УДК 57.083.3:576.3
ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ТРАНСКРИПЦИОННОМУ ФАКТОРУ SOX2 ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА.
¹Секенова А.Е., 2Огай В.Б., 2Мукантаев К.Н.,2Бакирова Г.А.
¹ - Евразийский национальный университет им. Л.Н. Гумилева,
2 - РГП «Национальный центр биотехнологии РК» КН МОН РК, г. Астана, Казахстан
Научный руководитель – к.б.н., доцент Бекеева С.А.
Транскрипционный фактор Sox2 участвует в процессах пролиферации и самообновления плюрипотентных стволовых клеток человека и животных. Экспрессия транскрипционного фактора Sox2 представляет собой эффективный инструмент для идентификации и изоляции стволовых клеток. Так, например, плюрипотентные ЭСК могут быть охарактеризованы высоким уровнем экспрессии белка Sox2. Антитела, специфичные к транскрипционному фактору Sox2, могут быть использованы для мониторинга присутствия дифференцированных и недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток человека и мыши [1].
Целью работы является получение поликлональных антител, специфичных к транскрипционному фактору Sox2 плюрипотентных стволовых клеток.
Материалы и методы. В экспериментах использовали рекомбинатный антиген- транскрипционный фактор Sox2, полученный в лаборатории Молекулярной генетики растений РГП «НЦБ РК» КН МОН РК Хасеновым Б.Б., Балтабековой М.Ж., Лапаевым С.С. Иммунизацию мышей Balb/с проводили в оптимальных концентрациях антигена Sox2, 50 мкг/мл и 100 мкг/мл с использованием полного и неполного адъюванта Фрейнда по схеме Фридлянская И.И. [5]. Для определения титра специфических антител в сыворотках крови отбирали кровь из хвостовой вены иммунизированного животного.
Электрофорез антигена-транскрипционного фактора Sox2 проводили 12 %-ном полиакриламидном геле методом V.K. Laemmli et al. Иммуноблотинг осуществляли по H.Towbin et al. с последующей детекцией исследуемыми поликлональными антителами.
Специфичность связывания поликлональных антител с антигеном определяли постановкой непрямого ИФА, иммуноцитохимией с использованием вторичных goat- anti mouse IgG антител, конъюгированных с флуоресцентным красителем Alexa-fluor 595.
Результаты исследования.
В результате проведения электрофореза молекулярная масса белка антигена- транскрипционного фактора Sox2 составила 34 кДа (рисунок-1).
Оптимальная концентрация антигена Sox2 для иммунизаций составила – 50 мкг/мл.
Антитела специфически реагировали только с антигеном Sox2 в иммуноферментном анализе. Иммунохимическое проявление взаимодействия антигенов, перенесенных после электрофореза с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану, с поликлональными антителами показало выявление полос серого цвета в иммуноблоте (рисунок-2).
Электрофореграмма антигена Sox2 в 12% полиакриламидном геле
Рисунок 1 Рисунок 2 Иммуноблотинг антител
Поликлональные антитела, полученные из сыворотки мышей, иммунизированных в концентрации 50 мкг/мл, имеют титр в ИФА 1:900 (таблица 1).
Таблица 1 - Исследование специфичности и активности антител с помощью варианта непрямого ИФА
Вариант ИФА Концентрация антигена Sox2
Активность титра
Непрямой вариант ИФА 100 мкг/мл 1:300
Непрямой вариант ИФА 50 мкг/мл 1:900
Иммуноцитохимия антител на плюрипотентных СК
←
34 кД←
ЭСК мыши ЭСК человека
А В
←
Рисунок 3
Иммуноцитохимический анализ показал, что полученные антитела специфически реагируют с нативным транскрипционным фактором Sox2 в плюрипотентных стволовых клетках мыши и человека (рисунок - 3).
Выводы.
1. Получены поликлональные антитела, специфичные к транскрипционному фактору Sox2 плюрипотентных стволовых клеток.
2. Специфичность и иммунохимические характеристики полученных поликлональных антител позволяют использовать их для определения экспрессии белка Sox2 в плюрипотентных стволовых клетках человека.
Список использованной литературы:
1. Development of antibodies to human embryonic stem cell antigens. Jingli Cai, Judith M Olson, Mahendra S Rao, Marisa Stanley, Eva Taylor and Hsiao-Tzu Ni*. BMC Developmental Biology 2005, 5:26 doi:10.1186/1471-213X-5-26.
2. Фридлянская И.И. Получение поликлональных антител. //Методы культивирования клеток: Сб. науч. трудов, Л.: Наука, 1988. - С. 194-205.
Sox2/DAPI Sox2/DAPI
ЭС К человека (отриц. контроль)
С D
