3
ОСОБЕННОСТИ CISTANCHE DESERTICOLA ФЛОРЫ КАЗАХСТАНА Жакупова А.С., Сарсенбаев К.Н.
Евразийский Национальный Университет, Астана, Казахстан.
[email protected]
Научный руководитель – д.б.н., профессор, Сарсенбаев К.Н.
Флора Казахстана представляет собой неисчерпаемый источник биологически активных веществ. Из-за малой изученности биохимического состава растений флора Казахстана используется весьма ограничено. Это особенно характерно для такого ценного растения как цистанхе сомнительная, чрезвычайно популярного среди создателей лекарственных средств. Из цистанхе уже выделено и идентифицировано около 10 новых соединений. Основным поставщиком этого растения в мире является Казахстан, хотя в республике он не используется. Для получения первоначальных знаний об этом виде были изучены некоторые морфологические и биохимические особенности моинкумских и мангышлакских популяций цистанхе.
У этого вида ранее состав изоферментов и белков не изучался. Существуют методические трудности работы с цистанхе – столон практически на 95–98% состоит из воды, высокомолекулярных соединений мало. Другой орган - корешок (гаусторий) 1–3 см длины, почти одревесневший для исследований не годится. Листья отсутствуют. На протяжении цветоноса очень много мелких цветков. По предыдущему опыту мы знали, что цветы гетерогенны по составу ферментов и белков. Для хемосистематических исследований популяций не пригодны. Исходя из этого мы не использовали цветы, а для сравнительных исследований популяций брали среднюю часть столона.
Одним из наиболее чувствительных показателей к действию различных факторов среды является пероксидаза. Практически при действии любых повреждающих факторов среды наблюдается изменение активности и компонентного состава этого фермента. Компонентный состав пероксидазы достаточно надежно характеризует состояние популяции растений. В связи с этим с помощью метода изофокусирования мы изучали компонентный состав пероксидазы столона у 9 различных популяций цистанхе.
Изоформы пероксидазы мы разделяли методом изофокусирования. У компонентов изоточки имеют рН в пределах от 4 до 10. Количество компонентов в зависимости от популяции колеблется от 13 до 21. Наиболее гетерогенный спектр у мангышлакского образца. Число компонентов у него достигает 21. Общая схема расположения компонентов у всех образцов одинакова. Различия выявляются по компонентам со щелочной и нейтральной рН. У мангышлакской и у 30 популяции больше компонентов с нейтральной рI, а у 26 (цветки) и 28 (столоны) со щелочной.
Обычно у цветов спектр фермента богаче, чем у столонов.
Компонентный состав неспецифичной эстеразы изучался методом изофокусирования. Изоэлектрические точки у этого фермента располагались в пределах рН 4–6. Число компонентов было одинаковым – 14. Можно отметить более высокую активность компонентов у популяций 26 и 28. У 26-ой популяции изоточки активных компонентов расположены в области рН 4,8–5,2, а у 28-й популяции в области 5,7–6,0. Самое интересное, что спектр фермента у магистауских и моинкумских популяций, а также столонов и цветов был одинаковым.
Компонентный состав кислой фосфатазы также гетерогенен и у исследованных
популяций неодинаков. Число компонентов в спектре в зависимости от особенностей
популяции и органа колебалось от 7 до 11. Обычно число компонентов в спектре у
варианта столон больше, чем - цветок. Наименьшее число компонентов в спектре
4
было у мангистауского образца – 7. У него отсутствовали щелочные и часть нейтральных компонентов.
Количество зон активности растворимых белков цистанхе колеблется от 2 до 8.
Образец из 1 популяции с.Моюнкум отличается от остальных наличием в цветоносах четковыраженной щелочной зоны активности (pH 9-9,5). Белки 2, 3 являются общими для всех образцов. В зависимости от исследуемой части растений больше зон отмечено в соцветиях (7-8), меньше в столонах (2-4).
Таким образом нами показаны особенности жизненного цикла, особенности анатомического строения корневища, цветоноса, стебля и клубенька. Выделены и идентифицированы основные физиологически активные вещества цистанхе – иридоиды. Показаны различия между популяциями по составу растворимых белков, полипептидов, неспецифичной эстеразы, кислой фосфатазы, пероксидазы.
Подобран рецепт физиологически активного препарата из цистанхе. Показано, что это не однолетнее, а многолетнее растение. Основным способом размножения является семенной. Однако распространѐн и вегетативный, путѐм закладки почки в месте прикрепления гаустория паразита к корню саксаула.
УДК: 619:576.807.7
ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ХЛОРАМФЕНИКОЛУ
Жумалин А.Х, Куйбагаров М.А.
НИИ биотехнологии АО «Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина», г. Астана, E.mail: [email protected]
Научный руководитель – доктор ветеринарных наук, профессор Булашев А.К.
В настоящее время все большее значение приобретает проблема отрицательного влияния остаточных количеств антибиотиков, находящихся в продуктах питания в количествах, превышающих допустимые уровни, на здоровье человека.
В качестве объекта исследований был выбран хлорамфеникол (левомицетин) – антибиотик широкого спектра действия часто применяемый в сельском хозяйстве. В отличие от многих препаратов хлорамфеникол медленно выводится из организма животных, сравнительно долго сохраняет свою активность при хранении продуктов и оказывает негативное действие на кроветворную систему. Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов не допускают присутствия хлорамфеникола в мясе, молоке и яйцах.
Низкие концентрации антибиотика можно обнаружить только с помощью высокочувствительных современных методов. В современной мировой практике для этой цели широко используются методы на основе иммуноферментного анализа (ИФА) *1, 2, 3+. Одним из основных реагентов при этом являются специфические антитела. При этом получение иммуноглобулинов к антибиотикам (как и к другим гаптенам) остается трудновыполнимой задачей, поскольку в чистом виде они не вызывают иммунного ответа.
5
В связи с этим, целью данной работы было получение штаммов гибридом продуцентов МКА специфичных хлорамфениколу.
В качестве высокомолекулярных белков-носителей использовали бычий сывороточный альбумин (БСА) с молекулярной массой 66 кД (Sigma), овальбумин (ОВА) с молекулярной массой 45 кД (Sigma). Также в качестве носителя был использован латекс (Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, 0.9 μm mean particle, Sigma). В качестве сшивающего агента использовали 1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (EDC) (Sigma). Для конъюгации использовали
«Левомицетин – КМП» (хлорамфеникол) ОАО «Киевмедпрепарат», Украина.
Синтез конъюгатов хлорамфеникола (ХАФ) с БСА и ОВА проводили с использованием препарата 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (EDC). Очистку конъюгатов от не связавшихся реагентов проводили на колонке (15х1,5 см) с сефадексом G-25. Элюирование проводили с помощью Tris-HCl буфера (рН-7,5).
Для синтеза конъюгата хлорамфеникола с латексом (1% суспензия) также использовали EDC с конечной концентрацией 1 мг/мл.
Иммунизацию мышей линии Balb/c проводили конъюгатом латекс-ХАФ внутрибрюшинно в дозе 0,1 мл 4 раза в течение 14 суток. Через 7 суток проводили реиммунизацию. Взятие крови у иммунизированных мышей проводили через 3 дня после последней иммунизации и исследовали в непрямом варианте ИФА. Для этого ячейки 96-луночного планшета для иммунологических реакций сенсибилизировали конъюгатами БСА-ХАФ и ОВА-ХАФ на фосфатно-солевом растворе (ФСР) рН 7,2 в концентрации (30 мкг/мл), при 4ºС в течение ночи. После этого вносили антителосодержащую жидкость, инкубировали при 37ºС в течение 60 минут. Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра с вертикальным потоком света (ASYS Expert 96) при длине волны 450 нм.
Гибридизацию клеток миеломы Х63Ag 8.653 и иммунных спленоцитов проводили по методу *4+.
Клетки после гибридизации высевали в ячейки 96–луночного планшета (Nunc, Дания) с «питающим слоем» перитонеальных клеток и инкубировали при 37ºС в атмосфере с 5% СО2. В качестве селективной среды использовали RPMI-1640, содержащую гипоксантин, аминоптерин, тимидин (ГАТ) (Sigma). По истечении 14 суток проводили контроль роста слившихся клеток путем просмотра культур под инвертированным микроскопом.
Определение изотипов МКА проводили в ИФА с использованием набора специфических антисывороток к различным классам мышиных иммуноглобулинов ISO2 (Sigma).
В результате тестирования сывороток крови иммунных мышей было определено, что конъюгат латекс-ХАФ активно стимулирует иммунную систему животных, титры антител при этом составляли 1:3200-1:6400. От линейных мышей были выделены иммунные спленоциты и использованы для гибридизации с миеломными клетками.
Тестирование культуральной жидкости клонов проводили в непрямом варианте ИФА. В качестве антигенов для сенсибилизации лунок планшета были использованы как конъюгаты хлорамфеникола с белковыми носителями (ХАФ-БСА, ХАФ-ОВА) так и чистые препараты носителей (БСА, ОВА). Тестирование показало наличие в культуральной жидкости 3-х гибридом (2D9, 3B11, 4B8) антител, специфичных эпитопам хлорамфеникола. При повторном тестировании стабильность и специфичность сохранили антитела гибридомы 3B11. При дальнейшем тестировании антител установили их высокую активность по отношению к хлорамфениколу в составе белкового конъюгата и отсутствие реакции с белками-носителями.
6
Гибридомы штамма 3B11 были подвергнуты клонированию методом лимитирующих разведений. В результате клонирования для дальнейшей работы были отобраны субклоны с наибольшей активностью в ИФА (3B11F8, 3B11C6, 3B11G7). Титр антител культуральной жидкости субклонов, при которых еще обнаруживалось связывание антител в ИФА, был в диапазоне 1:64- 1:128. Определение изотипа показало, что полученные МКА относятся к классу IgM. Продуктивность штаммов in vitro составила 60-125 мкг/мл.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены штаммы гибридом, продуцирующие моноклональные антитела специфичные антигенным эпитопам антибиотика хлорамфеникола. Результаты исследований могут быть использованы при разработке экспресс- методов определения остаточных количеств хлорамфеникола в продуктах животного происхождения.
Список использованной литературы:
