ЖАСУШАЛЫ СЕЛЕКЦИЯДА БИДАЙДЫҢ КАЛЛУСТЫ ҰЛПАЛАРЫНДАҒЫ ПЕРОКСИДАЗА ФЕРМЕНТІНІҢ БЕЛСЕНДІЛІГІН
ЗЕРТТЕУ.
Сейтак А, Есенжарова А., Орозалиева Ж.Б. б.ғ.к.
«Национальный центр биотехнологии» г. Астана
Қазақстан Республикасы әлемдегі жоғары, сапалы бидайды шығаруына байланысты ең ірі мемлекеттің бірі болып табылады. Қазақстан Республикасының ауыл шаруашылығының негізгі және стратегиялық маңызды бұтағы ӛсімдік шаруашылығы болып табылады. Солтүстік Қазақстанда бидайды 11,04 млн.га егеді, оның егу ауданы 62% -ға жетеді.
Қазіргі кезде жасушалық селекцияда биотехнологиялық әдістермен сонымен қатар селекциялық жұмыстармен ӛсімдіктердің иммунитетін индукциялауға қоздырғыштардың белгілі бір түрлерін кең қолданды. Бүгінгі күні жасушалық селекция бағытында бағалы бастапқы түрлерді сұрыптау жолдарымен селективті факторларды қолданылады. Осы жолмен селективтік жағдайда тӛзімді каллус линияларын алу, олардан ауру қоздырғыштарына тӛзімді ӛсімдіктерді регенерациялауға мүмкіндік туғызады. Бүгінгі күні осы жол ең актуалды және перспективті болып табылады, ӛйткені селекцияның дәстүрлі әдістері бидайдың морфологиялық, физиологиялық күйін бақылап, керекті қоректік заттарын қоса отырып, бидайдың ӛнімділігіне және сапасына жақсы әсер етеді.
Жұмыстың мақсаты: Селективті ортада бидай сортының каллус ұлпасын ӛсіріп, ондағы пероксидаза ферментінің белсенділігін зерттеу.
Жұмыстың мақсатына жету үшін келесі зерттеу міндеттері алға қойылды:
- Жасушалық селекциясында алғашқы каллус ұлпасын алу;
- Пероксидаза ферментінің белсенділігін анықтау;
Зерттеу объектісі ретінде бидайдың Ақмола 2 сұрыбы пайдаланылды.
Бастапқы материал ретінде Қазақстан Республикасының Ұлттық Биотехнология Орталығының ӛсімдіктер селекциясы мен биотехнологиясы зертханасынан сыпайы әкелген зертханалар қызметкерлерінің жаздық жұмсақ бидай сортын қолдандық.
Алғашқы каллус ұлпаларын алу стандартты әдіс бойынша жүргізілді. Эксплант ретінде жетілген ұрық тұқымдары алынды. Тұқымдарды сабынды сумен жуып, 10минут ішінде 70% хлораминмен ӛндеп, автоклавтанған суда ламинар-бокста 1 күнге қалдырдық. Келесі күні ламинар бокста ассептикалық жағдайда тұқымдарды қайтадан 70% хлораминмен ӛндеп, 3 рет автоклавтанған сумен шайып, агарланған қоректік ортасы бар чашки Петриге отырғыздық.
Оларды жарық жоқ жерде 26°С термостатта культивирлеуге орнатылдық. Каллустардың пайда болуына 4 қоректік орта қолданылды:
1) бақылау Мурасиге және Скуг; 2) МС+0,3% NaCl; 3) МС+0,75% NaCl; 4) МС+1% NaCl;
Әр қоректік ортаны 0,5л мӛлшерінде дайындадық. Бақылау Мурасиге және Скуга коректіқ ортада жүргізілді. минералдық ортаға макротұздар 25мл, микротұздар 0,5мл, Fe-хелат 2,5мл, тиамин-НCl 0,5мл, мезоинозит -50 мг, 2,4Д-1,5мл, сахароза 15г, CaCl2-0,220мг, агар 3,5г және рН ортасы -5,8. Осы ортаны автоклавта 0,8 атм. 30 мин. ішінде стерилдейді.
Клеткалық селекция. Бір сатылы клеткалық селекцияны жасаған кезде бидайдың ұрықтары Мурасиге және Скуг қоректік ортасына қосылған натрий хлоридінің 0,3% үшін 1,5г, МС+0,75% NaCl ортасы үшін 3,75г NaCl және МС+1% NaCl ортасы үшін 5г NaCl қосылып отырғызылған.
Ӛсімдік жасушаларында кӛптеген ферменттер болады. Олар ӛсімдік организміндегі биохимиялық реакцияларды жүргізуге қатысады. Сол ферменттердің бірі пероксидаза ферменті. Пероксидаза - тірі организмдерде кең тараған фермент. Бұл фермент ӛсімдіктің тіршілігінде кӛптеген үрдістерге- ӛсіп- дамуы, морфогенез, стресс факторынан қорғануға
қатысады. Пероксидаза жасушаның белгілі бір факторлардан қорғаныш қызметін атқаратындықтан белсенділігі әсіресе фитопатогендермен зақымданған ӛсімдіктерде басымдылық кӛрсетеді. Пероксидаза химиялық табиғаты жағынан оксиредуктаза тобына жататын фермент, яғни сутегі асқын тотығы кӛмегімен тотығу процесін катализдейді де соның нәтижесінде кӛк түсті концентрация пайда болады. Тотығу реакциясы келесі сызба- нұсқа бойынша жүреді:
AH2+H2O2---пероксидаза---A+2H2O мұндағы AH2-сутегінің доноры; Ф- тотыққан донор;
Әр түрлі генотиптерге пероксидаза белсеңділігінің артуы әр қалай әсер етеді. Бұл сорттардың патогендерді қабылдау дәрежесіне байланысты. Тӛзімді генотиптерді іріктеуде жасушадағы пероксидаза белсенділігі тӛзімсіздермен салыстырғанда жоғары болады.
Зерттеуіміздің мақсаты әртүрлі селективті ортада ӛсірілген бидай каллус ұлпаларының құрамындағы пероксидаза белсенділігінің ӛзгеруін анықтау. Селективті агент ретінде – Мурасиге және Скуг қоректік ортасына қосылған натрий хлоридінің әр түрлі концентрациясы қолданылды.
Пероксидаза белсенділігін А.Н.Бояркиннің ұсынған әдісі бойынша анықталды. Бұл әдіс ӛсімдік клеткасы құрамындағы фермент әсерінен бензидиннің тотығу реакциясының жылдамдығына, фотоэлектроколориметрде алдын-ала орнатылған белгілі концентрациялы кӛк түсті тотығу ӛнімінің түзілуіне негізделген.
Бидайдың Ақмола 2 сортының каллустарынан 200 мг ӛлшеп алынып, алдын-ала дайындалған рн 4,7 ацетаттық буфері ерітіндісімен біркелкі массаға дейін кәрлен келілерде езілді де, буфердің кӛмегімен 50 мл колбаға құйылды. 10 минутке шейкер араластырғышқа қойылды. Нәтижесінде пероксидаза ферменті ерітіндіге айналды. Сол ерітінді 1,5 мл эппендоров пробиркаларына құйылып, 3000 айн/минутында 15 минут центрифугаланды. Шығарғасын тұнбадан басқа ерітіндіні, яғни үлгінің үстіңгі бӛлігі ферменттің белсенділігін анықтау үшін қолданылды.
Қобдишалар құрал ұясына орнатылып, оптикалық реттеушінің кӛмегімен жарық ағындары теңестірілді. Басында гальванометрдің тілшесін нӛлге теңестіріп, кейін есеп жүргізу үшін гальванометрдің тілшесін оң жаққа ауыстыру үшін оң барабанды бұрамыз (экстинкция Е= 0,125 немесе 0,250). Содан соң сол жақтағы бақылау қобдишасына 2 мл дистелденген су, ал оң жақтағы тәжірибелі қобдишасына 2 мл 3% сутек асқын тотығы құйылды да, сол кезден бастап бірден секундомер іске қосылды. Пероксидаза ферменттінің әсерінен кӛк түсті қосылыстың түзілуімен бензидиннің тотығу реакциясы жүреді. Оны 5-суреттен кӛруге болады.
Тәжірибелі қобдишасындағы ерітінді кӛгереді, гальванометрдің тілшесі оң жақ шеттен нӛлдік белгіге бағытталады. Секундомерді гальванометрдің тілшесі нӛлге жеткен кезде тоқтатып, кенет мезгіл белгіленеді. Ферменттің белсенділігін анықтағанда гальванометрдің тілшесі нӛлге 20-50 секундтан кейін жеткен дұрыс болады.
Ферменттің белсенділігі (А) реакция жылдамдылығымен шартты бірлікпен есептеледі және 1г ӛсімдік материалына белгіленеді. Есептеуді келесі формула бойынша жүргізеді
А =E (ab) / н сt (1)
мұндағы, А- 1г аспадағы ферменттің белсенділігі;
Е- экстинкция (0,125 немесе 0,250);
а- ерітіндінің кӛлемі (50 мл);
b- кюветаның реакциондық қоспадағы ерітінді кертартпа дәрежесі;
н- ӛсімдік материалының аспасы;
с- кюветтегі ерітіндінің қалың қабаты (2см);
t- уақыт, сек.
Зерттеу нәтижесі бойынша пероксидаза ферментінің белсенділігінің ӛзгеруі каллусты ӛсіруге арналған қоректік ортаның құрамындағы натрий хлоридінің концентрация мӛлшеріне байланысты болды.
