Изучение кинетики данного процесса показало, что при дозах 2-3 Гр отмечается временная зависимость увеличения уровня РПС ДНК (1,5→4,4 →8,1→6,1% при 2 Гр), (0,91→4,5→7,4→6,8 % при 3 Гр). Доза 1 Гр показала низкую активацию РПС ДНК (0,8→2,23→4,3→4,73% при 1 Гр).
Некоторое снижение индекса репликативного синтеза ДНК к четвертым суткам культивирования облученных клеток, вероятно связано с цикличностью данного процесса, наблюдаемого также и в необлученных (контрольных) клетках (1,5→6,3→16,3→7%). Иная картина отмечена при воздействии дозы 4 Гр, так если в первые сутки синтез не превышает уровня G0 фазы, то в дальнейшем происходит стабилизация синтеза ДНК, однако к концу срока культивирования клеток определен высокий всплеск данного показателя (1,5→4,0→3,9→9,3 %).
Как следует из рисунка 2, пик деления культивированных клеток отмечен на 72 часу, сравнение полученных результатов и контрольного показателя, который принять за 100%, позволяет определить количество клеток участвующих в процессе репликации. Так, при дозах 2-3 Гр в делении участвует 49,7% и 41,7% клеток, тогда как доза 1 Гр снижает уровень делящихся клеток, который составил 26,4%. Если в случае предоблучения дозой 1 Гр можно говорить о стимулирующем действии, то снижение числа клеток до 32,9% при дозе 4 Гр свидетельствует о сбое как генетической программы так и клеточного цикла, чему соответствует смещение пика деления к 96 часу.
Проведенное Пелевиной И.И. и др. [6] исследование динамики нарушения и восстановления синтеза ДНК в клетках линии LL, облученных дозой 6 Гр, показало, что в первое время после облучения, вплоть до 2 часов, происходит прогрессивное уменьшение скорости синтеза ДНК. В дальнейшем способность клеток синтезировать ДНК повышается и через 4-5 часов скорость синтеза достигает контрольного уровня [6]. Эту зависимость авторы объясняют следующим образом. Сразу после облучения в клетках возникают одиночные разрывы ДНК, вызывающие релаксацию суперспирализованной ДНК, в результате чего из процесса синтеза выключаются отдельные кластеры репликонов. Образования разрывов в процессе эксцизии поврежденных оснований ДНК растянуто во времени. Поэтому ингибирование синтеза ДНК в некоторых кластерах также может быть отстрочено во времени после облучения. Одновременно идет и процесс восстановления суперспирализованной структуры ДНК, который завершается к 4-5 часам после облучения.
Методом ДНК-фиброавторадиографии проведено исследование репликации ДНК в клетках здоровых доноров и пациента с атаксией-телеангиэтакзией (AT) [7]. Продемонстрирован новый факт, что в АТ-клетках снижено число одновременно функционирующих кластеров репликонов и уменьшена степень тандемной сгруппированности таких кластеров по сравнению с таковыми в клетках здоровых доноров. Показано также, что облучение в дозе 5 Гр не влияет на частоту активации кластеров репликонов в АТ-клетках. В клетках же здоровых доноров частота активации после облучения снижается, так что они становятся сходными по этому признаку с клетками AT. Эти данные обсуждаются в связи с представлениями о радиорезистентности синтеза ДНК.
В нашем исследовании различия в РПС ДНК выявлены на более поздних сроках облучения до 96 часов культивирования предоблученных клеток крови человека.
80
Таким образом, в клетках после облучения высокими дозами ионизирующей радиации особенности функционирования репликативного синтез ДНК зависят, как от дозы воздействия, так и от сроков постоблученного культивирования клеток крови человека. Индукция и сохранение определенной части нерепарированных повреждений, индуцированных возрастающими дозами радиации, вероятно, создают предпосылки для формирования в последующей нестабильности генома.
Литература
1 Мазурик В.К., Михайлов В.Ф. Радиационно-индуцируемая нестабильность генома: феномен, молекулярные механизмы, патогенетическое значение // Радиац. биология. Радиоэкология.- 2001.- № 3.- С. 272-289.
2 Baverstock K. Radiation-induced genomic instability: a paradigm-breaking phenomenon and its relevance to environmentally induced cancer // Mutat. Res. -2000. -V.454.- N1-2. -P.89-109
3 Газиев А.И. Повреждения ДНК в клетках род действием ионизирующей радиации//
Радиац.биология. Радиоэкология. -1999. -Т.39. -№6. -С.630-638.
4 Weiss RS, Leder P, Vaziri C. Critical role for mouse Hus1 in an S-phase DNA damage cell cycle checkpoint. Mol Cell Biol. 2003 V.3(3).P. 791-803.
5 Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ. ВОЗ. Женева. 1989. С. 53-62
6 Выживаемость облученных клеток млекопитающих и репарация ДНК.
Энергоатомиздат.1985. 120 с.
7 Баренфельд Л. С., Нергадзе С. Г., Плескач Н.М., Михельсон В.М О механизме радиорезистентного синтеза ДНК при атаксии-телеангиэктазии // Цитология . 1997. Т. 39. Вып.1.С.
20-24
Тұжырым
Адам қан клеткаларын радиацияның 1-4 Гр мөлшерінде əсер етіп 96 сағат бойы дақылданған соң ДНҚ-ң синтезінің репликативтік өзгерісін зетттелді. 1-3 Гр мөлшеріндегі радиация əсері клетка бөліну мерзімінен өткен соң өзгерістер тудырматындығы, ал радиацияның 4 Гр мөлшеріндегі əсері РПС төмендетіндігі анықталды, бірақ клеткалардың бөлінуінің шегі 96 сағат шамасында байқалды.
Summary
It was studied the DNA replicative synthesis changes of human cells during 96 hours of cultivation after γ-ray treated. It is defined, that the cell cycle is not changed by influence of 1-3 Gr radiation dose, and dose 4 Gr decreases replicative synthesis but peak of cell division is observed on 96 hours of growth of cell suspension.
Турилова В.И.
ДИНАМИКА СТРУКТУРЫ КАРИОТИПА КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ИХ ДЛИТЕЛЬНОГО СУЩЕСТВОВАНИЯ in vitro
(Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург, Россия)
Множественная миелома (ММ) – одно из наиболее распространенных злокачественных новообразований кроветворной системы человека [1], которое развивается в течение длительного времени и сопровождается значительной перестройкой кариотипа клеток больного [2]. В настоящее время не представляется возможным исследовать динамику кариотипа клеток и различных молекулярных аспектов этого заболевания in vivo. Поэтому в качестве адекватных моделей широко используются клеточные линии ММ, полученные из опухолевого материала [3, 4]. Известно, однако, что в процессе длительного существования in vitro клетки ММ претерпевают существенные изменения кариотипа и генома в целом. В связи с этим вопросы характера и направленности динамического развития таких систем, взаимосвязи их кариотипической эволюции со специфическими механизмами онкогенеза данного типа опухолей становятся чрезвычайно актуальными. Целью настоящей работы было исследование кариотипической изменчивости длительно (в течение 30 ― 40 лет) существующих в культуре клеточных линий ММ человека.
81
Материал и методика
В работе использовали клеточные линии RPMI 8226 [5], U-266 [6], L363 [7] и Karpas 707 [8].
Клетки RPMI 8226 получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Клетки L-363, Karpas 707 и U-266 любезно предоставлены профессором К.
Нильссоном (Университет г. Упсала, Швеция). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Биолот, Россия) с добавлением 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco, США), без антибиотиков.
Препараты метафазных хромосом приготавливали по стандартной методике [9].
Рутинное окрашивание хромосом проводили в 1 %-ном растворе красителя Гимза (Merck, США) приготовленном на фосфатном буфере, pH 6.8 в течение 5 мин. Дифференциальное окрашивание метафазных хромосом на G-диски выполняли модифицированным методом [10].
Модальное число хромосом выявляли при подсчете хромосом в 100 рутинно окрашенных метафазных пластинках. Долю полиплоидных клеток в популяции определяли среди 1000 метафазных пластинок без точного подсчета числа хромосом. Для получения количественных характеристик кариотипов использовали 3−4 препарата метафазных хромосом клеток каждой линии.
Анализ структуры кариотипа и кариотипической изменчивости проводили среди 100 (клетки L 363) и 50 (клетки Karpas 707 RPMI 8226 U-266) окрашенных на G-диски метафазных пластинок.
Препараты анализировали под световым микроскопом Axiophot (Opton, Германия), об.100 .
Метафазные пластинки, окрашенные на G-диски, фотографировали на пленку «Микрат-изопан».
Идентификацию нормальных и перестроенных хромосом проводили по микрофотографиям.
Определение доли численно и структурно перестроенных хромосом осуществляли следующим образом. В каждой клеточной линии подсчитывали количество численно и структурно измененных хромосом по сравнению с нормальным диплоидным кариотипом человека. Это количество относили к числу хромосом в кариотипе данной клетки и получали соответствующую долю. В результате подсчета этого показателя во всех проанализированных метафазных пластинках каждой линии получали его среднее значение.
Представление, а также описание кариотипов и структуры перестроенных хромосом выполнено в соответствии с Международной номенклатурой хромосом человека (ISCN 2005).
Результаты и их обсуждение
Количественные характеристики кариотипов. Клетки всех исследованных линий характеризовались стабильным, четко выраженным модальным числом хромосом (Таблица).
Таблица - Количественные характеристики кариотипов клеток линий Karpas 707, L363, RPMI 8226 и U-266.
Линия клеток Модальное число хромосом*
Пределы изменчивости по
числу хромосом
Доля полиплоидных клеток, %
L363 47 (92 %) 45 ― 48 4.8
Karpas 707 45 (89 %) 43 ― 46 7.8
RPMI 8226 67 (73 %) 65 ― 68 8.2
U-266 44 (83 %) 43 ― 45 21.4
* − В скобках указана доля клеток с модальным числом хромосом
Анализ структуры кариотипов. Кариотипическая изменчивость.
Клеточная линия L363. Анализ окрашенных на G – диски метафазных хромосом в 100 клетках с модальным числом хромосом 47 (преобладающая часть популяции) выявил две субпопуляции, условно обозначенные А и В, кариотипы которых отличались по характеру перестройки одного из гомологов хромосомы 14 (рисунок 1, 2). В кариотипе клеток той и другой субпопуляции структурно перестроенная хромосома 14 (add(14)(q24~q31)) содержала на длинном плече дополнительный материал, размер которого в клетках одной из субпопуляций больше (14q+, субпопуляция А), чем в другой (субпопуляция В).
Перестройки хромосом, обнаруженные в основных структурных вариантах кариотипа клеток L363 представляли собой, главным образом, несбалансированные транслокации, делеции и экстракопирование отдельных хромосом и хромосомных районов. Были выявлены численные изменения хромосом Х (−Х), 7(+add(7)), 8 (+der(8)) и структурные перестройки хромосом 1, 3, 5, 6, 7, 8, 12, 14, 15, 17, 20 и 22. Следует отметить трисомию по длинным плечам хромосом 1, 5, 7, 8 и моносомию по длинному плечу хромосомы 6. Доли численно и структурно перестроенных хромосом
82
L363B_8
в кариотипах которые подсчитывали отдельно для клеток двух субпопуляций различались и составляли 42.40 ± 0.23 % (субпопуляция А) и 40.54 ± 0.06 % (субпопуляция В) (t-критерий Стьюдента, Р< 0.001).
Популяция клеток L363 характеризовалась определенной кариотипической изменчивостью.
Клетки субпопуляции В достаточно однородны по структуре кариотипа (составу нормальных и структурно перестроенных хромосом) (рисунок 2). Наряду с основным структурным вариантом кариотипа (СВК) (90.70 % клеток) был выявлен один дополнительный СВК (9.30 % клеток), в котором обнаружили трисомию по хромосоме 16 (2n=48). Напротив, в клетках субпопуляции А кроме основного СВК (52.63 % клеток, рис.1) выявили ряд дополнительных СВК, представленных в разных соотношениях. Эти дополнительные варианты отличались, как правило, структурной перестройкой одной из хромосом кариотипа. При этом наблюдали только одну клетку с неклональной (редкой) структурной перестройкой хромосом.
Клеточная линия Каrpas 707. Перестройки хромосом, обнаруженные в кариотипе клеток Karpas 707, также как в клетках L363 включали несбалансированные транслокации, делеции и экстракопирование отдельных хромосом. В кариотипе клеток Karpas 707 выявили численные изменения хромосом Y(−Y), 12(−12), 13(−13), 16(−16), 17(−17) и 21(+add(21)). Хромосомы X, 4, 5, 6, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21 и 22 вовлекались в структурные перестройки. Происхождение трех хромосом (mar1, mar2, mar3) установить не удалось (рис. 3). Доля численно и структурно перестроенных хромосом в кариотипе составляла 50.98 ± 0.24 %.
L363A_3-2
47,X,-X,add(1)(?::p36.3→qter),add(3)(pter→q21::?), add(5)(pter→q11.2::?),add(6)(pter→q11::?),+add(7)(?::p13→qter), der(8)(8pter→8q24.?2::5q1?2→5qter)×2,+der(8)(1qter→1q12::8p11.2→8qter),
del(12)(pter→p12::p11.2→qter),add(12)(?::p11.1→qter),
add(14)(pter→q24~31::?),add(15)(pter→q22::?),der(17)(?::17p11.2→17q21::?), del(20)(pter→p11.2::p11.2→qter), add(20)(pter→q11.2::?),
add(22)(pter→q11.2::?).
Рисунок 1 - Основной структурный