УДК 575.113
ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИЙ КОМПЛЕКСОВ mTOR Булгакова О. В.
ЕНУ им. Л.Н. Гумилева, г. Астана, [email protected] Научный руководитель – Берсимбай Р.И.
Мишень рапамицина млекопитающих (mTOR), является неотъемлемой частью многих сигнальных путей, регулирующих деление, пролиферацию и рост клеток. mTOR в виде каталитической субъединицы входит в состав двух функциональных комплексов – mTOR комплекса 1 (mTORC1) и mTOR комплекса 2 (mTORC2). В состав выше упомянутых комплексов помимо mTOR входит ряд полипептидов. mTORC1 состоит из пяти компонентов: mTOR, регуляторного ассоциированного с mTOR белка - раптора (Raptor), mLST, богатого пролином АКТ субстрата 40 (PRAS40) и белка дептора (Deptor).
mTORC1 контролирует клеточный рост путем фосфорилирования S6 киназы (S6K1) и белка 4E-BP1, ключевых регуляторов белкового синтеза.
mTOR комплекс 2 (mTORC2) в своем составе имеет mTOR, рапамицин- нечувствительный спутник mTOR - rictor (rapamycin insensitive companion of mTOR), mLST8, mSIN1 (mammalian stress-activated protein kinase interacting protein , белок взаимодействующий со стресс-активируемой протеинкиназой 1 млекопитающих), protor 1 (protein observed with rictor-1, белок взаимодействующий с rictor-1), и deptor.
mTOR -серин-треониновая протеинкиназа семейства фосфатидилинозитол 3-киназ, играет важную роль в канцерогенезе. Однако механизм этого сложного и многоэтапного процесса до конца не изучен. Одним из важных методов исследования специфической роли mTOR в развитии раковых опухолей различного генеза является использование системы РНК-интерференции.
Для исследования функций mTOR комплексов нами был проведен генный нокдаун mTOR в двух типах клеточных линий - HEK 293Т и MDA-MB-435. Результаты эксперимента (рис.1 В) продемонстрировали как уменьшение количества клеток, вследствие апоптоза, так и изменение формы и клеточных размеров по сравнению с контролем (рис 1 А). Причиной последнего эффекта предположительно является ингибирование сигнального пути, опосредованного действием факторов роста, прежде всего инсулино подобного фактора роста (IGF). Как видно из рисунка 2, нокдаун mTOR приводит к снижению фосфорилирования киназы Akt, являющейся ключевым регулятором многих сигнальных путей, в том числе и mTOR сигналинга.
Предыдущие исследования показали, что для активации Akt необходимо фосфорилирование данной киназы по двум сайтам – Thr308 и Ser437. Вестерн-блотинг с применением анти-pAkt437 антител выявил ингибирование активности Akt в клетках, где наблюдается сайленсинг mTOR.
А В
Рис.1 `Морфология клеток линия MDA-MB-435 (А) контроль Luciferase (B) нокдаун mTOR
Рис.2 `Вестерн-блот иммунопреципитатов полученных из клетоной линии HEK 293T с применением mTOR (рис.А), тубулин (В), pAkt437 (C) антител
Таким образом, mTOR сигналинг регулирует клеточный рост и размер клеток, активируя множество анаболических процессов, включая биосинтез белков, липидов и органелл, а также ограничивая катаболические процессы, такие как аутофагия. В связи с чем, изучение данного сигнального пути является приоритетным направлением в исследовании процессов канцерогенеза с целью дальнейшей разработки методов лечения и профилактики онкологических заболеваний.
