Chapter 5. 미생물과 산업
1. 미생물과 유전공학
- DNA 분자 modification -> genetic engineering -> Biotechnology 1) Pharmaceutical products(제약)
Insulin Insulin
(lac operon PM-signal sequence-Insulin) 인체세포의 insulin 유전자 확보
대장균의 plasmid vector 에 삽입
대장균에 삽입 (transformation) 대장균 증식 및 insulin 생산
HGH(human growth hormone) HGH(human growth hormone)
대장균에서 발현시킬 때 signal sequence가 문제됨
유전공학에 의해 해결 불필요한 부분 제거 후
재조합 cDNA 합성
Chapter 5. 미생물과 산업
Chapter 5. 미생물과 산업
2) Antisense molecules (안티센스분자)
- mRNA(sense)와 결합-> 단백질합성을 저해하는 RNA분자(antisense) Antisense technology and AIDS
Antisense technology and AIDS
- Coat protein mRNA 등의 inactivation
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3) Biotech Vaccines
Anti-HIV vaccine Anti-HIV vaccine
- Vaccines : 미생물체, 불활성화된 virus, 미생물단편 -> 부작용 문제 -> antigen protein 주사를 이용한 항체형성 유도 -> 문제 해결
HIV 외막단백질 gp120, gp41 유전자클로닝-> 대장균에서 생산
환자주사
gp120과 gp41에 결합하는 항체 생성
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4) DNA Vaccines
- 항원단백질 유전자를 함유한 plasmid - 감염성, 복제능 없이 특정단백질만을 생산 - 현탁액 주사로 면역성유발
5) DNA Analysis and Microbial Detection - DNA probe와 PCR 이용
- DNA probe :
- ss 합성 DNA로서 세포물질 속 상보가닥 DNA 위치 추적 - 방사성동위원소로 label
- target 유전자의 mRNA 단편 분리->reverse transcriptase에 의해 cDNA 합성->PCR PCRPCR
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6) DNA Fingerprinting
- 1985년, Jeffreys -> 유전자들 사이에서 여러 번 반복되는 DNA 단편 발견(intron에 존재) - 사람에 따라 반복정도에 차이
- variable-number tandem repeats, VNTRs(vinters)로 불림 - 제한효소로 VNTRs 가장자리 절단-> 개인별 특이양상 발현 - 유전자검사, 법의학분야에 적용
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7) Methods of Biotechnology A. 올바른 유전자 확보
- mRNA 분리 : Cellulose-linked poly-T DNA ->poly-A tail 에 결합 mRNA 분리 - mRNA 회수 -> cDNA 합성에 이용
- Reverse transcriptase : mRNA 주형으로 cDNA 합성 - DNA polymerase : cDNA를 주형으로 상보적 DNA 합성
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B. Vector에 삽입 :
- marker 유전자 : 항생제 내성유전자 동시 부착으로 selection 용이 - retrovirus : 유용한 vector,
- RNA-containing virus-> 숙주세포에서 DNA 합성-> 숙주세포 염색체 삽입 C. Host cell의 선택 :
- 일반적으로 대장균이용 : 배양용이, 도입유전자 발현빈도 높음, 독성가능성 - 비병원성 세균 (Bacillus subtilis), 효모(Saccharomyces cerevisiae) 등 사용 - 동물세포 : 세포배양 어려움, 고비용
D. 유전자 발현조건 제공
- 재조합유전자 제조 시 : PM 종류, 구조유전자의 배열 등 고려 - inducer 사용 여부
C. Products의 회수
- signal sequence 부착 : 유전자산물 세포외로 분비 - poly tag 부착 -> affinity chromatography 이용 가능
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2. 미생물과 산업
- 생명공학과 미생물을 이용한 Biotechnology industry 1) Industrial Enzymes
- cellulase : stone-washed jean - amylase : 제빵, 맥주제조, 전분분해 - protease : 밀가루 글루텐분해(제빵)
- 육류연화제, 세제 - rennin : 치즈제조
- pectinase : 과일즙 펙틴분해 -> clear juice 2) 유기산, 비타민, 기타
- 구연산(citric acid) : 음료, 캔디, 포도주, 피혁가공 - lactic acid : 식품향료, 보존제
- lysine : 제빵 식품첨가제
- glutamic acid : MSG(조미료)
- steroid : 콜레스테롤, 성호르몬, 관절염치료제 - 향료
- 다양한 항생제
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1) Nitrogen Connection - nitrogen :
- 아미노산을 포함하는 유기물의 필수구성성분 - 세포건조중량의 9-15%
- 미생물 : 년간 200만톤의 질소화합물 생산
- 동물, 식물 : 미생물의 질소고정에 의존 -> 미생물이 없으면?
- nitrogen fixation :
- 미생물의 nitrogenase에 의해 - 질소순환의 연결고리
- 비공생 질소고정균 : Azotobacter, Beijerinckia, Clostridium, Nostoc, Anabaena - 공생 질소고정균 : Rhizobium, Beijerinkickia -> 콩과식물 뿌리에 공생
- nitrogen -> 질소고정세균 -> 암모니아->
-> 아미노산-> 콩과식물-> 젖소 -> 우유, 소괴기 3. 미생물과 농업
- 젖소, 목초, 등등등..
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Nitrogen Cycle Nitrogen Cycle - Nitrogen fixation - nitrification (질산화)
- 암모니아 -> 질산염으로 변환 - Nitrosomonas, Nitrobacter - denitrification (탈질산화)
- 질산이온 분해-> 질소가스 - yeast, Cyanobacteria
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☞ 질소고정관련 생물공학적 과제
- 질소고정유전자의 Agrobacterium 세균에서 발현 - 담배, 페튜니아, 토마토 식물조직에 서식
- 비콩과식물과 공생관계를 갖는 Rhizobium 종 개발-> 자체 질소고정 가능 - 질소고정유전자를 동물에게 이전하면?
2) Ruminants (반추동물)
- 섭취한 탄수화물보다 더 많은 단백질 생산 -> 어떤 비밀?
- 소의 제 1위(rumen, 혹위) : fermentation tank - 일정온도, 약산성, 무산소환경
- cellulase 생산 혐기성미생물 서식
- cellulase 분해 -> 포도당, cellobiose 로 분해
- 포도당분자 이용 유기산 생성 : propionic acid, acetic acid, methane, CO2 - urea 이용 단백질 합성
- 미생물자체는 또 다른 단백질원 - 맹장동물 : 말, 토끼, 돼지 등
- 맹장 내 미생물 -> rumen의 미생물 역할
- 토끼 : 자기 배설물 섭취-> 되새김질 대신 음식물을 두번 소장 통과시킴-> 분식증
반추위의 생화학 반추위의 생화학
Microbes and Rumen Microbes and Rumen
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3) 낙농공장에서
- 젖소가 생산한 우유 : 유지방, 유당, 유단백질, 무기염류 - 유당 : 미생물에 의해 lactic acid로 발효
- Sour cream : 크림의 숙성으로 생산
- Yogurt : Lactobacillus, Streptococcus의 젖산 발효
- Acidophilus milk : 살균된 우유에 L. acidophillus 배양액 첨가 혹은 짧은시간 발효 - Kefir : Lactobacillus, Streptococcus, Saccharomyces kefir 등을 혼합사용
- 발효 중 산, 알코올, 발효가스 생성
- Butter 숙성 : Streptococcus, Leuconostoc -> 산생성, diacetyl 생성-> 독특한 향기 - 치즈 : casein의 응고와 숙성
- rennin, 미생물유래 응고효소 사용 - 다양한 숙성미생물-> 다양한 치즈
- Roquefort cheese : Penicillium camemberti -> blue vein 생성
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4. Biotechnology on the Farm 1) 식물세포로 DNA 도입
- 식물세포배양기술 발전 : 단일식물세포로부터 성체식물 생산
- 식물세포 유전자를 변형시킨 후 성장-> transgenic plant (형질전환식물) - 식물세포로 DNA 단편 주입
-> microinjection (미세주입법), Biolistic (gene shotgun)
-> Agrobacterium tumefaciens의 Ti plasmid(Tumor-inducing) 이용
-> 식물세포에 Ti plasmid 방출-> 식물세포염색체로 삽입-> crown gall 형성 -> Ti plasmid : 세균증식 자극단백질 유전자(종양유전자) 함유
-> 종양유전자 제거 후 외래유전자 도입 -> 세균에 도입 후 식물에 접종
Ti plasmid in Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid in Agrobacterium tumefaciens
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2) Bacterial insecticide(세균살충제)
- 미생물살충제의 요건 : 특정해충에만 작용, 빠르게 작용, 환경안정성, 생분해성, 저가 - 1900 초 Bacillus thuringiensis 가 나방유충 살해 확인
-> 내생포자 형성 시 독성단백질 생산 -> 모충 장내에서 장벽세포 파괴 -> 식물, 대다수 동물에는 무해
-> 포자형성 초기 세균-> 분말형태로 건조 식물체에 살포 -> 빗물에 유실-> 살균효과 제한적
-> 식물세포에 Bt 유전자 직접 삽입시도 -> GMO 옥수수, GMO 목화 -> Bt 독소 내성 유충발현
GMO 목화 Sporulating B. thringiensis
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3) 농업생명공학 연구결과들
(1) 곤충 내 자살유전자(suicide gene) 도입
- 유전자 활성화 후-> 곤충에 치명적 산물 생산 효소 발현
(2) ice-nucleating bacteria(빙핵세균) : 0oC에서 식물체에 얼음결정 형성 관여-> 서리형성 - Pseudomonas syringae
- 얼음형성 관여단백질 유전자 제거(ice-minus bacteria)-> 얼음형성온도 낮춤
- 현장살포-> 빙핵세균 점차 제거(균총변화)-> 식물의 성장기간 증가 -> 생산성 향상
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(3) 제초제 저항성
- Glyphosate : 제초제 주성분-> 엽록체에서 필수아미노산 합성효소 저해 - 대장균 내 동일활성 유전자 : glyphosate에 대한 높은 저항성
-> 유전자클로닝 후 Ti vector 이용 담배, 콩에 도입-> 제초제저항성 GMO 식물
미국내 제초제저항성 GMO 콩의 재배면적
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(4) Pharm animal (약용동물)
- 유전자변형 미생물의 산물을 처리한 동물
- 1983, BGH(bovine growth hormone) 대장균에서 생산 -> 식용소, 젖소에 주사 -> 뼈 근육 성장 촉진, 우유 25% 이상 생산 증가
-> 돼지 근육의 지방 양 감소 (5) Genetically Modified Food (GMF)
- FlavrSavr 토마토 : 썩음 지연 유전자 함유
- 토마토 썩음 : polygalacturonase(PG)에 의한 세포벽 pectin 분해가 원인 -> 토마토 내 PG 유전자 확인 후 활성억제
(6) Veggie vaccines
- 미생물백신 전달자로 야채와 과일 이용
-> 저장비용 저렴, 백신필요지역에서 생산, 무기한 공급, 오염된 주사기 노출방지 -> 요리 도중 일부 파괴의 문제점
- 토마토 : 짧은 생육기간, - 바나나: 아이들용, 요리필요없음
- 해결해야 할 문제 : 소장효소로부터 보호, 알러지반응유도?, 활성성분의 충분한양
Chapter 5. 미생물과 산업
FlavrSavr 토마토 개발 FlavrSavr 토마토 개발
