrome염색은 교원질이 푸 른색으로 염색이 되어 그 강도에 따른 차이로 각 그룹별 교원질 형성 정도를 비교분석하였다.
2.3분자생물학적 평가
TD88이 창상수복과정에 관여하는 여러 가지 성장인자,ECM 구성성 분 및 이들 분해관련인자에 유익한 변화를 유발하는지를 평가하기 위 하여 real-time PCR을 통하여 대조군과 비교분석하였다.분석대상은 TGF-β,VEGF,CTGF,PDGF-D 등과 같은 성장인자와 ECM 성분인
typeIV collagen과 이들 분해에 영향을 미치는 TIMP-2이며 다음과 같은 방법으로 제작 분석하였다.
Deepfreezer에 냉동보관된 조직을 phosphate-bufferedsaline(PBS) 로 헹구어 혈액을 제거한 후 1 ml의 TrizolReagent (Invitrogen, USA)를 넣고 FastPrep-24system (MP BiomedicalsLLC.USA)을 이용하여 10초씩 2번에 걸쳐 파쇄하고 신속히 얼음 위에 올려 저온을 유지하였다.파쇄된 조직에서 totalRNA를 분리하고,2 mg의 total RNA에 M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen),5X firststrand buffer, RNasin Ribonuclease inhibitor (Takara, Japan), random primers,oligo(dT)20,dNTP 그리고 dithiothreitol(DTT)를 혼합하여 ThermalBlock(MyGenie96,Bioneer,Korea)에서 역전사 반응을 실시 하여 cDNA를 합성하였다.Caviaporcellusgene서열의 데이터베이스 를 근거로 하여 melting temperature(60°C)와 PCR에 의해 증폭되는 유전자길이가 170bp정도가 되는 조건에서 Primer3software를 이용 하여 각 기니피그 유전자에 특이적인 primer를 결정하고 제작하였다.
합성된 cDNA와 제작된 각 primer,그리고 LightCycler-FastStart DNA MasterSYBR Green Imix (Roche)를 혼합하고 LightCycler (Roche)를 이용하여 Real-timePCR 반응을 실시하였고,각각의 샘플 은 동일하게 이중으로 실시하였다.Real-timePCR 중합조건은 95°C에 서 10min반응 후 95°C 15s,60°C 5s,72°C 6~7scycle이 45회 진 행되었다.실험에서 이용된 primers서열은 Table1과 같다.
각 유전자에 대한 측정치는 GAPDH로 표준화하였다.
Gene Primer Sequence CTGF Sense 5'-CTGTGCAGCATGGATGT-3' Antisense 5'-GTGTCTTCCAGT CGATAGG-3'
PDGFD Sense 5'-CAAGCACCATTATTAGAGGACG
Antisense 5'-CTTCCAGCAAAGAATAGTATATCTTGAAA-3'
VEGF Sense 5'-ATCGAGATGCTAGTGGACA-3' Antisense 5'-CGCATGATCTGCATGGT-3'
TGF-β Sense 5'-AGTGGTTGTCCTTTGATGT-3' (primer 1) Antisense 5'-CATGAATAGCAGCCAGGT-3'
TGF-β Sense 5'-CTTTGATGTCACTGGAGTTGT-3' (primer 2) Antisense 5'-CATGAATAGCAGCCAGGT-3'
Type IV Sense 5'-GGGTGATAGAGGTGGCAT-3' Antisense 5'-GAACCAGGATTGCCACG-3'
TIMP-2 Sense 5'-GAAGAAGAGCCTGAACCAC-3' Antisense 5'-TCTCTTGATGCAGGCGAA-3'
GAPDH Sense 5'-TGGCGCCGAGTATGTAG-3' Antisense 5'-TCTCTTGATGCAGGCGAA-3' Table1.Primersforreal-timePCR
2.4통계학적 분석
그룹간 비교는 Studentttest를 이용하였으며,P< 0.05의 값을 통 계학적으로 유의하다고 판단하였다.
제 3장 결과
3.1육안적 평가
선행연구에서 창상 5일과 7일의 결과를 비교분석한 결과,자연치 유력이 매우 왕성하여 대조군과 큰 차이를 보이지 않았기 때문에,본 실험의 경우는 창상 2일과 4일째 소견을 관찰하였다.
창상제작 후 2일 경과 시점에서 희생된 guineapig의 경우 육안적 비교로는 TD88 치료군과 대조군간 유의한 차이를 구분할 수 없었고 창상면에 가피가 잘 형성된 모습이었다(Fig.6).
Figure 6. Gross findings of the control group (left) and TD88-treatedgroup(right)attwodaysaftertreatment.
창상제작 후 4일 경과 시점에서 희생된 guineapig의 경우 육안적 비 교로는 TD88치료군과 대조군간 유의한 차이를 구분할 수 없었고 창 상면에 가피가 잘 형성된 모습이었다(Fig.7).
Figure 7. Gross findings of the control group (left) and TD88-treatedgroup(right)atfourdaysaftertreatment.
3.2조직학적 평가 (H&E stain)
가.창상후 2일
대조군의 상피재생율은 21.2 ± 8.2%인 반면 TD88 치료군은 39.7±
11.5%로 TD88치료군의 상피재생율이 통계적으로 매우 유의하게 높 은 소견을 보였다(P< 0.01).(Table1)
나.창상후 4일
대조군의 상피재생율은 45.4± 18.6%인 반면 TD88치료군은 82.4±
25.6%로 TD88치료군의 상피재생율이 통계적으로 매우 유의하게 높
은 소견을 보였다(P< 0.01).또한 치료군에 속한 3개(33.3%)의 검체 는 상피재생율이 100%를 보였다(Fig.8및 Table2).
Figure 8.Microscopic findings of the controlgroup (upper) and TD88-treated group (lower) at four days after treatment. Non-epithelializedskin defect(whiteline)wasfoundin thecontrol group,howevercompletereepithelializationwasidentifiedintheTD 88-treatedgroup.Scalebar(lower)measures500μm.H&E stain
Duration Group Mean ± SD (%) P value 2 days Control 21.2± 8.2
<0.01 TD88 39.7± 11.5
4 days Control 45.4± 18.6
<0.01 TD88 82.4± 25.6
Table 2.Histomorphometric analysis for reepithelialization rate aftertreatment
3.3조직학적 평가 (Masson'strichromestain)
가.창상후 2일
대조군의 진피결손부는 왕성한 섬유모세포의 증식에 의하여 채워져 있으며 신생혈관과 약간의 림프구가 관찰되었다.섬유모세포 주변으로 는 약한 정도의 교원질이 생성되어 있었으나 TD88 치료군과 뚜렷한 차이는 없었다.
나.창상후 4일
대조군,TD88치료군의 진피결손부는 창상후 2일군에 비교할 때 교 원질 형성이 더 증가한 양상을 보였다.TD88치료군과 대조군의 진피 결손부 교원질 형성정도를 비교한 결과 전체적으로 뚜렷한 차이를 식 별하기는 어려웠으나 일부 증례의 경우 치료군에서 교원질의 감소가 현저한 소견을 관찰할 수 있었다(Fig.9).
Figure 9.Microscopic findings of the dermaldefect site in the controlgroup (left)and TD88-treated group (right)atfour days after treatment. Moderate degree of collagen lay-down was identified in the controlgroup,however mild degree ofcollagen lay-down was noted in the TD88-treated group. Scale bar measures200μm.Masson'strichromestain
3.4분자생물학적 평가
대조군,TD88 치료군을 대상으로 처치 2 일,4 일차의 TGF-β, VEGF,CTGF,PDGF-D 등과 같은 성장인자와 ECM 성분인 type IV collagen과 이들 분해에 영향을 미치는 TIMP-2의 변화를 분석하 였다.PGE2는 선행연구를 통하여 대조군에 비하여 TD88치료군에서 현저히 증가한다는 사실을 확인한 바 있다(unpublisheddata).
TGF-β의 경우 primer를 제작하여 대조군,TD88 치료군을 대상으 로 반복 실험을 하였으나 확인이 불가능하여 또 다른 primer를 제작 하여 반복 실험을 하였으나 검출이 안 되었다.저자들은 해당 인자가 TD88 치료군은 물론 대조군에서도 극소량 존재하여 검출이 안되는 것으로 잠정 결론을 지었다.
PDGF-D는 대조군에 비하여 TD88치료군에서 유의한 감소를 보였다 (Fig.10,11및 Table3)..
Figure 10. qPCR analysis for PDGF-D at four days after treatment.
control group (mean ± SD, x10-2)
treated group
(mean ± SD, x10-2) p value
2 days
4 days
20.5 ± 1.5
81.5 ± 11.4
21.0 ± 11.4
14.6 ± 4.7
0.16
<0.0001 Table3.StatisticaldataforPDGF-D obtainedbyqPCR analysis
Figure11.ComparisonofqPCR dataforPDGF-D attwoandfour daysaftertreatmentbetweencontrolandtreatedgroups.
*,statisticallysignificant,p< 0.0001
Control group (mean ± SD, x10-3)
Treated group
(mean ± SD, x10-3) p value
2 days
4 days
10.0 ± 3.7
30.0 ± 10.6
9.99 ± 2.4
2.23 ± 0.83
0.19
< 0.0001 그리고,CTGF는 대조군에 비하여 TD88치료군에서 유의한 감소를 보였다 (Fig.12,13및 Table4).
Figure12.qPCR analysisforCTGF atfourdaysaftertreatment.
Table4.StatisticaldataforCTGF obtainedbyqPCR analysis
Control group (mean ± SD, x10-4)
Treated group
(mean ± SD, x10-4) p value
2 days
4 days
44.71 ± 37.12
1.64 ± 2.35
17.26 ± 12.41
1.11 ± 1.56
0.101
0.147 Figure13.Comparison ofqPCR data forCTGF attwo and four daysaftertreatmentbetweencontrolandtreatedgroups.
*:statisticallysignificant,p< 0.0001
그러나,VEGF는 대조군과 치료군간 유의한 차이가 없었다 (Table 5).
Table5.StatisticaldataforVEGF obtainedbyqPCR analysis
Control group (mean ± SD, x10-5)
Treated group
(mean ± SD, x10-5) p value
2 days
4 days
7.53 ± 8.82
3.11 ± 3.02
4.836 ± 2.50
1.92 ± 3.19
0.189
0.012 한편,TIMP-2는 대조군에 비하여 치료군에서 유의한 감소가 관찰 되었다 (Figure14,15및 Table6).
Figure 14. qPCR analysis for TIMP-2 at four days after treatment.
Table6.StatisticaldataforTIMP-2qPCR analysis
Figure 15.Comparison ofqPCR data for TIMP-2 attwo and fourdaysaftertreatmentbetweencontrolandtreatedgroups.
*,statisticallysignificant,p< 0.05
또한 TypeIV 교원질은 대조군에 비하여 치료군에서 유의한 중가소 견이 관찰되었다 (Figure16,17및 Table7).
Figure16.qPCR analysisfortypeIV collagen atfourdaysafter treatment.
Control group (mean ± SD, x10-4)
Treated group
(mean ± SD, x10-4) p value
2 days
4 days
4.05 ± 1.38
1.24 ± 3.18
4.96 ± 1.81
5.78 ± 2.93
0.067
0.006 Table 7.Statisticaldata fortype IV collagen obtained by qPCR analysis
Figure17.Comparison ofqPCR datafortypeIV collagen attwo andfourdaysaftertreatmentbetweencontrolandtreatedgroups.
*,statisticallysignificant,p< 0.01.
qPCR 결과를 정리하면 창상부위에 대한 TD88처치는 guinea pig 에서 PDGF-D, CTGF와 TIMP-2를 유의하게 낮추며, type IV collagen은 유의하게 높이지만 VEGF의 변화는 초래하지 않는 것으 로 확인되었다.
제 4장 토 론
피부창상은 여타부위의 경우에 비하여 미용상 문제점 등을 유발하 기 때문에 더욱 민감하다.가장 이상적인 창상치유는 신속하고 흉터없 이 재생되는 것인데 창상치유의 과정은 여러 가지 인자와 단계가 관 여되는 복합적인 과정이다.즉,혈액응고과정,염증과정,신생혈관 형 성 등이 포함된 육아조직 형성과정,그리고 ECM의 형성 및 개조 (remodeling)과정 등이 있다.그리고 창상치유과정에 관여하는 세포 는 창상부 섬유모세포 및 결손부 상피(편평상피)세포,그리고 염증세 포가 있으며 이들은 각각의 세포가 만들어내는 각종 매개물질 (mediators)의 작용에 의하여 그 활성 및 작용이 조절되며 특히 섬유 모세포 및 상피는 환경에 따른 각종 성장인자 및 cytokine등에 의하 여 재생능력이 결정된다[1].
또한 언급된 여러 조건에 의하여 활성화된 섬유모세포의 작용에 의 하여 형성된 ECM은 일차적으로 결손부의 물리적 결손을 복구하고 장 력을 회복하며 비계(scaffold)역할을 담당하여 다른 구조물이 제자리 를 잡을 수 있게 도움을 주지만 ECM의 주성분중 하나인 교원질은 치 유후 다량이 존재할 경우 관절의 구축을 초래하는 등 기능에 지장을 주거나 흉터로 나타나 미용상 문제를 야기하기도 한다.창상치유에 필 수적인 ECM은 이를 분해하는 여러 형태의 matrix metalloproteinase (MMP)와 이의 대사를 담당하는 tissue inhibitor of matrix metalloproteinase(TIMP)등에 의하여 조절되며 개조된다[9,10].
그간의 연구보고 등에 따르면 창상의 치유과정에 발생되는 과도한 흉터는 TGF-β의 과발현과 PGE2의 억제가 주요인인데 임상적으로도 심한 화상으로 비후성 상흔(hypertrophicscar)이 발생될 우려가 있는 경우 화상부위를 소독한 후 압박붕대를 강하게 감아서 흉터를 최소화
하고자 노력을 한다[11].이 경우 환자의 상처부위는 PGE2가 유의하게 올라가게 되고 그 결과 상처부위의 섬유모세포는 근섬유모세포 (myofibroblast)로 전환되는 것이 현저하게 감소하게 된다.근섬유모세 포는 섬유모세포에 비하여 교원질의 생성능력은 물론 조직의 수축에 도 관여하여 많은 근섬유모세포가 형성될 경우 조직구축이나 미용상 문제가 되는 흉터발생 가능성이 증가되게 된다[12].
PG는 생체내에서 오래 유지되지 못하고 세포질에 존재하는 15-PGDH라는 효소에 의하여 빠르게 대사되는데 이 효소의 작용을 조절하여 생체내 PG의 농도를 조절하는 시도가 진행중이다[7,8,13].즉 15-PGDH 억제제를 투여할 경우 해당부위의 PG 대사가 억제되어 높 은 수준의 PG 농도를 유지할 수 있을 것이다.
최근 Wu등[5]은 TD88을 합성하여 이를 창상부위에 적용할 경우 효 과적으로 PGE2가 상승됨을 확인한 바 있다.보고에 따르면 TGF-β의 과발현이 섬유화의 핵심역할을 하는 것으로 되어 있는데 연구대상이 비후성 반흔이나 켈로이드(keloid)에 국한된 연구[14,15]라서 일반 상흔 의 치유과정에도 동일하게 적용가능한지는 추가적인 확인 검토가 필 요하다고 판단된다. 특히 TGF-β는 켈로이드 각질세포(keloid keratinocyte)및 켈로이드 섬유모세포(keloid fibroblast)에서 높게 발 현되고 이는 결과적으로 과도한 섬유화를 일으키고 흉터를 만드는 것 으로 파악된다.더불어 켈로이드 섬유모세포는 정상 섬유모세포에 비 하여 PGE2를 덜 생산하는 것으로 밝혀졌다[16-19].본 연구에서는 이 미 창상실험을 통하여 TD88이 매우 유의하게 PGE2를 높이는 것을 확 인하였기에 TGF-β의 변화에 초점을 맞춰 realtimePCR로 TGF-β 을 분석하였다.하지만 애석하게도 서로 다른 primer를 두 쌍 제작하 여 반복 실험을 시도하였으나 대조군은 물론 실험군 모두 TGF-β를 검출할 수 없었다.저자들은 이와 같은 상황을 실험기법의 문제가 아
닌 TGF-β의 량이 워낙 극미량이어서 검출이 안되는 것으로 결론지었 으며,전술된 내용과 같이 TGF-β가 일반 창상의 치유과정에는 크게 관여하지 않고 비후성 반흔이나 켈로이드와 같은 특수한 상황에 주로 관여하기 때문일 것으로 잠정 결론을 내렸다.
이에 저자들은 추가적으로 창상치유과정에 크게 관여하는 것으로 알 려진 다른 인자들의 변화를 확인하기로 하였다.VEGF는 혈관내피세 포에 선택적으로 작용하여 강력한 유사분열을 일으키는 물질로 종양 신생혈관형성에 가장 중요하며 강력한 인자로 알려져 있다.VEGF는 endothelialcellmitogen으로 작용하여 신생혈관을 형성하게 되고,결 국은 창상의 재생을 촉진시키게 된다.VEGF는 또한 혈관 투과성을 증가시키는 기능이 있어 세포 외 기질에 부종을 야기하고,섬유소를 풍부하게 함으로써 신생 혈관의 성장과 분지를 지지하여 ECM의 발달 을 돕게 된다[20,21].본 연구의 경우 대조군과 TD88치료군의 VEGF 의 유의한 차이는 없었다.
또한 창상치유 과정에서 ECM 형성에 중요한 몫을 담당하기 때문에 흉터형성에 기여할 것으로 기대되는 CTGF와 PDGF-D에 대한 real timePCR 비교분석 결과 TD88 치료군에서 유의한 감소가 관찰되었 다.CTGF는 각막(cornea)대상 실험의 경우 TGF-β1에 의하여 유도 되며 TGF-β1의 여러 가지 섬유증식 효과를 매개하는 것으로 알려져 있으나 CTGF 생성의 정확한 신호전달체계는 아직 충분히 밝혀진 바 없다[22].CTGF는 CCN family에 속하는 단백으로 다양한 ECM 구성 성분의 합성을 촉진한다[23,24].
PDGF-D는 TGF-β1경로에 관여하여 조직의 섬유화를 촉진하고 혈 관의 섬유성 경화를 일으켜 동맥경화를 일으킨다.또한 담관을 결찰하 거나 CCl4에 의한 간독성이 유발될 경우에도 PDGF-D의 상승이 초래 되어 간세포의 손상과 섬유화가 초래되는 것으로 보고되어 있다[25].
또한 PDGF-D는 상처부위의 세포밀도를 높이고 대식구(macrophage) 수의 증가를 초래하며,진피(dermis)의 간질액(interstitialfluid)압력을 높이고 창상치유과정중 신생혈관형성 과정에서 혈관의 성숙을 일으킨 다[26].
본 연구에서 확인된 결과는 TD88처치로 창상치유 과정에 관여하는 CTGF와 PDGF-D의 감소를 유도하여 흉터의 주 요인이 되는 교원질 의 형성을 효과적으로 줄일 수 있을 것으로 판단된다는 점인데 이들 과 깊은 관련이 있다고 보고된 TGF-β에 변화가 없는 것으로 미루어 CTGF와 PDGF-D의 감소에 TGF-β 이외의 인자가 관여하였을 가능 성이 있다 할 수 있다.
ECM은 여러 가지 단백질과 proteoglycan으로 구성된 복합적 구조물 인데 교원질,laminin,fibronectin,tenascin 등이 해당되며 주변조직과 분리시켜 물리적 방어벽(barrier)역할을 하기도 하고,세포부착에 물 리적으로 중요한 지지체 역할을 담당하며, 세포이동의 토대 (substratum)로서 또는 세포간 교신(communication)의 매체(medium) 역할을 담당한다[27].이러한 ECM은 퇴화(degradation)되고 재배열 (rearrangement)되는 과정을 겪게 되는데 이 과정에 여러 가지 MMP 가 작용한다.또한 MMP의 효소활성은 특정 MMP와 친화력이 강한 내인성 억제자(endogenous inhibitor)인 TIMP에 의하여 불활성화가 초래된다[28].예를 들면 MMP-9은 TIMP-1,MMP-2는 TIMP-2와 결합하여 불활성화가 초래되는데 ECM의 주성분중 하나가 교원질이며 이는 MMP-2의 기질(substrate)중 하나로 잘 알려져 있다[29].
상피재생에 필수적인 과정중 하나인 가피(crust)하방으로 각질세포 (keratinocyte)가 그들의 갈 길을 헤집고(dissecting) 이동하는데 plasminogenactivatingsystem과 함께 MMP가 중요한 역할을 담당한 다[29].그러나,Frossing 등[30]의 연구에 따르면 MMP-2는 이 과정
에 핵심적이고 필수적인 작용은 담당하지 않는 것으로 밝혀졌다.따라 서 TIMP-2의 변화를 통하여 교원질,특히 MMP-2의 변화를 예측하 는 것은 진피 재생과정에 형성되는 과도한 교원질 축적에 따른 흉터 (scar)의 형성 가능성을 가늠하는데 중요한 의미가 있을 것으로 판단 되었다.
교원질의 종류는 섬유성 교원질,기저막 교원질 그리고 기타 교원질 로 분류되는데 섬유성 교원질에는 typeI,II,III,V,IX가 속하며 세포 외 섬유성 구조물에 주로 존재한다.그러나 기저막 교원질은 typeIV 가 속하는데 이는 laminin과 판상으로 배열되어 기저막을 주로 구성하 게 된다.상피결손이 초래된 창상부위의 재생에는 기저막의 형성이 필 수적이며 기타 교원질에 속하는 typeVII도 상피와 진피에서 상피세포 와 사이질 세포사이의 부착 섬유구조물을 만들기 때문에 reepithelialization에는 typeIV,VII이 필수적이라고 여겨진다[31].
본 실험의 경우 상피재생에 관여하는 ECM의 주성분중 하나인 type IV 교원질이 치료군에서 유의하게 증가한 것은 TD88이 상피재생에 좋은 영향을 미치고 있음을 증명한다 하겠다.상피 이외,즉 진피 결 손부위의 재생과정에 필수적인 교원질은 대부분 섬유성 교원질로 여 겨지는데 이의 형성 및 개조를 조절할 것은 각종 MMP와 TIMP이다.
MMP와 TIMP는 양적 균형의 기울기에 따라 역할이 결과에 반영되게 되는데[29],본 실험의 경우 MMP-2를 직접 측정하지는 않았으나 이 의 불활성화에 관여하는 TIMP-2가 TD88치료군에서 유의하게 감소 됨이 확인되었다.결국 TIMP-2의 유의한 감소는 해당부위의 MMP-2 를 유의하게 증가시켜 섬유성 교원질의 개조가 이루어져 결과적으로 흉터의 감소로 이어져 창상치유에 긍정적인 효과로 나타나게 될 것으 로 판단된다.
이상의 결과를 토대로 TD88에 의한 효과는 유의한 수준의 PDGF-D
와 CTGF의 감소이나,상피재생에 필수적인 typeIV 교원질은 유의하 게 증가하는 것으로 밝혀졌다.또한,진피결손수 수복에 주로 필요한 섬유성 교원질의 개조에 관여하는 MMP를 조절하는 TIMP-2의 유의 한 감소는 각종 MMP의 증가를 초래하여 흉터의 원인이 되는 과도한 교원질의 축적을 억제할 것으로 판단된다.
따라서 본 실험에서 관찰된 TD88에 의한 유의한 정도의 상피재생능 력과 섬유성 교원질 형성 억제력은 효과적인 PGE2상승작용과 CTGF 와 PDGF-D와 같은 각종 성장인자의 유의한 감소와 ECM의 개조에 관여하는 TIMP-2 억제효과에 의한 것으로 추정된다. 그러나 15-PGDH 억제제의 정확한 작용기전을 밝히기 위해서는 창상치유과 정에 관여할 것으로 판단되는 각종 성장인자,MMP,TIMP 등에 대한 포괄적이고 종합적인 추가분석이 뒤따라야 될 것으로 판단된다.
제 5장 결 론
최선의 창상치료는 흉터 없이 신속하게 재생을 유도하는 것이다.창 상은 또한 그 경중에 따라 동통을 동반하게 되는데 진통제의 선택에 따라 최선의 창상치료에 방해가 초래되는 경우가 발생된다.전술된 최 선의 창상치유는 분자생물학적 관점에서 창상치유과정에 관여하는 여 러 가지 성장인자의 증가를 억제하고 PGE2를 증가시키는 과정이 핵심 이다.이에 저자들은 PGE2의 분해를 담당하는 15-PGDH의 작용을 조 절하여 그 목적을 달성할 수 있다는 가설을 토대로 15-PGDH 억제제 로 합성된 TD88의 성능을 확인하고자 본 실험을 시도하였다.그 결과 TD88을 창상면에 투여할 경우 PDGF-D와 CTGF를 유의한 수준으로 낮추며,창상부의 회복과정에 섬유모세포로부터 교원질의 형성이 감소 되어 창상치유후에 문제가 될 수 있는 흉터의 원인이 되는 교원질의 감소를 유의하게 유도할 수 있다고 판단하였다.더욱이 TD88치료는 결손부 창상의 상피재생(reepithelialization)에도 유의한 효과가 있어 최선의 창상치료 목표인 흉터없이 신속하게 창상의 재생을 유도한다 는 목적에 어느 정도 부합된다고 판단하였다.
결론적으로 15-PGDH 억제제인 TD88은 창상면에서 각종 성장인자 의 효과적인 억제와 함께 상피재생력을 높여 창상치유에 매우 긍정적 인 치료제로 사용될 수 있다고 판단된다.
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한글: Prostaglandin E2 불활성화 효소인 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase 억제제의 창 상치유효과
영어: Effect of 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase inhibitor on wound healing
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