5.1 ความสามารถในการดูดซับสีย้อมเหลือทิ้ง
เตรียมอาหาร basal medium ที่ใช้แหล่งคาร์บอน ไนโตรเจน และปรับค่า pH เริ่มต้น ที่ให้ค่าการลดสีสูงสุดจากการทดลองในข้อ 4 ผสมกับสีย้อมเหลือทิ้งโดยปรับให้มีความเข้มข้น สุดท้ายเท่ากับ 4% (v/v) ท าให้ปราศจากเชื้อด้วยวิธีสเตอริไรเซชั่น จากนั้นทดสอบโดยใส่ราตรึงที่
ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที จ านวน 5 ชิ้น น าไปบ่มใน เครื่องเขย่าแบบควบคุมอุณหภูมิ ความเร็ว 100 รอบต่อนาที อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 วัน บันทึกผลวันที่ 2 โดยน ามากรองแยกส่วนของราตรึงผ่านกระดาษกรอง whatman no.1 แล้ว น าส่วนน ้าไปวัดค่า ADMI ค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นต่าง ๆ ได้แก่ 545, 590, 600 และ
608 นาโนเมตร ค านวณ % decolourisation ตามวิธีการทดลองในข้อที่ 2 และวัดกิจกรรมของ เอนไซม์กลุ่มลิกนิโนไลติกตามวิธีการทดลองในข้อ 5.2.1
5.2 ความสามารถในการย่อยสลายสีย้อมเหลือทิ้ง
เตรียมอาหาร basal medium ที่ใช้แหล่งคาร์บอน ไนโตรเจน และปรับค่า pH เริ่มต้น ที่ให้ค่าการลดสีสูงสุดจากการทดลองในข้อ 4 ผสมกับสีย้อมเหลือทิ้งโดยปรับให้มีความเข้มข้น สุดท้ายเท่ากับ 4% (v/v) ท าให้ปราศจากเชื้อด้วยวิธีสเตอริไรเซชั่น จากนั้นทดสอบโดยใส่ราตรึง จ านวน 5 ชิ้น น าไปบ่มในเครื่องเขย่าแบบควบคุมอุณหภูมิ ความเร็ว 100 รอบต่อนาที อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 วัน บันทึกผลวันที่ 2 โดยน ามากรองแยกส่วนของราตรึงผ่านกระดาษ กรอง whatman no.1 แล้วน าส่วนน ้าไปวัดค่า ADMI ค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นต่าง ๆ ได้แก่ 545, 590, 600 และ 608 นาโนเมตร ค านวณ % decolourisation ตามวิธีการทดลองในข้อ ที่ 2 และวัดกิจกรรมของเอนไซม์กลุ่มลิกนิโนไลติกตามวิธีการทดลองในข้อ 5.2.1
5.2.1 การวัดกิจกรรมของเอนไซม์กลุ่มลิกนิโนไลติก 5.2.1.1 กิจกรรมของเอนไซม์แลคเคส
ผสมสารละลาย 2,2’-Azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) ความเข้มข้น 0.5 mM ในสารละลายบัฟเฟอร์โซเดียมอะซิเตท ความเข้มข้น 100 mM (pH 4) ปริมาตร 600 ไมโครลิตร กับตัวอย่างทดสอบปริมาตร 600 ไมโครลิตร บ่มที่อุณหภูมิ 60 องศา เซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที แล้ววัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 420 นาโนเมตร บันทึกค่าที่
เวลา 0 และ 60 วินาที น าค่าที่วัดได้ไปค านวณหาค่ากิจกรรมของเอนไซม์โดยก าหนดให้
1 ยูนิตของเอนไซม์แลคเคส คือ ปริมาณเอนไซม์แลคเคสที่ใช้ในการเปลี่ยนสาร ABTS 1 µmol ภายในเวลา 1 นาที ภายใต้สภาวะที่ก าหนด (ค่าคงที่ของการดูดกลืนแสง (Extinction coefficient;
ε) เท่ากับ 36,000 M-1 cm-1) (101)
5.2.1.2 กิจกรรมของเอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิเดส
ผสมสารละลาย 2,6-dimethoxyphenol (DMP) ความเข้มข้น 10 mM ปริมาตร 120 ไมโครลิตร สารละลายบัฟเฟอร์โซเดียมทาร์เทรต ความเข้มข้น 250 mM (pH 4) ปริมาตร 240 ไมโครลิตร แมงกานีสซัลเฟต ความเข้มข้น 10 mM ปริมาตร 120 ไมโครลิตร และ ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ความเข้มข้น 4 mM ปริมาตร 120 ไมโครลิตร จากนั้นเติมเอนไซม์สกัด หยาบปริมาตร 600 ไมโครลิตร บ่มที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที แล้วน าไปวัดค่า การดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 469 นาโนเมตร บันทึกค่าที่ 0 และ 60 วินาที น าค่าที่วัดได้ไป ค านวณหาค่ากิจกรรมของเอนไซม์โดยก าหนดให้ 1 ยูนิตของเอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิเดส คือ
ปริมาณเอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิเดสที่ใช้ในการเปลี่ยนสาร 2,6-dimethoxyphenol 1 µmol ภายในเวลา 1 นาที ภายใต้สภาวะที่ก าหนด โดยค่าคงที่ของการดูดกลืนแสงเท่ากับ 10,000 M-1 cm-1(101)
5.2.1.3 กิจกรรมของเอนไซม์ลิกนินเปอร์ออกซิเดส
ผสมสารละลาย veratryl alcohol ความเข้มข้น 20 mM ปริมาตร 240 ไมโครลิตร สารละลายบัฟเฟอร์โซเดียมทาร์เทรต ความเข้มข้น 250 mM (pH 4) ปริมาตร 240 ไมโครลิตร และ ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ความเข้มข้น 4 mM ปริมาตร 120 ไมโครลิตร จากนั้นเติม เอนไซม์สกัดหยาบปริมาตร 600 ไมโครลิตร บ่มที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที
แล้วน าไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 310 นาโนเมตร บันทึกค่าที่ 0 และ 60 วินาที
น าค่าที่วัดได้ไปค านวณหาค่ากิจกรรมของเอนไซม์โดยก าหนดให้ 1 ยูนิตของเอนไซม์ลิกนินเปอร์
ออกซิเดส คือ ปริมาณเอนไซม์ลิกนินเปอร์ออกซิเดสที่ใช้ในการเปลี่ยนสาร veratryl alcohol 1 μmol ภายในเวลา 1 นาที ภายใต้สภาวะที่ก าหนด โดยค่าคงที่ของการดูดกลืนแสงเท่ากับ 9,300
M-1 cm-1 (101) ซึ่งสูตรการค านวณกิจกรรมของเอนไซม์ มีดังนี้
กิจกรรมของเอนไซม์ (ยูนิตต่อมิลลิลิตร) = (∆Abs × V × D) / ε × v × t
หมายเหตุ: ∆Abs = ความแตกต่างระหว่างค่าการดูดกลืนแสงก่อนและหลังท าปฏิกิริยา V = ปริมาตรรวมของสารทั้งหมดในปฏิกิริยา (มิลลิลิตร) D =ระดับความเจือจาง ε = ค่าคงที่ของ การดูดกลืนแสง (Extinction coefficient) v = ปริมาตรของเอนไซม์สกัดหยาบ (มิลลิลิตร) และ t = เวลาที่ใช้ในการบ่ม (นาที)
5.3 การศึกษาข้อมูลของเอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิเดสเบื้องต้น
เตรียมอาหาร basal medium ที่ใช้แหล่งคาร์บอน ไนโตรเจน และปรับค่า pH เริ่มต้น ที่ได้จากการทดลองในข้อ 4 ท าให้ปราศจากเชื้อด้วยวิธีสเตอริไรเซชั่น ใส่ราตรึงจ านวน 5 ชิ้น บ่มใน เครื่องเขย่าแบบควบคุมอุณหภูมิ ความเร็ว 100 รอบต่อนาที อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 7 วัน จากนั้นน ามากรองแยกส่วนของราตรึงผ่านกระดาษกรอง whatman no.1 แล้วน าส่วนน ้ามา วัดค่ากิจกรรมของเอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิเดสตามวิธีการทดลองในข้อ 5.2.1.2 ก่อนน าไป ตกตะกอนด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟต ((NH4)2SO4) 80% ทิ้งไว้ข้ามคืน แล้วน าไปปั่นเหวี่ยงที่
ความเร็วรอบ 12,000 g อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที ส่วนของน ้า (supernatant) น ามาวัดค่ากิจกรรมของเอนไซม์เพื่อตรวจสอบว่ายังมีเอนไซม์เหลืออยู่หรือไม่ ส่วนของตะกอน
(pellet) น ามาละลายด้วยสารละลายโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (sodium phosphate buffer) (pH 6) (ภาคผนวก ข) จากนั้นน าไปไดอะไลซิส (dialysis) โดยใส่ถุงไดอะไลซิสที่มีขนาดรูเท่ากับ 8 kDa แช่ในสารละลายโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 6) จากนั้นน าส่วนเอนไซม์ในถุงไปวัดค่ากิจกรรม ของเอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิเดส ตามวิธีการทดลองในข้อที่ 5.2.1.2 และวัดปริมาณโปรตีน รวม นอกจากนี้ได้น าส่วนของเอนไซม์ที่ได้ไปวิเคราะห์หาขนาดของเอนไซม์ด้วยเทคนิค Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) และ native-PAGE
5.3.1 การวัดปริมาณโปรตีนรวม (total protein content) ด้วยวิธี Bradford assay ผสมเอนไซม์สกัดหยาบปริมาตร 200 ไมโครลิตร กับสาร Bradford reagent ปริมาตร 1 มิลลิลิตร บ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที แล้วน าไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความ ยาวคลื่น 595 นาโนเมตร น าค่าที่วัดได้ไปค านวณหาค่าปริมาณโปรตีนรวม โดยเปรียบเทียบกับ กราฟโปรตีนมาตรฐาน (standard curve) ของ bovine serum albumin โดยสร้างกราฟมาตรฐาน ระหว่างความเข้มข้นของ BSA กับค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 595 นาโนเมตร
5.3.2 การศึกษาขนาดของเอนไซม์ด้วยเทคนิค Sodium Dodecyl Sulphate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
การศึกษาขนาดของเอนไซม์ด้วยเทคนิค SDS-PAGE สามารถท าได้โดยการแยก แถบโปรตีนผ่านเจลโพลีอะคริลาไมด์ (polyacrylamide gel) ใน running buffer (ภาคผนวก ข) โดยเตรียมเจลเป็น 2 ชั้น ได้แก่ ชั้นบน คือ 5% stacking gel และชั้นล่าง คือ 12% resolving gel (ภาคผนวก ข) จากนั้นผสมตัวอย่างเอนไซม์กับ sample buffer (ภาคผนวก ข) ในอัตราส่วน 1:1 (v/v) ปริมาตรรวม 30 ไมโครลิตร น าไปต้มเป็นเวลา 5 นาที แล้วหยอดลงในช่องเจลโดยใช้แถบ โปรตีนมาตรฐาน (250 kDa protein standard) ในการเปรียบเทียบขนาด จากนั้นตั้งค่า กระแสไฟฟ้าที่ความต่างศักย์ 120 โวลต์ เป็นเวลา 3 ชั่วโมง น าเจลไปย้อมด้วย staining solution (ภ าค ผ น วก ข) โด ย ใช้สี Coomassie Brilliant Blue R-250 แล ะแช่ ใน destain solution (ภาคผนวก ข) แล้วบันทึกภาพเจล
5.3.3 การศึกษาเอนไซม์ด้วยเทคนิค native-PAGE
การศึกษาเอนไซม์ด้วยเทคนิค native-PAGE สามารถท าได้โดยเตรียมเจล โพลีอะคริลาไมด์ใน running buffer เช่นเดียวกับการทดลองในข้อ 5.3.2 จากนั้นผสมตัวอย่าง เอนไซม์กับ sample buffer ที่ไม่ได้เติม β-mercaptoethanol ในอัตราส่วน 1:1 (v/v) ปริมาตรรวม 30 ไมโครลิตร และหยอดลงในช่องเจลโดยใช้แถบโปรตีนมาตรฐาน (250 kDa protein standard) ในการเปรียบเทียบขนาด จากนั้นตั้งค่ากระแสไฟฟ้าที่ความต่างศักย์ 120 โวลต์ เป็นเวลา 3 ชั่วโมง
น าเจลไปท าปฏิกิริยากับสารตั้งต้นของเอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิเดสโดยแช่ใน solution A (ภาคผนวก ข) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง และ solution B (ภาคผนวก ข) เป็นเวลา 30 นาที แล้ว บันทึกภาพเจล ถ้าแถบแบบใด คือ เอนไซม์แมงกานีสเปอร์ออกซิเดสจะท าปฏิกิริยากับสารละลาย ตั้งต้นเกิดเป็นแถบสีส้ม
6. การศึกษาความสัมพันธ์ของการลดสีย้อม การผลิตเอนไซม์กลุ่มลิกนิโนไลติกของรา