УДК 637.032

(1)

144

УДК 637.032 DOI 10.56339/2305-9397-2023-2-2-144-153

МРНТИ 34.15.05

Байменов Б.М.,магистр ветеринарных наук, https://orcid.org/0000-0001-9063-7651

НАО «Костанайский региональный университет имени А. Байтурсынова», г. Костанай, ул. А.Байтурсынова 47, 110000, Казахстан, [email protected]

Чужебаева Г.Д.,кандидат ветеринарных наук, https://orcid.org/0000-0002-0091-8888

Алиева Г.К.,магистр ветеринарных наук, https://orcid.org/0000-0002-0550-6639

Серикбайов О.Н., https://orcid.org/0009-0008-6139-5524

Chuzhebaeva G.D., Candidate of Veterinary Sciences, https://orcid.org/0000-0002-0091-8888

NJSC "Kostanay Regional University named after A. Baitursynov", Kostanay, st. A. Baitursynov 47, 110000, Kazakhstan, [email protected]

Baimenov B.M., Master of Veterinary Sciences, https://orcid.org/0000-0001-9063-7651

Alieva G.K., Master of Veterinary Sciences, https://orcid.org/0000-0002-0550-6639

Serikbayov O.N., https://orcid.org/0009-0008-6139-5524

NJSC "Kostanay Regional University named after A. Baitursynov",

Kostanay, st. A. Baitursynov 47, 110000, Kazakhstan, [email protected]

РАЗРАБОТКА РЕКОМБИНАНТНЫХ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ КОНТРОЛЕЙ ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ STAPHYLOCOCCUS AUREUS ИSTREPTOCOCCUS AGALACTIAE

В МОЛОЧНОЙ ПРОДУКЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ ЛОКУСОВ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ

DEVELOPMENT OF RECOMBINANT POSITIVE PCR CONTROLS FOR DETECTION OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND STREPTOCOCCUS AGALACTIAE IN DAIRY PRODUCTS AND DETERMINATION OF THEIR ANTIBIOTIC RESISTANCE LOCI

Аннотация

В статье представлены результаты конструирования рекомбинантных положительных контрольных образцов, путем клонирования в плазмидные вектора pTG19-T фрагментов генов DQ507382.1; U58139.2, MF095627.1, HF679144.1, HF679144.1, AB368369.1, KX687892.1, MG786937.1. Данные гены несут специфические фрагменты последовательностей для S. aureus: гена термостабильной нуклеазы (nuc); генов резистентности к антибиотикам группы бета-лактамов (blaZ), макролидов (ermC) и тетрациклинов (tetK); а также для Str. agalactiae: гена, кодирующего глюкозокиназу (glck) и генов резистентности к антибиотикам группы бета-лактамов (pbp), макролидов (erm), тетрациклинов (tetM).

Плазмиды с фрагментами генов успешно выявлялись с помощью ПЦР, это подтверждает, что все интересующие последовательности были правильно лигированы в плазмидные векторы и могут быть использованы в качестве положительных контрольных образцов.

Разработанные положительные контроли показывают правильное протекание полимеразной цепной реакции, качественность реагентов, используемых в эксперименте, оптимальность температурно-временных режимов и отсутствие ингибиторов ПЦР.

Исследование выполнено в рамках Научно-технической программы BR10764944

«Разработка методов аналитического контроля и проведения мониторинга безопасности пищевой продукции» на 2021-2023 годы.

(2)

145 ANNOTATION

The article presents the results of constructing recombinant positive control samples by cloning gene fragments DQ507382.1 into pTG19-T plasmid vectors; U58139.2, MF095627.1, HF679144.1, HF679144.1, AB368369.1, KX687892.1, MG786937.1.These genes carry specific sequence fragments for S. aureus: thermostable nuclease (nuc) gene; genes for resistance to antibiotics of the group of beta- lactams (blaZ), macrolides (ermC) and tetracyclines (tetK); and also for Str. agalactiae: the gene encoding glucose kinase (glck) and the genes for resistance to antibiotics of the group of beta-lactams (pbp), macrolides (erm), tetracyclines (tetM).

Plasmids with gene fragments were successfully detected by PCR, confirming that all sequences of interest were correctly ligated into plasmid vectors and can be used as positive controls.

The developed positive controls show the correct course of the polymerase chain reaction, the quality of the reagents used in the experiment, the optimal temperature and time regimes, and the absence of PCR inhibitors.

The study was carried out as part of the Scientific and Technical Program BR10764944

"Development of methods for analytical control and monitoring of food safety" for 2021-2023.

Ключевые слова: ПКО, ПЦР, плазмида, ген, S. aureus, Str. agalactiae.

Keywords: PCS, PCR, plasmid, gene, S. aureus, Str.agalactiae.

Введение. С момента своего открытия в 1980-х годах [1,2,3], полимеразная цепная реакция (ПЦР) получила дальнейшее развитие и, до настоящего времени используется в молекулярной диагностике.

Разработка молекулярных методов, особенно тестов на основе ПЦР, позволяет быстро идентифицировать патогенные микроорганизмы непосредственно из образцов [4,5,6,7,8]. ПЦР в реальном времени позволяет отслеживать амплификацию мишени дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) во время проведения ПЦР, в реальном времени, а не в конце, как в случае традиционной ПЦР.

Однако остается вопрос, связанный с контролем проведения ПЦР в реальном времени. В нашем исследовании, для подтверждения правильности работы детекционной смеси, контроля амплификации нуклеиновых кислот-мишеней, нами разработаны положительные контрольные образцы путем клонирования продуктов ПЦР в плазмидные векторы, содержащие в себе все мишени ПЦР. Рекомбинантные плазмиды, содержащие целевые последовательности генов, широко используются в качестве положительных контролей для диагностики методом ПЦР [9,10].

Анализы ПЦР требуют использования положительных контролей для получения достоверных результатов. В качестве положительного контрольного образца можно использовать эталонные штаммы бактериальных культур, однако данный подход имеет ограничения при диагностике опасных заболеваний, так как культивирование опасных агентов, производство и концентрация биомассы связаны с дополнительными рисками. Использование плазмидных положительных контролей более надежно для таких целей [11]. Разработанные плазмиды могут быть использованы в качестве безопасного и эффективного положительного контроля для подтверждения правильности работы детекционной смеси при лабораторной диагностике методом ПЦР.

Целью исследования была разработка рекомбинантных положительных контролей, несущих специфические вставки последовательностей для S. aureus и Str. agalactiae и генов резистентности к антибиотикам группы бета-лактамов, макролидов и тетрациклинов.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1 Получение необходимых фрагментов ДНК при помощи ПЦР;

2 Проведение лигирования pTG19-T и фрагмента ДНК;

3 Трансформация плазмиды в E. coli (штамм DH5α);

4 Получение и выделение плазмидных конструкций.

Материалы и методы исследований. Исследования по разработке и клонированию положительных контрольных образцов проводили на базе испытательной лаборатории НИИ прикладной биотехнологии «КРУ имени А. Байтурсынова» (Костанай, 110005) и в ТОО

«Национальный центр биотехнологии» (Астана, Z05K8A3).

Для разработки положительных контролей, продукты ПЦР клонировали в плазмидные вектора pTG19-T [12]. На данном этапе проведены следующие эксперименты: амплификация фрагмента при помощи ПЦР; проведение электрофореза в агарозном геле; очистка ПЦР смеси по

(3)

146

протоколу QIAqick 28104; проведение лигирования pTG19-T и фрагмента ДНК; трансформация плазмиды в E. coli в штамм DH5α; ПЦР скрининг плазмид с праймерами, получение и выделение плазмидных конструкций.

Для получения необходимых фрагментов генов, были использованы праймеры к олигонуклеотидным последовательностям генов полученные в предыдущем исследовании: для S.

aureus: участок гена термостабильной нуклеазы (nuc), гены резистентности к антибиотикам группы бета-лактамов (BlaZ), макролидов (ermC) и тетрациклинов (TetK); для Str. agalactiae:

кодирующий глюкозкиназу (Glck), гены резистентности к антибиотикам группы бета-лактамов (pbp 2x), макролидов (Erm) и тетрациклинов (tetM) [13,14].

В качестве положительной ДНК-матрицы использовались полевые штаммы S. aureus и Str.

agalactiae полученные период с 2021 по 2022 годы из молока от коров с клиническими и субклиническими формами мастита из молочных хозяйств Костанайской области. Выделенные штаммы бактерий были идентифицированы в нашем предыдущем исследовании микробиологическими методами, где так же представлены данные тестирования чувствительности выделенных изолятов S. aureus и Str. agalactiae к антибактериальным препаратам [15].

Геномную ДНК фенотипически идентифицированных колоний S. aureus и Str. agalactiae экстрагировали методом кипячения [16]

Вставки фрагментов генов (DQ507382.1, U58139.2, MF095627.1, HF679144.1, HF679144.1, AB368369.1, KX687892.1, MG786937.1) [17] были синтезированы с помощью ПЦР по стандартному протоколу, но без зондов. ПЦР проводили в 20 мкл.реакционной смеси. В 1х реакционной смеси концентрация магния 3 mM, концентрация каждого нуклеотидтрифосфата 0,2 mM, концентрацию праймеров в реакционной смеси оставили стандартной – 400 nmol/l.

Результаты амплификации детектировали на агарозном геле. Очистка ПЦР смеси производили по протоколу QIAqick 28104 (рисунок 1) [18].

Рисунок 1 – Процедура связывания-промывки-элюирования со спин-колонками

Клонирование продуктов ПЦР проводили с помощью вектора pTG19-T, предназначенного для быстрого и эффективного клонирования продуктов ПЦР. Для трансформации лигазной смеси использовали хемокомпетентные клетки E. Coli DH5a компании «Thermo Fisher Scientific», согласно протокола производителя (рисунок 2) [19].

(4)

147

Рисунок 2 – Схема клонирования продуктов ПЦР

Скрининг выросших колоний проводили методом бело-голубой селекции, выросшие белые колонии пересевали на чистый агар и анализировали методом ПЦР с разработанными праймерами.

Для выделения плазмидной ДНК использовали набор реагентов «GeneJet plasmid Miniprep Kit» компании «Thermo Fisher Scientific» по протоколу производителя [20].

Результаты и их обсуждение. ДНК экстрагировали из одиночных колоний S. aureus и Str.

agalactiae. Образцы хранили при температуре -20°C и использования в качестве матриц для проведения ПЦР.

Разработанные праймеры к выбранным участкам последовательностей генов с указанием модификаций зондов, идентификационными номерами генетической базы данных национального центра биотехнологической информации [17] и размеров амплифицируемых продуктов представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Нуклеотидные последовательности праймеров Вид

м/о Последовательности праймеров (5′-3′) Целевы е гены

Gene ID

Размер ПЦР продукта (п/н)

1 2 3 4 5

S.

aureus

AATATGGACGTGGCTTAGCGT

nuc

DQ5 0738 2.1 AGCCAAGCCTTGACGAACTAA 77

FAM-TGCTGATGGAAAAATGGTAAACGAAGC- BHQ1

AAGACGGTGTTCCAAAAGACT

blaZ U581

39.2 193

ACACTCTTGGCGGTTTCACT

JOE-AGGTTGCTGATAAAAGTGGTCAAGCA- BHQ1

ATCGTGGAATACGGGTTTGCT

ermC

MF0 9562 7.1 GTGAGCTATTCACTTTAGGTTTAGG 142

ROX-CGCTCATTGGCATTACTTTTAATGGCA- BHQ2

TCGATAGGAACAGCAGTATATGGA

TetK

HF67 9144.

1 GCAGATCCTACTCCTTGTACTAACC 167

TAMRA-TGAGCTGTCTTGGTTCATTGATTGCT- BHQ2

1 2 3 4 5

Str.

agalactiae

AGATGACTTTCTCGGTATCGGT

Glck

HF67 9144.

1

108 CCTACTTCTTGAGTATCAGCCCA

FAM-TGGGTTCTCCAGGAGCTGTTGA-BHQ1 AGCAGGTGCCCCAGTTATTC

pbp 2x AB3 6836 9.1

96 TGCAGATAACCACCACCACC

JOE-ACTGCCCAAATCGCCCAGGA-BHQ1

GAGGGGATTTGCTAAAAGGTTGC Erm KX6 109

(5)

148

GTGAAAATATGCTCGTGGCACTT 8789

ROX-ACCCAACGAGCTTTAGGTTTGCTGT- 2.1 BHQ2

GACACGCCAGGACATATGGA

tetM

MG7 8693 7.1 CGAGTTTGTGCTTGTACGCC 110

TAMRA-TGGGGCAATTCTACTGATTTCTGCAA- BHQ2

Целевые последовательности генов с указанием отжига праймеров и зондов представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Целевые последовательности генов S. aureus и Str. agalactiae (участки отжига праймеров и зондов выделены цветом)

Целе вые гены

Последовательности генов

nuc aatatggacgtggcttagcgtatatttatgctgatggaaaaatggtaaacgaagctttagttcgtcaaggcttggct blaZ

aagacggtgttccaaaagactataaggttgctgataaaagtggtcaagcaataacatatgcttctagaaatgatgttgcttttgtttatcctaa gggccaatctgaacctattgttttagtcatttttacgaataaagacaataaaagtgataagccaaatgataagttgataagtgaaaccgccaa

gagtgt erm

C

atcgtggaatacgggtttgctaaaagattattaaatacaaaacgctcattggcattacttttaatggcagaagttgatatttctatattaagtatg gttccaagagaatattttcatcctaaacctaaagtgaatagctcac

TetK tcgataggaacagcagtatatggaaaattatctgattatataaatataaaaaaattgttaattattggtattagtttgagctgtcttggttcattga ttgcttttattggtcacaatcacttttttattttgatttttggtaggttagtacaaggagtaggatctgc

Glck agatgactttctcggtatcggtatgggttctccaggagctgttgatagaactagtaaaacagtaacaggtgcttttaatctaaattgggctgat actcaagaagtagg

pbp 2x

agcaggtgccccagttattcaggtggggaatcaatcagttgcagtaaaatctggtactgcccaaatcgcccaggaaggtggtggtggtta tctgca

Erm gaggggatttgctaaaaggttgcaaaatacccaacgagctttaggtttgctgttaatggtggaaatggatataaaaattcttaaaaaagtgc cacgagcatattttcac

tetM gacacgccaggacatatggatttcttagcagaagtatatcgttcattatcagttttagatggggcaattctactgatttctgcaaaagatggcg tacaagcacaaactcg

На первом этапе проводили ПЦР с заведомо положительными на данный патоген образцами по стандартному протоколу с разработанными праймерами, но без зондов (таблица 3).

Таблица 3 – Протокол выполнения амплификации

№ блока t⁰ C Время

Число циклов

мин сек

1 95 5 0 1

2 94 0 10

60 0 20 40

Результаты амплификации детектировали на агарозном геле (рисунок 3).

(6)

149

Примечание: 1,2 – nuc 77 п.н.; 3,4 – BlaZ 193 п.н.; 5,6 – ermC 142 п.н.; 7,9 – TetK 167 п.н.; 10,11 – Glck 108 п.н.; 12,13 – pbp 96 п.н.; 14,15 – Erm 109 п.н.; 16,17 – tetM 110 п.н.; 8 – маркер молекулярного веса (100-1000 п.н.)

Рисунок 3 – Результаты электрофореза

По результатам разделения продуктов амплификации видны четкие бенды, соответствующие размерам амплифицируемых фрагментов. Данные продукты амплификации использовали для следующего этапа создания положительного контроля.

После очистки ПЦР смеси по протоколу QIAqick 28104, на выходе получили по 30 мкл.очищенной ПЦР смеси.

После проведения реакции лигирования вектора pGT-19 и продуктов амплификации, полученные продукты были трансформированы в хемокомпетентные клетки E. Coli DH5a, согласно протоколу производителя (таблица 4).

Таблица 4 – Расчет приготовления реакционной смеси

Компонент Объем, мкл

pGT-19 2 мкл

Purify PCR 5 мкл

10x T4 ligase Buffer 1 мкл

T4 ligase 1 мкл

Nuclease free water 1 мкл

Скрининг выросших колоний проводили методом бело-голубой селекции, выросшие белые колонии пересевали на чистый агар (рисунок 4) и анализировали методом ПЦР с разработанными праймерами.

В качестве матрицы брали белую колонию и помещали ее в реакционную смесь без этапа выделения ДНК. Состав реакционной смеси и протокол выполнения амплификации указаны в таблицах 5, 6.

Рисунок 4 – Выросшие колонии E. coliDH5a после трансформации, пересеянные ночные культуры Таблица 5 – Расчет приготовления реакционной смеси

Компонент Объем, мкл

M13 FW 10 μМ 1

M13 RV 10 μМ 1

(7)

150

2 mM each dNTP 2.5 мкл.

25 mM MgCl2 3 мкл.

10x Taq Buffer 2.5 мкл.

Taq Pol 1 мкл.

mQ 14 мкл.

Объм реакции 25

Таблица 6 – Протокол выполнения амплификации

№

блока t⁰ C Время

Число циклов

мин сек

1 95 5 0 1

2

95 0 15

30

55 0 15

72 0 10

3 72 5 0 1

4 12 0 ∞ 1

Выросшие белые колонии скалывали и переносили на сетку чашки Петри LB агаром с ампицилином (рисунок 5).

Рисунок 5 – Колонии E. coli на LB агаре с ампицилином

Результаты детектировали в 1% агарозном геле с DNA маркером (100-1000 br) (рисунок 6)

Примечание: М – маркер молекулярного веса, 1 – 13 – отобранные белые колонии Рисунок 6 – Результаты ПЦР скрининга

Как видно, на рисунке, присутствуют бенды, которые представляют собой фрагменты плазмид со вставкой, т.е. подходят для создания положительного контроля.

Далее переносили бактериальные колонии на жидкую среду LB с ампициллином и инкубировали в течении ночи при 37⁰С, на термошейкере 200 RPM. Получили осадок бактериальных клеток методом центрифугирования и выделили с помощью набора по выделению плазмидной ДНК. ПЦР проводили по стандартному протоколу с разработанными праймерами.

(8)

151

Результаты детектировали в 1% агарозном геле с DNA маркером (100-1000 br) рисунок 7)

Примечание: 1– Маркер (100-1000 п.н.), 2 – отрицательный Glck, 3 – Glck (108 п.н.), 4 – BlaZ (193 п.н.), 5 – nuc (77 п.н.), 6 – TetK (167 п.н.), 7 – ermC (142 п.н.).

Рисунок 7 – Результаты ПЦР скрининга

Как видно из рисунка, в результате амплификации нуклеотидных последовательностей было определено, что клоны содержат необходимые нуклеотидные вставки и могут быть использованы в качестве положительного контрольного образца. Плазмиды, содержащие продукт амплификации, использовались в качестве обязательных положительных контролей.

Заключение. По результатам проделанной работы, были сконструированы плазмиды с фрагментами генов DQ507382.1, U58139.2, MF095627.1, HF679144.1, HF679144.1, AB368369.1, KX687892.1, MG786937.1, лигированные в векторы pTG19-T. Полученные векторы кодируют для S. aureus: специфический участок гена термостабильной нуклеазы (nuc), гены резистентности к антибиотикам группы бета-лактамов (BlaZ), макролидов (ermC) и тетрациклинов (TetK); для Str.

agalactiae: специфический участок гена глюкозокиназы (Glck), гены резистентности к антибиотикам группы бета-лактамов (pbp), макролидов (Erm) и тетрациклинов (tetM). Данные векторы использовали в качестве селективных маркеров для трансформированных клонов E. Coli DH5a.

Плазмиды с фрагментами генов успешно выявляются с помощью ПЦР, это означает, что все интересующие последовательности были правильно лигированы в плазмидные вектора и могут быть использованы для положительного контрольного образца.

Таким образом, рекомбинантная плазмида, является хорошим выбором для положительного контроля ПЦР во время лабораторных диагностических исследований. Разработанные плазмиды могут быть использованы в качестве безопасного и эффективного положительного контроля для подтверждения правильности работы детекционной смеси при лабораторной диагностике методом ПЦР.

Благодарности. Исследование выполнено в рамках Научно-технической программы Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан BR10764944 «Разработка методов аналитического контроля и проведения мониторинга безопасности пищевой продукции» на 2021- 2023 годы.

СПИСОКЛИТЕРАТУРЫ

1 Saiki R.K. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia [Теxt] / R.K. Saiki [and etc.]// Science – 1985. – Vol. Dec 20;230(4732). - P. 1350-1354.

(9)

152

2 Embury S.H. Rapid prenatal diagnosis of sickle cell anemia by a new method of DNA analysis [Теxt] / S.H. Embury [and etc.]//. N Engl J Med. – 1987. – Vol. 12;316(11). – P. 656-661.

3 Saiki R.K. Diagnosis of sickle cell anemia and beta-thalassemia with enzymatically amplified DNA and nonradioactive allele-specific oligonucleotide probes [Теxt] / R.K. Saiki [and etc.]// N Engl J Med. – 1988. – Vol. Sep 1;319(9) – P. 537-541.

4 Байменов Б.М. Идентификация Staphylococcusaureus в объектах ветеринарно-санитарного надзора методом ПЦР Realtime [Текст] / Б.М. Байменов, Г.Д. Чужебаева, С.Е. Ермагамбетова // Многопрофильный научный журнал КРУ им. А. Байтурсынова «3 i: intellect, idea, innovation - интеллект, идея, инновация». Костанай. – 2020. - N 2. – С. 8–17.

5 Eigner U. Validation of the FluoroType® MRSA assay for the rapid identification of methicillin- resistant Staphylococcus aureus directly from patient material [Теxt] / / U. Eigner, A. Veldenzer, M. Holfelder // J Microbiol Methods. – 2014. – Vol. Dec;107. – P. 71-73.

6 Creamer E. The effect of rapid screening for methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) on the identification and earlier isolation of MRSA-positive patients [Теxt] / E. Creamer [and etc.] //

Infect Control Hosp Epidemiol. – 2010. – Vol. Apr;31(4). – P. 374-381.

7 Lepainteur M. Comparative Evaluation of Two PCR-Based Methods for Detection of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA): Xpert MRSA Gen 3 and BD-Max MRSA XT [Теxt] / M. Lepainteur [and etc.]// J Clin Microbiol. – 2015. – Vol. Jun;53(6). – P. 1955-1958.

8 Patel P.A. Performance of the Cepheid Xpert® SA Nasal Complete PCR assay compared to culture for detection of methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus colonization [Теxt] / P.A. Patel [and etc.] // Diagn Microbiol Infect Dis. – 2014. – Vol. Sep;80(1). – P. 32-34.

9 Hanaoka N. Development of a pUC19-based recombinant plasmid to serve as a positive control in PCR for Orientia tsutsugamushi [Теxt] / N. Hanaoka [and etc.]// Microbiol Immunol. – 2009. – Vol.

May;53(5). – P. 305-308.

10 Jiang J. Development of a quantitative real-time polymerase chain reaction assay specific for Orientia tsutsugamushi [Теxt] / J. Jiang [and etc.]// Am J Trop Med Hyg. – 2004. – Vol. Apr;70(4). – P.

351-356.

11 Сизикова Т.Е. Использование внешних и внутренних контрольных образцов при постановке полимеразной цепной реакции и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции [Текст] / Т.Е. Сизикова [и др.]// Клиническая лабораторная диагностика. – 2013. – №3. – С. 41-44.

12 pTG19-T PCR Cloning Vector Vivantis Technologies.–

(https://www.vivantechnologies.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1160:ptg19-t- pcr-cloning-vector&catid=81:ptg19-t-pcr-cloning-vector&Itemid=110).

13 Чужебаева Г. Оценка праймеров и флуоресцентно-меченных зондов для идентификации Staphylococcusаureus и Streptococcusagalactiae и их генов резистентности к антибактериальным препаратам [Текст] / Г. Чужебаева [и др.]// Ғылым және білім журналы. Уральск. – 2022. №3(68) . – С. 105–114.

14 Набор видоспецифических нуклеотидных последовательностей праймеров и зондов для идентификации Staphylococcusaureus и Streptococcusagalactiae с определением локусов антибиотикорезистентности [Текст]: пат.на Полезную Модель 7828 Республика Казахстан: МПК C12Q 1/68 (2006.01) / Байменов Б.М. [и др.]; заявитель и патентообладатель НАО «КРУ имени А.Байтурсынова»; заявл. 11.01.23; опубл. 17.02.23, Бюл. № 7 (II ч.). - 2 с: ил.

15 Чужебаева Г. Основные биологические свойства и устойчивость к антибиотикам изолятов staphylococcusаureus и streptococcusagalactiae, выделенных из молока коров Костанайской области Казахстана [Текст] / Г. Чужебаева [и др.]// Ғылымжәнебілімжурналы. Уральск. – 2022.

№1(66), – С. 3–11.

16 Boss R. Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer [Теxt] / R.

Boss [and etc.]// J Dairy Sci. – 2016. – Vol. Jan;99(1). – P. 515-528.

17 National Center for Biotechnology Information. – (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

18 QIAquick PCR Purification Kit.– (https://www.qiagen.com/).

19 DH5α Competent Cells.– (https://www.thermofisher.com/).

20 GeneJET Plasmid Miniprep Kit.– (https://www.thermofisher.com/).

REFERENCES

4 Bajmenov B.M. Identifikacija Staphylococcus aureus v ob#ektah veterinarno-sanitarnogo nadzora metodom PCR Real time [Tekst] / B.M. Bajmenov, G.D. Chuzhebaeva,

(10)

153

S.E. Ermagambetova// Mnogoprofil'nyj nauchnyj zhurnal KRU im. A. Bajtursynova «3 i: intellect, idea, innovation - intellekt, ideja, innovacija». Kostanaj. – 2020. - N 2. – S. 8–17.

11 Sizikova T.E. Ispol'zovanie vneshnih i vnutrennih kontrol'nyh obrazcov pri postanovke polimeraznoj cepnoj reakcii i obratnoj transkripcii polimeraznoj cepnoj reakcii [Tekst] / T.E. Sizikova [i dr.] // Klinicheskaja laboratornaja diagnostika. – 2013. – №3. – S. 41-44.

13 Chuzhebaeva G. Ocenka prajmerov i fluorescentno-mechennyh zondov dlja identifikacii Staphylococcus aureus i Streptococcus agalactiae i ih genov rezistentnosti k antibakterial'nym preparatam [Tekst] / G. Chuzhebaeva [i dr.] // Gilim zhane bilim zhurnaly. Ural'sk. – 2022. №3(68) . – S. 105–114.

14 Nabor vidospecificheskih nukleotidnyh posledovatel'nostej prajmerov i zondov dlja identifikacii Staphylococcus aureus i Streptococcus agalactiae s opredeleniem lokusov antibiotikorezistentnosti [Tekst]: pat. na Poleznuju Model' 7828 Respublika Kazahstan: MPK C12Q 1/68 (2006.01) / Bajmenov B.M. [i dr.]; zajavitel' i patentoobladatel' NAO «KRU imeni A.Bajtursynova»; zajavl. 11.01.23;

opubl.17.02.23, Bjul.№ 7 (II ch.). - 2 s: il.

15 Chuzhebaeva G. Osnovnye biologicheskie svojstva i ustojchivost' k antibiotikam izoljatov staphylococcus aureus i streptococcus agalactiae, vydelennyh iz moloka korov Kostanajskoj oblasti Kazahstana [Tekst] / G. Chuzhebaeva [i dr.]// Gilim zhane bilim zhurnaly. Ural'sk. – 2022. №1(66), – S.

3–11.

ТҮЙІН

Мақалада ген фрагменттерін DQ507382.1; U58139.2, MF095627.1, HF679144.1, HF679144.1, AB368369.1, KX687892.1, MG786937 1pTG19-T плазмидтік векторларына клондау арқылы рекомбинантты оң бақылау үлгілерін құру нәтижелері берілген. Бұл гендер S. aureus үшін арнайы реттілік фрагменттерін алып жүреді: термостабильді нуклеаза (нук) гені; бета-лактамдар (blaZ), макролидтер (ermC) және тетрациклиндер (тетК) тобының антибиотиктеріне төзімділік гендері;

және де Str. agalactiae: agalactiae: глюкозакиназаны (glck) кодтайтын ген және бета-лактамдар (pbp), макролидтер (erm), тетрациклиндер (tetM) тобының антибиотиктеріне төзімділік гендері.

Ген фрагменттері бар плазмидалар ПТР арқылы сәтті анықталды, бұл барлық қызықтыратын тізбектердің плазмидтік векторларға дұрыс байланыстырылғанын және оң бақылаулар ретінде пайдаланылуы мүмкін екенін растады. Ген фрагменттері бар плазмидалар ПТР арқылы сәтті анықталды, бұл барлық қызықты тізбектердің плазмидтік векторларға дұрыс байланыстырылғанын және оң бақылаулар ретінде пайдаланылуы мүмкін екенін растады.

Әзірленген оң бақылаулар полимеразды тізбекті реакцияның дұрыс жүруін, экспериментте қолданылатын реагенттердің сапасын, температура-уақыт режимдерінің оңтайлылығын және ПТР ингибиторларының жоқтығын көрсетеді.

Зерттеу 2021-2023 жылдарға арналған Br10764944 "аналитикалық бақылау әдістерін әзірлеу және тамақ өнімдерінің қауіпсіздігіне мониторинг жүргізу" ғылыми-техникалық бағдарламасы шеңберінде орындалды.