หมายเหตุ: ข้อมูลแสดง mean ± standard deviation และวิเคราะห์ค่าทางสถิติโดยใช้
one-way ANOVA และเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยด้วยวิธี Tukey ที่ระดับความเชื่อมั่นเท่ากับร้อยละ 95 ตัวอักษรภาษาอังกฤษพิมพ์เล็ก (a-d) คือ ค่าทางสถิติของประสิทธิภาพการลดสีย้อมเหลือทิ้ง 4. กลไกการลดความเข้มของสีย้อมโดยการดูดซับ และการย่อยสลายทางชีวภาพด้วย
ภาพประกอบ 19 ประสิทธิภาพการลดสีย้อม (% decolourisation) ที่ความเข้มข้น 4% (v/v) ของ ฟองน ้าไนลอนที่ไม่ได้ตรึงรา เส้นใยราที่ไม่ได้ตรึงบนวัสดุ ราตรึงที่ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อ และราตรึงที่
ไม่ได้ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อ ภายในระยะเวลา 2 วัน ภายใต้สภาวะแบบเขย่าที่ 100 รอบต่อนาที
อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส และปรับค่า pH เริ่มต้นเท่ากับ 5
หมายเหตุ: ข้อมูลแสดง mean ± standard deviation และวิเคราะห์ค่าทางสถิติโดยใช้
one-way ANOVA และเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยด้วยวิธี Tukey ที่ระดับความเชื่อมั่นเท่ากับร้อยละ 95 ตัวอักษรภาษาอังกฤษพิมพ์เล็ก (a-d) คือ ค่าทางสถิติของประสิทธิภาพการลดสีย้อมเหลือทิ้ง
4.2 การวัดค่ากิจกรรมของเอนไซม์กลุ่มลิกนิโนไลติกของราตรึง T. hirsuta PW17-41 จากผลการทดลองในหัวข้อ 4.1 พบว่ากลไกหลักของราตรึง T. hirsuta PW17-41 ใน การลดความเข้มของสีย้อม คือ การย่อยสลายสีย้อมด้วยเอนไซม์ ดังนั้นในหัวข้อนี้ได้ท าการทดลอง เพื่อยืนยัน โดยการวัดค่ากิจกรรมของเอนไซม์กลุ่มลิกนิโนไลติก 3 ชนิด ได้แก่ เอนไซม์แลคเคส แมงกานีสเปอร์ออกซิเดส และลิกนินเปอร์ออกซิเดส ผลแสดงในตาราง 9 พบว่าราตรึงที่ไม่ผ่านการ นึ่งฆ่าเชื้อ สามารถผลิตเอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิเดสได้สูงที่สุดเท่ากับ 532.09 ยูนิตต่อลิตร
รองลงมาเป็นเอนไซม์แลคเคสเท่ากับ 137.80 ยูนิตต่อลิตร เมื่อเลี้ยงเชื้อเป็นเวลา 2 วัน ภายใต้
สภาวะที่เหมาะสมจากผลการทดลองหัวข้อ 3 และไม่พบกิจกรรมของเอนไซม์ลิกนินเปอร์ออกซิเดส ส่วนราตรึงที่ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อ และฟองน ้าไนลอนที่ไม่ได้ตรึงราไม่พบกิจกรรมของเอนไซม์ทั้ง 3 ชนิด ในขณะที่เส้นใยราที่ไม่ได้ตรึงบนวัสดุมีค่ากิจกรรมของเอนไซม์น้อยกว่าราตรึง โดยพบ กิจกรรมของเอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิเดส และแลคเคส เท่ากับ 202.80 และ 35.26 ยูนิตต่อ ลิตรตามล าดับ ซึ่งสอดคล้องกับประสิทธิภาพในการลดความเข้มของสีย้อมในการทดลองหัวข้อ 3 อีกด้วย
ตาราง 9 กิจกรรมของเอนไซม์กลุ่มลิกนิโนไลติก (แลคเคส และแมงกานีสเปอร์ออกซิเดส) ของ ฟองน ้าไนลอนที่ไม่ได้ตรึงรา เส้นใยราที่ไม่ได้ตรึงบนวัสดุ ราตรึงที่ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อ และราตรึงที่
ไม่ได้ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อ
ชนิดของวัสดุ กิจกรรมของเอนไซม์ (ยูนิตต่อลิตร)
แลคเคส แมงกานีสเปอร์ออกซิเดส ฟองน ้าไนลอนที่ไม่ได้ตรึงรา 0.00±0.00C 0.00±0.00c
เส้นใยราที่ไม่ได้ตรึงบนวัสดุ 35.26±1.64B 202.80±10.03b ราตรึงที่ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อ 0.00±0.00C 0.00±0.00c ราตรึงที่ไม่ได้ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อ 137.80±24.44A 532.09±52.77a
หมายเหตุ: ข้อมูลแสดง mean ± standard deviation และวิเคราะห์ค่าทางสถิติโดยใช้
one-way ANOVA และเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยด้วยวิธี Tukey ที่ระดับความเชื่อมั่นเท่ากับร้อยละ 95 ตัวอักษรภาษาอังกฤษพิมพ์ใหญ่ (A-C) คือ ค่ากิจกรรมของเอนไซม์แลคเคส ตัวอักษร ภาษาอังกฤษพิมพ์เล็ก (a-c) คือ ค่ากิจกรรมของเอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิเดส
4.3 การหาน ้าหนักมวลโมเลกุลของเอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิเดสด้วยวิธี SDS-PAGE และ native-PAGE
จากผลการทดลองในหัวข้อ 4.2 พบว่าเอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิเดส เป็นเอนไซม์
หลักที่มีบทบาทในการย่อยสลายสีย้อม จึงศึกษาหาน ้าหนักมวลโมเลกุลของเอนไซม์ดังกล่าวด้วย วิธี SDS-PAGE และ native-PAGE โดยน าตัวอย่างน ้าเลี้ยงเชื้อของราตรึง T. hirsuta PW17-41 ที่
เลี้ยงในอาหาร basal medium ปริมาตร 1 ลิตร ภายใต้สภาวะแบบเขย่าที่ 100 รอบต่อนาที
อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส มากรองผ่านกระดาษกรอง whatman no.1 เพื่อแยกส่วนของเส้นใยรา
ออก แล้วน าส่วนน ้ามาตกตะกอนเอนไซม์ด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟต 80% (w/v) จากนั้นน ามา ก าจัดเกลือด้วยการไดอะไลซิสแล้วหาน ้าหนักมวลโมเลกุลของเอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิ
เดสด้วยวิธี SDS-PAGE โดยน าไปย้อมสี Coomassie Brilliant Blue R-250 ผลการทดลองแสดง ในภาพประกอบ 20A พบแถบแบนโปรตีนจ านวน 1 แถบ ที่มีน ้าหนักโมเลกุลเท่ากับ 71 kDa เมื่อ เทียบเคียงขนาดกับแถบแบนโปรตีนมาตรฐาน จากนั้นยืนยันชนิดของเอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออก ซิเดส ด้วยวิธี native-PAGE โดยน าแผ่นเจลไปท าปฏิกิริยาการสารตั้งต้นของเอนไซม์ คือ 2,6- Dimethoxyphenol (DMP) ผลการทดลองแสดงในภาพประกอบ 20B คือพบแถบแบนสีส้มอม เหลืองจ านวน 2 แถบที่มีน ้าหนักโมเลกุลเท่ากับ 45 และ 90 kDa ซึ่งเกิดจากการท าปฏิกิริยากับ สารตั้งต้น โดยเฉพาะแถบแบนขนาด 45 kDa ที่เกิดเป็นแบนหนาขนาดใหญ่ ที่มีขนาดตรงกับ เอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิเดสที่มีรายงานก่อนหน้าว่ามีขนาดอยู่ในช่วง 38-53 kDa
เมื่อน าตัวอย่างน ้าเลี้ยงเชื้อมาวัดค่ากิจกรรมของเอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิเดส และปริมาณโปรตีนทั้งหมด พบว่ามีค่าเท่ากับ 429 ยูนิต และ 5.15 มิลลิกรัม คิดเป็นค่ากิจกรรม จ าเพาะของเอนไซม์ (specific activity) เท่ากับ 83.31 ยูนิตต่อมิลลิกรัม (ตาราง 10) และเมื่อ ตกตะกอนโปรตีนของเอนไซม์ด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟต 80% (w/v) พบว่าเอนไซม์มีค่า กิจกรรมของเอนไซม์ และปริมาณโปรตีนทั้งหมดเท่ากับ 400.80 ยูนิต และ 1.02 มิลลิกรัม ท าให้ค่า กิจกรรมจ าเพาะของเอนไซม์เพิ่มขึ้นเป็น 391.97 ยูนิตต่อมิลลิกรัม และเอนไซม์มีความบริสุทธิ์
เพิ่มขึ้นเท่ากับ 4.71 เท่า มีค่า %Yield เท่ากับ 93.43 จากนั้นน าเอนไซม์มาท าไดอะไลซิสเพื่อก าจัด เกลือ พบว่ากิจกรรมของเอนไซม์ลดลงเหลือ 360.07 ยูนิต และมีปริมาณโปรตีนเท่ากับ 0.89 มิลลิกรัม โดยมีค่ากิจกรรมจ าเพาะของเอนไซม์เพิ่มขึ้นเป็น 404.25 ยูนิตต่อลิตร และเอนไซม์มี
ความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้นเป็น 4.85 เท่า (ตาราง 10)
A B
ภาพประกอบ 20 ผล SDS-PAGE และ native-PAGE ของตัวอย่างเอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิ
เดสที่ได้จากรา T. hirsuta PW17-41 (M) protein ladder (1) น ้าเลี้ยงเชื้อ T. hirsuta PW17-41 (2) เอนไซม์ที่ตกตะกอนด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟต (3) เอนไซม์ที่ผ่านการก าจัดเกลือด้วยการ
ไดอะไลซิส
ตาราง 10 การท าให้เอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิเดสบริสุทธิ์บางส่วน (partial purification) Purification
step
Total protein (mg)
Total enzyme activity (U)
Specific activity (U mg-1)
Purification fold
Yield (%)
Crude extract 5.15 429.00 83.314 1 100
(NH4)2SO4
precipitation 1.02 400.80 391.97 4.71 93.43
Dialysis 0.89 360.07 404.25 4.85 83.93