Васильева З.Ж1., Берсимбаев Р.И.2, Бекманов Б.О.2, Воробцова И.Е.1
СВЯЗЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ GSTM1 и GSTT1 С УРОВНЕМ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ У РАБОЧИХ УРАНОВОГО
ПРОИЗВОДСТВА
Исследована связь полиморфизмов генов GSTM1 и GSTT1 с уровнем хромосомных аберраций у рабочих Целинного горно-химического комбината, которые в результате профессиональной деятельности в течение 1-25 лет контактировали с производными урана. В исследованных группах рабочих наблюдалось достоверное, по сравнению с контролем (р<0,001), увеличение частоты хромосомных аберраций, в основном за счет – парных ацентрических фрагментов и одиночных фрагментов. Не выявлено взаимосвязи полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 с уровнем цитогенетических нарушений.
В процессе профессиональной деятельности человек подвергается воздействию различных антропогенных факторов, как химической, так и физической природы. Ключевая роль в метаболизме поступающих извне соединений принадлежит системе детоксикации ксенобиотиков. Вариации в активности ферментов детоксикации и индивидуальная чувствительность к воздействию токсических агентов обусловлена полиморфизмом генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков. Установлено, что экспрессия полиморфных вариантов этого семейства генов непосредственно регулируется влияниями средовых факторов химической природы [1].
Полиморфизм генов GSTM1 и GSTT1 является одним из факторов, влияющих на
частоту хромосомных аберраций при воздействии пестицидов, табачного дыма, ароматических углеводородов и т.д., при этом «нулевой» генотип GSTM1 обусловливает увеличение частоты аберраций хроматидного типа, а полная делеция по обоим генам: GSTM1 и GSTT1, ассоциируется с повышением частоты аберраций хромосомного типа [2]. Изучение влияния генных полиморфизмов на уровень хромосомных повреждений в когортах лиц, подвергающихся хроническому воздействию ионизирующего излучения может увеличить чувствительность цитогенетических показателей как биомаркеров генотоксического воздействия, а также помочь в идентификации групп риска. В связи с этим, целью настоящего исследования явилось изучение роли полиморфизма генов глутатион-S-трансферазы (GSTM1 и GSTT1) в индивидуальном цитогенетическом ответе на хроническое воздействие ионизирующей радиации.
Материалы и методы
Обследуемая группа состояла из 100 рабочих Целинного горно- химического комбината (ЦГХК) в г.Степногорск, Северного Казахстана, которые в процессе профессиональной деятельности контактировали с производными урана в течение 1-25 лет. В зависимости от профессионального стажа группа рабочих была разделена на 2 подгруппы: со стажем работы от 1 до 12,5 лет (50 человек); и со стажем работы – от 12,5 до 25 лет (50 человек). Контрольную группу составили 56 жителей Джамбулского района Алматинской области. Перед взятием биопроб крови, совместно с медицинскими работниками проводили анкетирование когорт, регистрируя: возраст, пол, профессиональный стаж, наличие заболеваний.
Никто из представителей контрольной группы не подвергался терапевтическому облучению, не имел профессионального контакта с химическими и радиоактивными веществами. Контрольная и экспонированная группа были выравнены по возрасту (+/- 5 лет); полу; национальности; в обеих группах не было зарегистрировано серьезных заболеваний.
Пробы крови забирали из локтевой вены в стерильные пробирки с гепарином для цитогенетического анализа и с ЭДТА - для молекулярно- генетического. Пробирки в специальном контейнере, при температуре +4-6ОС, транспортировали для анализа в диагностическую лабораторию в течение 10 час.
Культивирование лимфоцитов проводили по стандартной методике [3]. К 200 мкл гепаринизированной крови добавляли 6,13 мл среды RPMI (Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK), 0,61 мл сыворотки крупного рогатого скота (Sigma Chemical Co., St.
Loius, USA), 0,06 мл пенициллина-стрептомицина (Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK), 0,12 мл глутамина (Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK) и 0,07 мл ФГА (Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK) и инкубировали в термостате при 370С в течение 72 час. Колцемид в конечной концентрации 0,01мкг/мл (Gibco, New-York, USA) добавляли за 2 часа до снятия культуры. Через 72 часа культивирования клетки обрабатывали гипотоническим раствором 0,075 М КСL в течение 10 мин, трижды фиксировали в смеси метанол-ледяная уксусная кислота в объемном соотношении 3:1. Готовую суспензию клеток наносили на чистые охлажденные и влажные стекла. Высохшие мазки окрашивали 6%
красителем Романовского-Гимза в течение 10 мин. Анализ хромосом производили с помощью светового микроскопа фирмы ―Leica‖ (Germany), при суммарном увеличении х 1000.
Геномные мутации (анеуплоидия, полиплоидия) не учитывали, поскольку наиболее информативным показателем влияния мутагенов среды являются хромосомные аберрации. Пробелы (гэпы) в число аберраций не включали.
Регистрировали все типы хромосомных аберраций, доступные для анализа при равномерном окрашивании хромосом (дицентрики, центрические кольца, парные и одиночные фрагменты). При микроскопическом исследовании метафазных пластинок придерживались критерия отбора и анализа препаратов, изложенных в работах Бочкова Н.П. и др. и Захарова А.Ф.и др.[3,4]. Всего было проанализировано 31200 метафазных пластинок. Для каждого человека анализировали по 200 метафаз. Хромосомный анализ проводили на зашифрованных препаратах методом ―слепого контроля‖.
Выделение ДНК из клеток крови проводили стандартным методом с фенол- хлороформной очисткой. Молекулярно-генетический анализ был проведен в США (Department of Preventive Medicine and Community Health, The University of Texas Medical Branch, Galveston). Генотипирование для генов GSTM1 и GSTT1 проводили с помощью мультиплексной ПЦР, используя соответствующие праймеры:
GSTM1: 5’-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C 5’-GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G;
GSTT1: 5’-TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC 5’- TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA.
Электорофорез амплифицированных фрагментов ДНК проводили в 2%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Гомозиготность по «нулевым»
аллелям генов GSTM1 и GSTT1 определяли по отсутствию специфических фрагментов размером 480 п.н. (для GSTT1) и 215 п.н. (для GSTM1).
Полученные результаты обрабатывали традиционными методами вариационной статистики [5]. Достоверность различий определяли, используя t - критерий Стьюдента, метод 2, дисперсионный анализ.
Результаты и обсуждение
Цитогенетическая характеристика обследованных групп
Результаты цитогенетического обследования групп представлены в таблице 1. Всего в экспонированной группе обнаружено 508 хромосомных аберраций, т.е.
аберрации встречались с частотой 2,54±0,11%. Подавляющее большинство составляли парные ацентрические фрагменты – 387 (1,93±0,09%). Частота одиночных фрагментов составила 0,29±0,03%. Также были выявлены нестабильные хромосомные обмены (НХО) (0,31±0,04%), среди которых было 47 дицентриков и 16 центрических колец.
В первой и второй группах рабочих, имеющих профессиональный стаж от 1 до 12,5 лет и от 12,5 до 25 лет, соответственно, выявлено увеличение частоты хромосомных аберраций, в основном за счет парных ацентрических фрагментов.
Уровень НХО в первой группе оказался выше, чем во второй. По-видимому, уменьшение количества НХО связано с длительным культивированием (72 часа), которое было предпринято с целью сохранения материала, вследствие длительной транспортировки крови. Выявлена тенденция к увеличению цитогенетических нарушений у рабочих, имевших более длительный профессиональный стаж.
Обнаружены достоверные различия по частоте хромосомных аберраций между двумя экспонированными группами и контролем (р<0,001).
При обследовании контрольной группы среднегрупповая частота клеток с аберрациями составила 0,56±0,07%, из них доля НХО составляла 0,17±0,04%, парных фрагментов - 0,39±0,05%, одиночных фрагментов – 0,06±0,02%.
Полученные нами результаты по частоте хромосомных аберраций в контрольной группе согласуются с аналогичными данными других исследователей [6-8].
Авторами было показано, что при обследовании 437 взрослых здоровых жителей г. Москвы, (проанализировано более 70 тысяч клеток), частота спонтанных хромосомных аберраций в культивированных лимфоцитах периферической крови человека составила 1,16%, при этом выявленные нарушения хроматидного типа, в основном одиночные фрагменты, составили более 50% всех аберраций [6].
Согласно данным Снигиревой с сотр., при цитогенетическом анализе 48124 метафаз от здоровых доноров доля НХО составила 0,02% [7]. В аналогичной работе других авторов, было обнаружено 36 НХО из 51893 проанализированных метафаз, что составило 0,07% [8]. Опираясь на эти результаты можно утверждать, что колебания частоты спонтанных аберраций хромосом у здоровых доноров, не подвергавшихся прямому радиационному воздействию, находятся в пределах 1- 2%.
Известно, что в горнодобывающей промышленности, в частности, урановой, рабочие подвергаются хроническому влиянию ионизирующей радиации, в основном за счет радона и его дочерних короткоживущих продуктов [9].
Выявленное нами увеличение хромосомных нарушений у профессиональных рабочих подтверждается данными других исследователей, показавших, что у шахтеров уранодобывающих предприятий наблюдалось увеличение клеток с
хромосомными аберрациями по сравнению с контролем [10,11,12]. Также показано, что увеличение числа аберрантных клеток по сравнению с контролем наблюдалось не только у лиц, занятых на переработке и добыче урана, но и у населения, проживающего вблизи уранодобывающих предприятий [13].
Таким образом, опираясь на наши собственные данные и результаты исследований других авторов можно заключить, что воздействие производственных факторов уранового производства на рабочих вызывает генотоксический эффект, выражающийся в увеличении частоты хромосомных аберраций. Цитогенетический анализ показал как увеличение частоты аберраций хромосомного типа – парных ацентрических фрагментов, дицентрических хромосом и центрических колец, являющихся известными маркерами радиационного воздействия, так и аберраций хроматидного типа – одиночных фрагментов, образование которых может быть вызвано комбинированным воздействием радиации и химических мутагенов.
Связь цитогенетических показателей с генотипом
Глутатион-S-трансферазы (GSTs) — полигенное суперсемейство изоферментов, включающее 7 семейств: α, μ, π1, σ, , κ, ξ [14]. Синтез глутатион-S-трансфераз контролируется различными генами, в которых выявлены полиморфизмы, приводящие к изменению активности фермента. Наибольший интерес представляют члены семейств μ и . Известно, что члены семейства μ (GSTM) - GSTM1, GSTM2, GSTM3, GSTM4, GSTM5, GSTM6, локализованы на хромосоме 1р13 [15]. Для гена GSTM1 установлены две мутации: точковая замена, не имеющая функциональных проявлений [16], и протяженная делеция гена (10 т.п.н.), которая приводит к полному отсутствию синтеза белкового продукта [17]. Член семейства - ген GSTT1 локализован на хромосоме 22q11.2. Полиморфизм этого гена, обусловлен наличием двух аллелей — функционально активной (GSTT1*1) и неактивной (GSTT1*0)
(нулевой). Аллель GSTT1*0 соответствует частичной или полной делеции, приводящей к снижению или отсутствию ферментативной активности [18].
Результаты генотипирования полиморфизма генов (GSTT1 и GSTM1) у рабочих Целинного горно-химического комбината и в контрольной группе представлены в таблице 2. Гены GSTT1 и GSTM1 анализировались на наличие или отсутствие делеции, т.е. «+/+» - нормальная аллель гена, наличие делеции по одному гену «+/-»,
«-/+»соответственно, «-/-» - полная делеция. Частоты гомозигот по делециям генов GSTT1 и GSTM1 среди рабочих составили 19% и 62%, соответственно. Полная делеция по двум генам GSTМ1 и GSTТ1 была выявлена у 8% рабочих. Полученные нами результаты по распространенности нулевого генотипа GSTT1 и GSTM1 согласуются с аналогичными литературными данными [4, 5].
В таблице 3 приведены результаты по связи полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 с цитогенетическими нарушениями (хромосомные аберрации) у обследованных лиц. Из полученных данных видно, что для отдельно взятых
«плюсовых» и «минусовых» локусов генов GSTM1 и GSTT1, не было выявлено достоверно значимых различий по частоте хромосомных аберраций. Вместе с тем, у индивидуумов, как с делецией по отдельно взятым локусам этих генов, так и с полной делецией по двум генам GSTM1 и GSTT1, наблюдалась тенденция к увеличению частоты хромосомных аберраций, однако эти различия не достоверны. Результаты, полученные нами, согласуются с данными других авторов. В научном исследовании, проведенном совместно несколькими европейскими лабораториями (Италия, Норвегия, Дания, Финляндия), по взаимосвязи между частотой хромосомных аберраций, риском рака и генетическом полиморфизмом GSTM1 и GSTT1, не было установлено ассоциации между полиморфизмом генов (GSTM1 и GSTT1) и уровнем хромосомных аберраций, однако была выявлена зависимость между хромосомными нарушениями и риском рака [19]. В работе Сальниковой с соавторами также не выявлено взаимосвязи между частотой хромосомных аберраций с генотипами по отдельно взятым локусам (GSTM1, GSTT1, GSTP1 и MTHFR) у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС [20].
Известно, что многие химические вещества, как эндогенные, так и поступающие из окружающей среды, обладают способностью усиливать синтез ферментов биотрансформации ксенобиотиков, что существенным образом определяет чувствительность организма к действию токсикантов. К числу сильных индукторов ферментов принадлежат и многие промышленные яды. Установлено, что индукция происходит за счет повторного попадания соединения в организм. Добыча и переработка урановой руды сопряжена с комбинированным воздействием на контингент профессиональных рабочих ряда потенциально вредных факторов: 1) радиоактивных элементов (урана, радия, тория и др.), входящих в виде аэрозолей в состав пылевой фракции воздуха; 2) радиоактивных газов радона и торона с дочерними продуктами распада; 3) внешнего - и -излучения урановой руды; 4) технологическим применением в урановом производстве активных реагентов с токсическими свойствами (паров кислот и щелочей) и присутствующих в руде химических соединений (пятиокиси фосфора, свободной двуокиси кремния, свинца, мышьяка и др.), многие из которых являются канцерогенами [9]. Таким образом, в результате хронического воздействия выше перечисленных соединений уранового производства происходит, по-видимому, постоянная индукция фермента глютатионтрансфераза, что приводит к истощению запаса глютатиона в клетках.
Показано, что при поступлении токсикантов, в организме одновременно протекают процессы детоксикации и репарации. При однократном поступлении данных соединений в организм, интенсивность этих процессов может быть достаточной для компенсации ущерба, связанного с образованием реактивных метаболитов, однако при повторном воздействии, защитные механизмы могут оказаться несостоятельными, что приведет к развитию токсического процесса. Возможно, вследствие перечисленных выше причин, не обнаружено различия по частоте хромосомных аберраций между индивидуумами имеющими «плюсовой» и «минусовой» генотипы (таблица 3).
Авторы выражают глубокую признательность профессору У. Ау за предоставление результатов генотипического анализа, а также Амиргалиевой А. и Ибраимовой Ж. за помощь в культивировании лимфоцитов.
Научно-исследовательская работа проведена в рамках Международного гранта - «Мониторинг населения Северного Казахстана, проживающего вокруг урановых рудников» Грант CRDF КВ2-2289 (США).
Таблица 1. Частота хромосомных аберраций у рабочих Целинного горно-химического комбината и в контрольной группе
Группа Количество метафаз (человек)
Количество аберраций,
%
НХО (дицентрики +
центр.кольца),
%
Парные фрагменты,
%
Одиночные фрагменты,
%
I 10000(50) 2,410,15а-*** 0,36 0,06 1,790,13 а-** 0,260,05 а-**
II 10000 (50) 2,670,16 а-*** 0,270,06 2,080,14 а-** 0,320,05 а-**
Всего 20000 (100) 2,540,11 а-*** 0,310,04 1,93 ± 0,09а-** 0,290,03 а-**
Контроль 11200 (56) 0,560,07 0,170,04 0,390,05 0,060,02
Примечание: а- отличие от контрольной группы,** - p< 0,01; *** - p< 0,001
Таблица 2. Частоты генотипов GSTM1 и GSTT1 у рабочих Целинного горно-химического комбината и в контрольной группе
Генотип Локус Рабочие ЦГХК, % Контроль, %
GSTМ1 +/+ 38 59
-/- 62 41
GSTT1
+/+ 81 73
-/- 19 27
Таблица 3. Распределение хромосомных аберраций в зависимости от генотипа (GSTM1 и GSTT1) у рабочих Целинного горно-химического комбината и в контрольной группе
Локус Генотип I группа
(стаж 1-12,5 лет, n=50)
II группа
(стаж 12,5-25 лет, n=50) Контроль
(n=56)
Количество метафаз (людей)
Количество аберраций
Частота аберраций
Количество метафаз (людей)
Количество аберраций
Частота аберраций
Количество метафаз (людей)
Количество аберраций
Частота аберраций
GSTM1 + 4200 (21) 88 2,10±0,22 3400 (17) 70 2,05±0,24 6600 36 0,54±0,08
- 5800 (29) 127 2,20±0,19 6600 (33) 163 2,47±0,19 4600 20 0,43±0,09
GSTT1 + 7800 (34) 157 2,01±0,16 8400 (42) 185 2,20±0,16 8200 44 0,53±0,07
- 2200 (11) 58 2,63±0,34 1600 (8) 48 3,00±0,43 3000 12 0,4±0,07
GSTM1 / GSTT1
-/ - 1000 (5) 32 3,20±0,56 600 (3) 22 3,60±0,77 1600 4 0,25±0,01
+/ - 1200 (6) 26 2,16±0,42 1000 26 2,60±0,50 1400 8 0,57±0,02
-/ + 4800 (24) 95 1,97±0,20 6000 141 2,35±0,19 3000 16 0,53±0,01
+ /+ 3000 (15) 62 2.06±0,26 2400 44 1,83±0,27 5200 28 0,53±0,09
Таблица 4. Распределение хромосомных аберраций в зависимости от генотипа (GSTM1 и GSTT1) по квартилям
Локус Генотип I квартиль II квартиль III квартиль IV квартиль
N (человек)
Частота аберраций
N (человек)
Частота аберраций
N (человек)
Частота аберраций
N (человек)
Частота аберраций
GSTM1 +
21 4200
0.16±0.06 18
3600
0.80± 0.14 16 3200
1.65± 0.22 16 3200
3.28±0.31
-
18 3600
0.16± 0.06 21 4200
0.85± 0.14 23 4600
1.78± 0.19 23 4600
4.04±0.29
GSTT1 +
28 5600
0.14± 0.05 32 6400
0.84± 0.11 34 6800
1.72± 0.15 28 5600
3.69±0.25
-
11 2200
0.22± 0.09 7
1400
0.78 ±0.23 5
1000
1.80± 0.42 11 2200
3.81±0.40
GSTM1 / GSTT1
-/ -
5 1000
0.10± 0.09 5
1000
0.70± 0.26 1
200
2.5±1.10 5
1000
4.5±0.65
+ /+
15 3000
0.10 ±0.05 16 3200
0.78± 0.15 12 2400
1.60±0.25 10
2000
3.3±0.39
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Баранов В.С., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены «предрасположенности»; Введение в предиктивную медицину. СПб.:Интермедика, 2000.271 с.
2. Scatpato R., Hirvonen A., Migliore L. et al // Mut.Res. 1997. 389. Р. 227- 235.
3. Бочков Н.П., Демин Ю.С., Лучник Н.В. // Генетика. 1972, Т. 8, № 5, С.133-141.
4. Захаров А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов Н.П., Барановская Л.И. Хромосомы человека: Атлас. Москва: Медицина. 1982. 264с.
5. Рокицкий П.Ф. Введение в статистическую генетику. Минск:
Вышейшая школа. 1978. 448с.
6. Бочков Н. П., Чеботарев А. Н. Наследственность человека и мутагены внешней среды. Москва: Медицина.1989. 272с.
7. CнигиреваГ.П., Новицкая Н.Н., Хазинс Е.Д., Вилкина Г.А.// Матер.
Межд. конф. «Проблемы радиационной генетики на рубеже веков».
Москва. 2000. С.331.
8. Горбунова И.Н., Иванов К.Ю., Нагиба В.И. // Матер. Межд. конф.
«Проблемы радиационной генетики на рубеже веков». Москва .2000.С.259.
9. Андреева О.С., Бадьин В.И., Корнилов А.Н. Природный и обогащенный уран. Радиационно-гигиенические аспекты. Москва. Атомиздат. 1979.
212с.
10. Берсимбаев Р.И., Шарипов И.К., Какабаев А.А. // Биотехнология.
Теория и практика. 2000. № 3-4. С.18-21.
11. Meszaros G., Bognar G., Koteles G.J. // Journal of occupational health.2004.
V.46.P.310-315
12. Smerhovsky Z, Landa K, Rössner P, Juzova D, Brabec M, Zudova Z, et al.//
Mutat Res. 2002. 514. Р.165-176.
13. Аu W.W., Lane R.G., Legator M.S., Whorton E.B., Wilkinson G.S., Gabehart G. J. // Environ. Health Persent.1995. № 5. Р.466-470
14. Landi S. // Mutat. Res. 2000. 463. P. 247-283.
15. Pearson W.R., Vorachek W.R., Xu S.J. et al. // Am.J.Human Genet.1993.53.P. 220-233.
16. De Long J.L., Chang T.M., Whang-Peng J. et al. // Nucleic. Acid Res. 1988.
V. 16. P.8541-8554.
17. Seidegard J., Vorachek W.R., Pero R.W. et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.
1988.V. 85.P. 7293-7297.
18. Pemble S., Schroeder K.R., Spencer S.R. et al. // Biochem J. 1994. V. 300.
P. 271-276.
19. Rossi A.M, Hansteen I-L., Skjelbred C.F., Ballardin M. et al.
//Environ.Health.Perspect. 2009. February. 117. (2). P.203-208.
20. Сальникова Л.Е., Фомин Д.К., Елисова Т.В., Акаева Э.А., Кузьмина Н.С., Лаптева Н.Ш., Нилова И.Н., Иофа Э.Л., Костина Л.Н., Кузнецова Г.И., Куликова Т.А., Панушкина О.Г., А.В. Рубанович. // Радиац.
биология. Радиоэкология. 2008. Т.48 №3. С. 303-312.
