해양생태계 구조 기능변동 모니터링을 위한 돌말류 생태분자마커 개발

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BSPE99245-10638-3

해양생태계 구조 기능변동 모니터링을 위한 돌말류 생태분자마커 개발

2015. 2

한국해양과학기술원

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제 출 문

한국해양과학기술원장 귀하

본 보고서를 “해양생태계 구조 기능변동 모니터링을 위한 돌말류 생태분자마커 개발”과제 의 최종보고서로 제출합니다.

2015. 2.

총괄연구책임자 : 양은찬

참 여 연 구 원 : 노재훈, 최동한, 안성민, 천성준, 이수정

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보고서 초록

과제고유

번호 E99245 해당단계

연구기간 2014.01.01-12.31 단계 구분 1/1

연구사업명 중사업명 주요사업

세부사업명 신진연구자

연구과제명 대과제명

세부과제명 해양생태계 구조 기능변동 모니터링을 위한 돌말류 생태분자마커 개발

연구책임자 양은찬

해당단계 참여연구원수

총 : 6 명

내부: 3 명

외부: 3 명

해당단계 연구비

정부: 48,000 천원

기업: 0 천원

계 : 48,000 천원 총연구기간

참여연구원수

총 : 6 명

내부: 3 명

외부: 3 명

총 연구비

정부: 48,000 천원

기업: 0 천원

계 : 48,000 천원 연구기관명

및 소속부서명

한국해양과학기술원

생물연구본부 참여기업명

국제공동연구 위탁연구

요약 (연구결과를 중심으로 개조식 500자 이내) 보고서

면수 25

○ 시화호 및 태안 근소만 지역에서의 야외채집으로 돌말류 19 배양주 확보

○ 해양성 돌말류 79종 genomic DNA 확보

○ 차세대시퀀싱 분석 2건 (TA394, TA424)

○ 미토콘드리아 유전체지도 완성 (1건, 35,509 bp) 및 GenBank 등록 완료 (KM886611)

○ 돌말류 유전자 서열 분석 및 multiple sequence alignment 완성 - 핵 (nDNA) 18s rRNA: 66개

- 색소체 (pDNA) rbcL: 76개 - 미토콘드리아 (mDNA)

cob: 61개, cox2: 44개, nad5: 49개

○ 생태분자마커 후보 제시: cob, cox2, nad5

색인어 (각 5개 이상)

한 글 돌말류, 분자마커, 미토콘드리아, cob, cox2, nad5

영 어 Diatom, molecular marker, mitochondria, cob, cox2, nad5

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요 약 문

Ⅰ. 제 목

해양생태계 구조 기능변동 모니터링을 위한 돌말류 생태분자마커 개발

Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 1. 연구개발목표

본 연구의 목표는 1) 해양생태계 주요 돌말류의 대표 분자마커 비교 분석하며, 2) 생태분자마커 개발로 해양생태계 구조·기능변동 모니터링 및 생물종다양성 평가의 기반 마련에 있음

2. 연구개발의 필요성

○ 연안해역 식물플랑크톤 군집은 주로 현존량 분포 및 우점율 변동 등으로 연구되었으며, 돌말류는 연안생태계의 대표적인 우점생물그룹으로 주요 연구 대상임

○ 돌말류는 다양한 종수에 비해 분자연구는 매우 미비한 실정이며, 이는

해양생태계 구조 및 기능변동의 이해 및 모델화에 필수적인 기반연구 분야임

Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위

○ 기존 돌말류의 분자분석 결과를 바탕으로 주요 분류군을 선정

○ 주요 분류군의 야외채집 등을 통한 대상 분류군 확보

○ 주요 대상 분류군의 total genomic DNA 확보

○ 돌말류 30여 종의 핵 (nDNA), 색소체 (pDNA) 및 미토콘드리아 (mDNA) 각 유전체의 대표 분자마커 염기서열 시퀀싱 및 비교분석

○ 각 분자마커 특징 및 유용 가능성 비교

○ 미토콘드리아 DNA의 분리 및 차세대시퀀싱을 이용한 분석

○ 미토콘드리아 유전체 consensus sequence 결정 및 annotation 완성

Ⅳ. 연구개발결과

○ 시화호 및 태안 근소만 지역에서의 야외채집으로 돌말류 19 배양주 확보

○ 해양성 돌말류 79종 genomic DNA 확보

○ 차세대시퀀싱 분석 2건 (TA394, TA424)

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○ 미토콘드리아 유전체지도 완성 (1건, 35,509 bp) 및 GenBank 등록 완료 (KM886611)

○ 돌말류 유전자 서열 분석 및 multiple sequence alignment 완성 - 핵 (nDNA) 18s rRNA: 66개

- 색소체 (pDNA) rbcL: 76개 - 미토콘드리아 (mDNA)

cob: 61개, cox2: 44개, nad5: 49개

○ 생태분자마커 후보 제시: cob, cox2, nad5

Ⅴ. 연구개발결과의 활용계획

○ 우리나라 전 연안 및 근해 주요 지역에서의 해양생태 변동 모니터링에 적용

○ 대양 및 전세계에 분포하는 돌말류 특이성 생태분자마커 개발로 확대

○ 해양생태계 주요 구성원인 돌말류 및 다양한 생물군간의 실시간 모니터링 기술로의 발전기반 확대

○ 적조생물 등의 위해성 미세조류의 변동예측 등 종합연구의 기반

○ 유전자료 비교분석 결과는 기후변화에 따른 생물다양성 및 행야생태계기능 변화연구로 발전가능

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목 차

제 1 장 서론 ... 6

1절 연구개발의 필요성 ... 6

2절 연구개발의 목적 ... 8

3절 연구개발의 범위 ... 8

제 2 장 기술개발 현황 및 전망 ... 10

1절 국내·외 기술개발 현황 ... 10

2절 현기술 상태의 취약성 ... 14

3절 앞으로의 전망 ... 14

제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 15

1절 연구개발 수행내용 ... 15

2절 연구개발 결과 ... 17

제 4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 22

제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 22

제 6 장 참고문헌 ... 23

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그림 1. 돌말류의 특성 및 다양성. 돌말류는 전세계 담수 및 해수에 분포하며, 유기물 생산량은 지구 전체 광합성량의 20-25%를 차지함. 돌말류는 탄소(C), 질소(N) 및 규소(Si) 등 물질순환에서 도 중요한 역할을 함. 특히 규산질세포벽 (frustule)을 가지고 있어서, 세포가 살아있는 동안에는 수층에 떠 있으나 세포가 죽으면 가라앉아 쌓여 규조토 (diatomite)를 형성함. 돌말류는 다양한 세 포형태를 가지고 있으며 지구상에 약 10,000 여 종이 있는 것으로 추정됨. 사진은 다양한 형태의 돌말류.

제 1 장 서론

1 절 연구개발의 필요성

1. 기술적 측면

○ 돌말류 (=규조류, diatom)는 해양생태계 주요 구성원 중 하나로 (Round et al.

1990) 광합성기능을 수행하며, 에너지, 탄소 및 실리카 순환 등 생물권전체 물질순 환에 매우 중요한 기능을 하는 대표적인 진핵성 미소식물플랑크톤 (Trequer et al.

1995; Mann 1999) (그림 1)

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○ 연안해역의 식물플랑크톤 군집은 주로 현존량 분포 및 우점율 변동 등으로 연구되 었는데, 돌말류는 연안생태계의 대표적인 우점생물그룹으로 주요 연구대상임

○ 부유성 규조류의 생태적 특성, 일차생산변동 및 환경요인과의 상관관계 (유와 이 1982; 심 등 1991; 여와 심 1992, 1993; 강과 최 2002; 강 등 2003; Choi et al. 2004) 등의 선행연구는 돌말류가 우리나라 연안생태계 변화 모니터링 연구의 주요 대상임 을 보여줌

○ 해양생태변동 연구 중 진핵미소플랑크톤 연구는 주로 광학/전자현미경 등 형태자료 에 의존하고 있음 (e.g. Mann 1999; Amato et al. 2005; Lundholm & Moestrup 2006)

○ 돌말류는 가장 잘 번성한 진핵미소플랑크톤 그룹으로 현재까지 알려진 종수는 약 9,200 여종 임 (Guiry & Guiry 2014; Bacillariophyceae 6,934 종, Bolidophyceae 14 종, Coscinodiscophyceae 1,669 종, Fragilariophyceae 602 종)

○ 돌말류는 다양한 종수에 비해 분자연구는 매우 미비한 실정이며, 이는 해양생태계 구조 및 기능변동의 이해 및 모델화에 필수적인 기반연구 분야임

○ 최근 DNA 염기서열 등 분자자료 분석이 보편화 되면서 돌말류의 핵 (ITS, LSU, SSU), 색소체 (rbcL) 및 미토콘드리아 (cox1) 유전자 자료를 이용한 연구가 시작됨 (Amoto et al. 2007; Evans et al. 2007; Vanormelingen et al. 2007; Casteleyn et al. 2008)

2. 경제 산업적 측면

○ 해양식물플랑크톤은 광합성을 통한 유기물합성과 에너지순환의 핵심기능을 수행하 며, 이 과정에서 탄소, 질소 등 생물권 주요 물질순환에 큰 역할 (Marinov et al.

2006)

○ 식물플랑크톤은 생물학적펌프로써 대기 및 해양의 이산화탄소 감축에 기여함 (Raven & Falkowski 1999, Takahashi et al. 2002)

○ 식물플랑크톤의 발달은 El Nino와 같은 해양수온상승에의한 심층수 수직혼합 약화 에 따른 영양소 공급부족의 영향으로 저해되며, 이산화탄소 고정량 감소 및 어장형 성 방해 등의 결과로 이어짐

○ 따라서 식물플랑크톤 구조 모니터링 자료는 연쇄적인 해양생태계 변동현상을 예측 하는데 필수적인 연구 분야임 (Kristiansen et al. 2001; Miller 2004; Mann 2006;

Miller 2007)

○ 돌말류는 규산질 세포벽을 가지는 대표적인 식물플랑크톤으로써 생물을 통한 규소

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(Si, silica)의 순환에 가장 중요한 역할을 함

○ 봄철 대발생한 돌말류는 사멸침강하면서 수중 규소를 침전시키며 규조토 (diatomite)를 형성함 (Falkowski & Raven 1997)

○ 규조토는 다공질로 흡수성이 높아서 내화제, 흡수제 및 폭약 원료 등 다양하게 사 용되어 산업적으로 매우 중요한 원료

3. 사회 문화적 측면

○ IPCC 제4차 기후변화 2007 리포트에 따르면, 전지구적 규모의 온난화와 기후 및 환경변화는 지속적으로 일어나고 있으며, 앞으로 더욱 심화될 것으로 예측됨

○ 따라서 해양환경변화에 따른 과학적이고 구체적인 생태계변동 정보를 제공하여 대 안수립을 위한 사회적 공감대를 형성해야함

○ 해양식물플랑크톤 모니터링은 해양생태계 변동예측의 매우 중요한 기반요소으로 해양환경변화와 생물상변화에 따른 생태계 기능변화의 핵심적인 정보를 제공함 (Harris et al. 2006)

○ 돌말류 등 식물플랑크톤에 대한 연안 및 대양생태계에서의 광역연구 및 현상자료 확보는 유용해양환경관리를 위한 정책수립의 근거로 활용할 수 있음

2 절 연구개발의 목적

○ 해양생태계 주요 돌말류의 대표 분자마커 비교분석

○ 돌말류 생태분자마커 개발로 해양생태계 구조·기능변동 모니터링 및 생물종다양성 평가의 기반 마련

3 절 연구개발의 범위

1. 해양생태계 주요 돌말류의 대표 분자마커 비교분석

○ 기존 돌말류의 분자분석 결과 (GenBank)를 바탕으로 주요 분류군을 선정

○ 주요 분류군의 야외채집 또는 Algal Culture Collection (CCAP, CCMP, NIES, UTEX 등 국제기관)을 통한 대상 분류군 30여 종 확보

○ 주요 대상 분류군의 total genomic DNA 확보

○ 돌말류 30여 종의 핵 (nDNA), 색소체 (pDNA) 및 미토콘드리아 (mDNA) 각 유전 체의 대표 분자마커 염기서열 시퀀싱 및 비교분석

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○ Maximum Likelihood (ML), Bayesian Inference (BI), Neighbor Joining (NJ) 등 계통분석방법을 통한 분자계통수 작성 및 분자마커 비교

2. 돌말류 생태분자마커개발로 해양생태계 구조·기능변동 모니터링 및 생물종다양성 평가기반 마련

○ 돌말류 기준종 또는 우리나라에 분포하는 대표종 등 연구대상 선정

○ Total genomic DNA 추출, quality 분석

○ 미토콘드리아 DNA의 분리 추출, quality 검증

○ 차세대시퀀싱 라이브러리 제작 및 시퀀싱 수행

○ De Novo assembly, read mapping on ref. db를 통한 data quality check

○ 미토콘드리아 유전체 consensus sequence 결정

○ 유전자 (CDS, intron, exon, tRNA, rRNA) 예측 및 annotation

○ 기존의 데이터 (NC_007405, NC_013710, NC_016739 등)와 비교 분석

○ P-distance, saturation test, bootstrap support value test, topology test 등 비교를 통한 유용분자마커 후보 선정

○ GenBank 등 유전체 DB에 추가 등록 및 기존의 진핵성 플랑크톤 자료와의 비교 분석

○ Repeat region, group II intron 등 돌말류 특이 유전자 비교 연구

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그림 2. 분자자료를 이용한 돌말류 연구의 예. Souffreau 등 (2011)은 핵 (18S, 28S rRNA), 엽록 체 (psbA, rbcL) 및 미토콘드리아 유전자 (cox1)의 다유전자 분석을 통한 돌말류의 계통진화관계 를 연구함. 다유전자 자료에 기반한 돌말류 대표종의 명확한 계통수를 이용하여 돌말류 분자시계 연구로 확대 비교분석함.

제 2 장 국내외 기술개발 현황

1 절 국내 외 기술개발 현황

1. 유전자 분석 기술개발

○ 돌말류의 분자마커 (SSU, LSU, rbcL, cox1 등)를 이용한 연구가 최근 유럽, 미국, 케나다 등에서 시작되고 있으나 유전체, 유전적 다양성 및 생태모니터링에 관한 연 구는 아직 시작단계임 (Cock & Coelho 2011, Zimmermann et al. 2011, Kermarrec et al. 2013) (그림 2)

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○ 진핵성 식물플랑크톤의 연구에는 microsatellite를 이용한 해양돌말류 분포관계 (Godhe & Harnstrom 2010), 분자마커개발 및 형태자료와의 비교 (Lundholm et al.

2012), 계통분류 (Evans et al. 2008), 다유전자 비교 및 분자시계 (Souffreau et al.

2011), 분자계통 및 형태진화 비교 (Kaczmarska et al. 2005; Ruck & Theriot 2011) 등의 연구가 진행 중

○ 차세대시퀀싱 (NGS)기술을 이용한 최근 연구는 메타지놈 비교연구 (Yoon et al 2011), 배양 불가능한 기능집단의 추적 (Roy et al. unpublished), 복잡한 세포소기관 유전체특징 비교 (Ravin et al. 2010; Oudot-Le Secq & Green 2011) 및 담수 돌말 류의 종조성 모니터링 가능성 (Kermarrec et al. 2013) 등을 제시함

○ 우리나라의 식물플랑크톤 돌말류에 대한 연구는 광학/전자현미경을 이용한 주로형 태연구에 집중됨

○ 국립생물자원관은 2009년부터 “대한민국 생물지: 한국의 조류 (Algae)”사업으로 담 수성 돌말류를 포함한 식물플랑크톤의 모노그라프 연구를 수행중이며 주로 세포내 외 미세구조 비교에 집중.

○ 우리나라 돌말류에 대한 연구는 대부분 담수산 종을 대상으로 함. 해산돌말류에 관 한 연구결과는 센털돌말과 (Chaetoceraceae과 55종), 끈원반돌말과 (Thalassiosiraceae과 30종) 및 관돌말과 (Rhizosoleniaceae과 21종) 의 3개과 107종 대한 연구만이 수행됨

○ 분자마커개발 및 분자계통진화 연구는 극히 일부로 담수성 시누라강 (Synurophyceae)의 생물지리연구 (Boo et al. 2010)와 부등편모조 (stramenopiles) 전체에 대한 계통진화연구 (Yang et al. 2012) 뿐임

○ 한국해양과학기술원 노재훈 박사팀은 태안 근소만에서 우점하는 갯벌돌말류에 대 한 계절별, 지점별 다양성 및 생태변동에 대한 연구를 pyrosequencing 등 최신분석 기법을 이용하여 수행 중 (Unpublished data)

○ 해양 돌말류의 생태계 변동 모니터링을 위한 분자마커개발 등의 연구는 국내외에 전무한 실정

2. 분자마커 개발 연구

○ 최근 Zimmermann 등 (2011)은 돌말류의 분자마커개발 연구를 수행하며 핵 유전자 18S rRNA의 V4 부위를 돌말류의 바코딩마커로 제시함. 18S rRNA V4 분자마커는 돌말류 종간 P-distance가 약 0.85로 종 구분에는 유용함 (그림 3)

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그림 3. 유전자자료를 이용한 돌말류 연구. 최근 Zimmermann 등 (2011)은 18S rRNA 유전자의 V4 region을 비교분석하여 돌말류의 DNA 바코딩 마커로 제시. 18S V4 부위는 종간 변이율 (P-distance)이 0.85로 돌말류 종 구분에는 유용한 마커로 판단됨.

○ 최근 Kermarrec 등 (2013)은 돌말류의 분자마커연구를 통하여 핵 유전자 18S rRNA, 엽록체 유전자 rbcL 및 미토콘드리아 유전자 cox1의 유용성을 비교분석. 그 결과 돌말류의 cox1 유전자는 500 bp 이하의 짧은 부분의 분석만으로 18S rRNA (약 2Kbp) 및 rbcL (약 1.2Kbp) 보다 더 유용한 정보를 제공함 (그림 4)

○ 현재까지 알려진 돌말류의 분자자료 (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)는 종 수 (총 9,200 여 종; http://algaebase.org)에 비해 매우 적은 실정. 현재까지 알려진 돌말류의 종수는 Bacillariophyceae강 6,934종, Coscinodiscophycea강 1,669종 및 Fragilariophyceae강 602종이며, 분자자료의 수는 각각 45,854개, 47,875개 및 742개.

그러나 분자마커로 사용가능한 대표유전자 (18S rRNA, rbcL 및 cox1)의 숫자는 매 우 미비함 (그림 5)

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그림 4. 돌말류 분자마커의 비교분석. 핵 유전자 18S rRNA, 엽록체 유전자 rbcL 및 미토콘드리 아 유전자 cox1의 세가지 분자마커의 크기, 유용정보량 분포 및 종 판별력을 비교한 결과 cox1 유전자가 가장 짧은 자료임에도 불구하고 가장 유용함을 나타냄. cox1 유전자는 종 및 종 수준이 상의 해상도 뿐만아니라 종내 지역집단간 비교에서도 높은 해상도를 보임.

그림 5. 돌말류의 종 수 및 현재까지 알려진 유전자료 수. GenBank 등 public DB에 등록된 돌 말류의 유전정보는 Bacillariophyceae강에는 2,416개의 18S rRNA 자료가 등록되어있으나, 종 수 는 302종으로 전체 Bacillariophyceae강의 4% 정도임. 같은 그룹에서 엽록체 rbcL은 5%, 미토콘 드리아 cox1은 0.5% 만이 알려져있음.

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2 절 현기술 상태의 취약성

○ 충분한 유전자 정보를 가지고 있어야 생태계 모니터링을 위한 생태분자마커 개발 이 가능함. 그러나 돌말류의 분자마커 연구는 최근에서야 시작됨

○ 돌말류의 생태모니터링을 위한 생태분자마커 개발을 위해서는 보다 많은 종의 돌 말류 종의 분자자료 분석이 선행되어야 함

○ 핵 18S rRNA, 엽록체 rbcL 및 미토콘드리아 cox1 유전자 등의 대표적인 분자마커 분석이 절실하며 차세대시퀀싱 (NGS)을 이용한 유전체 연구도 필요한 시점

3 절 앞으로의 전망

○ 여러 생물군의 Tree of Life Project가 진행되면서 많은 새로운 분자마커가 개발되 었으며, 특히 미토콘드리아 cox1 유전자는 생물전체가 공유하는 유전자로써 그 유 용성이 검증됨 (Saunders 2005, Yang et al. 2008 등)

○ 차세대시퀀싱 (NGS)기술의 보편화와 생물정보학 툴의 지속적인 발전으로 분자자료 연구는 새로운 환경에 놓임. 일부 생물군의 색소체 (엽록체) 또는 미토콘드리아 유 전체 분석은 NGS기술과 생물정보학 툴을 이용하여 수월하게 완료할 수 있으며 (Kim et al. 2013, Yang et al. 2014 등), 이에 따라 분자마커개발에도 유용

○ 돌말류의 미토콘드리아 유전체 연구는 최근 수행되었으나 (Oudot-Le Secq &

Green 2011), 일부 대표종에 대한 연구만 진행되었을뿐 보다 자세한 연구는 부족함.

○ 최근의 연구결과는 돌말류 미토콘드리아 유전체가 종간 매우 큰 변이를 보여 보다 많은 유전체 자료 분석으로 유전자 및 유전체 수준에서 중요한 정보를 얻을 것으로 판단됨

○ 특히 돌말류의 생태계 모니터링 마커개발을 위해서는 cox1 유전자와 같은 유용한 분자마커의 개발이 필수적임

○ 미세조류 등 식물플랑크톤의 미토콘드리아 유전체연구는 계속 증가할 것이며, 이러 한 유전체정보의 통합적인 비교를 통하여 생태계 모니터링을 위한 생태분자마커의 개발로 발전할 것임

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제 3 장 연구개발 수행내용 및 결과

1 절 연구개발 수행내용

1. 해양생태계 주요 돌말류의 대표 분자마커 비교분석

○ 돌말류 대표종 약 30여 종을 선정하여 대표적인 분자마커를 분석

○ 기존의 돌말류 연구 결과를 GenBank, DDBJ, EMBL 등 주요 public DB로부터 가 져와 local DB 기초자료로 이용

○ 주요 분류군에 대한 채집지 및 분포지 정보 등을 모아 각 그룹별 대표종 또는 대 표배양주를 선정하며, 필요한 재료는 CCAP, CCMP, NIES, UTEX 등의 Algal Culture Collection을 통하여 확보

○ 우리나라 대표종은 근소만 갯벌의 야외채집을 통하여 확보하며, 기존의 배양주를 최대한 활용

○ 확보한 돌말류 30여 종의 핵 (nDNA), 색소체 (pDNA) 및 미토콘드리아 (mDNA) 각 유전자 염기서열을 시퀀싱하여 비교분석

○ 각 유전자의 시퀀싱을 위하여 기존의 프라이머를 이용법 및 새로운 프라이머 디자 인을 통하여 목적유전자를 증폭하여 분석

○ 경우에 따라 종특이 유전자 프라이머 디자인

○ 각 분자마커 비교분석에는 Maximum likelihood (RAxML V.7.2.8), Bayesian (MrBayes V.3.2.2), Neighbor Joining (PAUP* V.4b10) 방법 등을 이용하여 분자마 커간 해상도 비교

2. 생태계 구조·기능변동 모니터링 및 생물종다양성평가를 위한 식물플랑크톤 생태 분자마커 개발

○ 생태모니터링에 이용할 수 있는 돌말류 종 또는 그룹 특이 분자마커를 개발함

○ 분자마커 개발을 위해서는 돌말류의 기준종 또는 우리나라에 분포하는 대표종 등 연구대상 종을 먼저 선정 (그림 6)

○ 선정한 연구대상 종의 total genomic DNA는 Qiagen DNeasy Plant Mini Kit 또는 LaboPass DNA Purification Kit 등을 이용

○ 세포소기관인 미토콘드리아 DNA도 분리 추출하여 total genomic DNA와 quality 비교

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그림 6. 생태분자마커 개발을 위한 주요 연구과정 모식도. 야외에서 채집한 돌말류는 이전자료 (GenBank db 등)와의 비교를 거쳐 대표적인 연구 대상종을 선정한다. 연구대상종 중 고순도 total DNA 확보가 가능한 재료를 대상으로 NGS를 수행하며, 비교분석 및 annotation과정을 거쳐 미토 콘드리아 유전체 지도를 완성한다.

○ 고순도의 DNA 만을 선정하여 차세대시퀀싱 (NGS) 라이브러리를 제작 (400 bp 크 기)하여 NGS 플랫폼에 맞게 시퀀싱

○ 전체 시퀀싱 결과는 MIRA de novo assembler, CLC Genomics Workbench V.5.5.6 de novo assembler 등의 프로그램을 이용하여 contig로 전환한다. Q20 (high quality) data를 이용하여 얻은 전체 contig는 N50 및 Max ctg length 등 주요인자 비교를 통한 quality check로 판단

○ 최적의 contig model은 Geneious V.5.2 등의 프로그램을 이용하여 scaffolding 과정 수행

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pDNA nDNA mDNA

# ID Species Locality Collector rbcL 18S cob nad5 cox2

1 TA455 Melosira sp. 태안 근소만 sma + + + + ―

2 D009 Unidentified COS 시화호 ecy + ― + + ―

3 SH011 Coscinodiscaceae sp. 시화호 sma + + + + +

4 SH005 Porosira sp. 시화호 sma + + + + ―

5 SH002 Skeletonema marinoi 시화호 sma + + + + +

6 SH017 Minidiscus sp. 시화호 sma + + + + +

7 TA430 Bacterosira sp. 태안 근소만 sma + + + + +

8 T.pse Thalassiosira pseudonana - - + + + + +

9 D015 Thalassiosira sp. 시화호 ecy + ― + + +

12 S.acu Synedra acus - - + + + + +

13 D002 Asteroplanus sp. 시화호 ecy + ― + + +

14 SH349 Bacillariaceae sp. 시화호 sma + + + ― +

15 TA353 Bacillaria sp. 태안 근소만 sma + + ― ― ―

16 EW234 Bacillaria sp. 시화호 sma + + + + ―

17 TA44 Nitzschia sp. 태안 근소만 sma + + + + +

19 TA426 Tryblionella sp. 태안 근소만 sma + + + + ―

○ Scaffolding 결과로 얻은 consensus sequence는 다시 Read mapping on reference sequence method를 이용하여 coverage를 확인하여 유전체서열 완성 여부 결정

○ 유전체 consensus sequence는 CDS, intron, exon, tRNA 및 rRNA prediction을 거 쳐 annotation에 이르는 유전체자료 완료

○ 완성한 유전체자료는 기존의 데이터 (NC_007405, NC_013710, NC_016739) 와의 비 교 분석을 통하여 돌말류 특이 분자마커 후보선정

○ 주요 연구과정은 그림 6 참조

2 절 연구개발 결과

1. 야외재료 채집을 통한 배양주 확보 및 total DNA 확보

○ 본 연구를 수행하면서 76개 배양주를 태안 근소만과 시화호에서 확보하였으며, 각 배양주의 total DNA를 확보함 (표 1)

표 1. 본 연구에 사용한 79개 돌말류 배양주 리스트. 3종 (#8. Thalassiosira pseudonana,

#12. Synedra acus, #41. Phaeodactylum ticornutum)의 자료는 GenBank에서 받아 사용.

(19)

20 TA85 Tryblionella sp. 태안 근소만 sma + + + ― ― 21 TA394 Bacillariaceae sp. 태안 근소만 sma + + + + + 22 TA406 Bacillariaceae sp. 태안 근소만 sma + + + + + 23 TA198 Bacillariaceae sp. 태안 근소만 sma + + + + +

24 SH006 Bacillariaceae sp. 시화호 sma + + + + +

25 TA431 Cylindrotheca sp. 태안 근소만 sma + + + + +

26 TA17 Cylindrotheca sp. 태안 근소만 sma + + ― ― ―

27 TA40 Cylindrotheca sp. 태안 근소만 sma + + + + +

28 SH018 Pseudo-nitzschia sp. 시화호 sma + + + ― ―

29 TA37 Nitzschia sp. 태안 근소만 sma + + + ― +

30 EW229 Nitzschia sp. 시화호 sma + + ― ― ―

31 SH020 Nitzschia sp. 시화호 sma + + + + +

32 TA341 Bacillariaceae sp. 태안 근소만 sma + + ― ― ― 33 TA377 Bacillariaceae sp. 태안 근소만 sma + + + + + 34 TA145 Bacillariaceae sp. 태안 근소만 sma + + + + +

35 TA311 Nitzschia sp. 태안 근소만 sma + + + ― ―

38 SH375 Nitzschia sp. 시화호 sma + + ― ― ―

39 TA422 Nitzschia sp. 태안 근소만 sma + + ― + +

40 TA61 Nitzschia sp. 태안 근소만 sma + + ― + +

41 P.tri Phaeodactylum tricornutum - - + + + ― + 42 TA387 Phaeodactylum sp. 태안 근소만 sma + + + + + 43 TA424 Berkeleya fennica 태안 근소만 sma + + + + +

44 TA440 Berkeleya sp. 태안 근소만 sma + + + + +

45 TA417 Amphora sp. 태안 근소만 sma + ― ― ― ―

48 TA70 Bacillariophyceae sp. 태안 근소만 sma + + + + + 49 TA201 Stenopterobia sp. 태안 근소만 sma + + + + +

50 GS5 Surirella sp. 시화호 sma + ― + + ―

51 SH015 Haslea sp. 시화호 sma + + + ― ―

52 SH373 Haslea sp. 시화호 sma + + + ― +

53 TA208 Entomoneis sp. 태안 근소만 sma + + + + ―

54 TA263 Entomoneis sp. 태안 근소만 sma + + + ― ―

55 EW239 Amphoprora sp. 시화호 sma + + ― + +

56 TA410 Entomoneis sp. 태안 근소만 sma + + + + +

57 SH363 Pleurosigmataceae sp. 시화호 sma + + ― ― ―

58 TA400 Gyrosigma sp. 태안 근소만 sma + + + + ―

59 SH007 Pleurosigma sp. 시화호 sma + ― + + +

60 TA149 Pleurosigma sp. 태안 근소만 sma + + + + +

61 SH381 Naviculales sp. 시화호 sma + + + ― +

62 TA280 Haslea sp. 태안 근소만 sma + + + + +

63 TA316 Navicula sp. 태안 근소만 sma + + + + +

66 TA247 Navicula sp. 태안 근소만 sma + + + ― +

67 EW220 Navicula sp. 시화호 sma + + + ― ―

(20)

67 EW220 Navicula sp. 시화호 sma + + + ― ―

68 TA323 Navicula sp. 태안 근소만 sma + + ― ― ―

71 TU3 Navicula sp. 시화호 sma + + + + +

72 TA104 Navicula sp. 태안 근소만 sma + + + + ―

73 TA305 Navicula sp. 태안 근소만 sma + + + ― ―

77 TA413 Navicula sp. 태안 근소만 sma + + ― + +

79 TA243 Navicula sp. 태안 근소만 sma + + ― ― ―

79 69 64 49 47

Data Total bases (bp)

Base ratio (%)

Total no. reads

Read ratio (%)

No.

contigs

Max.

contig (bp) N50 (bp)

Total contig bases (bp)

GC content TA394

CA 5,610,943,709 93.16 37,146,607 84.50 95 5,957 1,543 151,985 40.92 CLC 5,852,424,959 91.58 39,970,086 91.45 12,064 7,396 339 4,160,126 49.80 MIRA 3,515,203,102 58.36 21,659,321 49.27 345,694 7,246 294 94,045,093 44.66 Velvet 5,610,943,709 93.16 37,146,607 84.50 14,788 13,360 205 3,375,239 43.50

TA424

CA 6,016,203,586 93.69 41,916,370 86.49 10,290 32,484 3,654 29,774,499 50.57 CLC 6,259,486,832 96.34 43,092,659 96.29 51,163 193,956 2,199 54,323,282 48.60 MIRA 2,342,005,084 38.88 14,923,614 33.95 138,259 40,196 1,374 98,694,427 48.70 Velvet 6,016,203,586 93.69 41,916,370 86.49 72,580 8,105 710 44,051,655 49.22

2. NGS를 이용한 유전체정보 확보 및 대표종의 미토콘드리아 유전체 지도 완성

○ #21. TA394 Bacillariaceae sp.와 #43. TA424 Berkeleya fennica 배양주의 total DNA 확보, QC 후 NGS 라이브러리 (400 bp chemistry) 제작

○ Ion Proton을 이용한 시퀀싱 수행

- TA394: total 43,962,724 reads (6,023,119,731 bp, ≥Q20 data 4,575,235,533 bp) 시퀀스 자료 확보

- TA424: total 48,466,073 reads (6,421,145,233 bp, ≥Q20 data 5,021,782,073 bp) 시퀀스 자료 확보

○ CLC Genomicsworkbench, Celera, MIRA, Velvet assemblers 프로그램을 이용한 de novo assemblies 확보 (표 2)

표 2. de novo assembly 결과요약. TA394와 TA424의 NGS 결과를 각각의 de novo assembler를 이용하여 분석하였다.

(21)

그림 7. #43. TA424 Berkeleya fennica 미토콘드리아 유전체 지도 및 생태분자마커 개발용 프라 이머 디자인. Gene prediction 및 annotation 과정을 마친 미토콘드리아 유전체는 총 35,509 bp 의 길이로 63개 유전자 (36 CDS, 2 rRNA, 25 tRNA)를 포함함. CDS 부위를 위주로 생태분자마커 개발을 위한 10개 부위의 프라이머를 제작하여 이후 과정에 이용함.

○ NCBI BLAST (blastn, blastp, blastx), Geneious 프로그램 등을 이용한 미토콘드리 아 유전체 annotation 수행 및 지도 완성 (그림 7)

○ Multiple sequence alingment를 거쳐 새로운 생태분자마커 개발을 위한 프라이머 디자인 단계를 수행 (그림 7)

3. 분자마커 후보 유전자 염기서열 분석

○ 돌말류 미토콘드리아 유전체의 10개 부위의 프라이머를 디자인하여 각 부위별 염 기서열 분석을 시도

○ 총 76개 분류군 (표 1)을 대상으로 PCR-Sequencing 테스트를 거쳐 multiple sequence alignment를 기준으로 염기서열 분석의 성공여부 판단

- cob: 64개 성공, nad5: 49개 성공, cox2: 47개 성공 (표 1)

(22)

그림 8. 각 유전자의 saturation test 결과. 색소체 rbcL과 3개의 미토콘드리아 유전자의 변이율 을 유전체 전체와 codon position 별로 비교분석함. 미토콘드리아 유전자는 변이율이 높아 분자 마커로 활용 가능성을 보여줌.

4. 새로운 생태분자마커 선정

○ 3개의 새로운 돌말류 미토콘드리아 분자마커 (cob, nad5, cox2)의 유용 가능성 판 별을 위해 각 유전자의 multiple sequence alignment를 이용함

○ 미토콘드리아 유전자의 codon position별 변이율을 색소체유전자 rbcL과 비교분석 (그림 8)

○ 돌말류 미토콘드리아 분자마커는 rbcL 변이율 (34.1%) 보다 높은 변이율 (cob:

65.6%, nad5: 57.6%, cox2: 66.4%)을 보여줌

○ 특히 3rd codon position의 변이율이 모두 32% 이상으로 rbcL (21.8%) 보다 높아 분자마커로의 활용 가능성이 높음을 제시

(23)

제 4 장 연구개발 목표달성도 및 대외기여도

○ 본 연구의 결과는 2편의 관련 국제논문 출판 및 1편의 국제학회 발표로 목표를 달성함

○ 돌말류 유전자 분석 296건 (rbcL: 76개, 18S: 66개, cob: 61개, cox2: 44 개, nad5: 49개) 및 새로운 미토콘드리아 유전체 등록 1건을 달성하였으며, 최 종적으로 돌말류 생태분자마커 후보 유전자 3개 (cob, cox2, nad5)를 제안함

제 5 장 연구개발결과의 활용계획

○ 추가연구를 통한 우리나라뿐만 아니라 및 전세계 대양에 공존하는 돌말류 특이성 생태분자마커 개발가능

○ 이를 응용하여 해양생태계 주요 구성원인 돌말류 및 다양한 생물군의 실시간 모니 터링 기술로의 발전 가능

○ 본 과제의 결과는 연안생태계 다른 주요 미세조류 대상으로한 생태분자마커 개발 과제로 확대 적용가능하며, 대양생태계 및 해양전체에 대한 생태 구조 및 기능 변동 모니터링 대형연구로 확대 가능

○ 본 연구는 해양 미세조류의 대표인 돌말류만을 대상으로 하고 있으나, 적조생물이 나 위해해양생물 등의 주요현안과 관련된 해양생태계 변동예측 등의 종합연구로 발 전 가능

○ 해양생물상 모니터링 및 유전자료 비교분석 결과는 기후변화에 따른 생물다양성 및 해양생태계기능 변화연구를 발전시켜 생태계모델링의 기초자료로 활용 가능함

(24)

제 6 장 참고문헌

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주 의

1. 이 보고서는 한국해양과학기술원에서 수행한 주요사업의 연구결과보 고서입니다.

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