BAB III METODE PENELITIAN
3.8 Alat, Bahan dan Cara Kerja
a. Untuk pengambilan sampel darah : 1. Satu pasang sarung tangan
2. Satu buah alat ikat pembendungan (torniquet) 3. Satu buah spuit disposible 10 cc (Terumo ®
4. Satu buah vacuum blood collection tube (Corelab )
®
5. Satu buah plester luka
) 2.5 cc yang mengandung anti koagulan (asam sitrat 3.8%)
b. Satu unit alat centrifuge, 2000 rpm ( Nesco ® c. Satu buah vacutainer (BD vacutainer
)
®
d. Spuit disposible 3 cc dan 1 cc @ satu buah (Terumo
) 2 ml untuk menyimpan plasma
®
26
e. Vortex (ES ®
f. Anastesi topikal lidokain 9,6% (Anesten®) )
g. Alat dermarollerϕ 2 cm dan panjang 2 cm, dengan jumlah jarum 192 buah dan panjang jarum 1.5 mm ( MT Roller ®
h. Kassa steril ) i. NaCl 0.9 % j. Aqua steril k. Povidon iodine 10% l. Salep gentamisin 0,3%
m.Untuk pengambilan spesimen jaringan (biopsi plong): 1. skin hook
2. spuit 3 cc
3. alat biopsi plong dispossible ukuran 1,5 mm 4. gunting jaringan
5. jarum no. 26 G 6. larutan gentian violet 7. povidon iodine 10%
8. alkohol 70 %
9. xylocain 2 % 1 cc 10.kasa steril
11.benang nylon no.5-0 12.salep gentamisin 13.plester
15.larutan formalin 10%
n. untuk pemeriksaan histopatologi: 1. gelas beaker 2. alkohol 70% 3. inkubator 4. larutan benzol 5. lilin parafin 6. mikrotom 7. gelas objek 8. xylol 9. HCl 2% 10.alkohol 80% 11.air mengalir
12.untuk pewarnaan hematoksilin eosin (HE): - larutan hematoksilin - larutan amoniak 2% - larutan eosin - alkohol 96% - larutan carboxylol - xylol
13.untuk pewarnaan Masson’s Trichrome Stain (MTS): - larutan Bouin
- larutan Biebrich scarlet- acid fuchsin
28
- larutan anilin biru - larutan light green 2%
- larutan glacial acetic acid
3.8.2 Cara Kerja
a. Dilakukan anamnesis untuk mengetahui apakah subyek memenuhi kriteria inklusi dan tidak termasuk kriteria eksklusi. Pasien yang termasuk kriteria inklusi dan tidak termasuk kriteria eksklusi diberikan penjelasan tentang tindakan dan penelitian yang dilakukan, kemudian subyek menandatangani informed consent.
b. Wajah pasien dibersihkan dengan povidon iodine 10% dan NaCl 0,9%, kemudian dioleskan anastesi topikal Lidokain 9,6% pada kulit wajah pasien, kemudian ditunggu selama 30 menit.
c. Dilakukan biopsi plong dengan menggunakan alat biopsi plong 1,5 mm pada salah satu daerah parut akne tipe rolling. Spesimen yang diperoleh difiksasi dengan formalin untuk kemudian dibawa ke laboratorium untuk pemeriksaan histopatologi untuk mendapatkan gambaran histopatologi jaringan kolagen sebelum diterapi, ahli patologi anatomi tidak mengetahui spesimen mana yang diterapi menggunakan PRP.
d. Dilakukan pengambilan darah dari vena lengan bawah sebanyak 10 cc, kemudian dimasukkan ke dalam vacutainer yang mengandung antikoagulan asam sitrat 3,8 %.
e. Sampel darah ini kemudian diproses hingga mendapatkan PRP, dengan cara melakukan sentrifugasi terhadap sampel darah dengan menggunakan
alat centrifuge, 2000 rpm selama 10 menit, kemudian lapisan yang mengandung PRP diaspirasi ke dalam tube yang steril, lalu dilakukan
vortex 2000 rpm selama 2 menit untuk mengaktifkan α- granule.
f. Microneedling disterilkan menggunakan Perboric acid, sodium salt 40% sampai 60% selama 15 menit.
g. Wajah pasien dibersihkan dengan kasa steril untuk mengangkat krim anastesi yang melekat di kulit.
h. Dilakukan terapi microneedling pada parut akne tipe rolling lainnya dengan menggunakan roller ukuran 1,5 mm dengan arah berbentuk star-like dengan tekanan sekitar 5 N (500 gram) sampai tampak bintik-bintik perdarahan.
i. Setelah seluruh wajah selesai dilakukan microneedling, dilakukan subsisi pada parut akne tipe rolling menggunakan jarum no.27G.
j. PRP disuntikkan menggunakan spuit dengan jarum no.27 G pada parut akne tipe rolling sampai terlihat menonjol di salah satu pipi, diikuti dengan pengolesan PRP.
k. NaCl 0.9% disuntikkan menggunakan spuit dengan jarum no.27G pada parut akne tipe rolling sampai terlihat menonjol di pipi lainnya, diikuti dengan pengolesan NaCl 0.9%
l. Daerah yang telah diterapi dioleskan salep gentamisin.
m. Pasien diingatkan agar tidak mencuci ataupun melakukan manipulasi lain di daerah wajah selama 12 jam.
n. Seluruh tindakan tersebut di atas diulang kembali 4 minggu kemudian, kecuali tindakan biopsi plong.
30
o. Empat minggu kemudian, kembali dilakukan biopsi plong dengan menggunakan alat biopsi plong ukuran 1,5 mm pada daerah pipi kiri dan kanan. Spesimen yang diperoleh difiksasi dengan formalin untuk kemudian dibawa ke laboratorium untuk pemeriksaan histopatologi untuk mendapatkan gambaran histopatologi jaringan kolagen setelah tindakan terapi. Ahli patologi anatomi tidak mengetahui spesimen mana yang diterapi dengan PRP.
p. Hasil pemeriksaan kemudian ditabulasi dan dilakukan analisis statistik untuk menilai
perbedaan
q. Biopsi plong dilakukan dengan cara:
1. Setelah kulit dibersihkan dengan larutan antiseptik dan dilakukan anastesi lokal, punch dipegang dengan tangan kanan antara ibu jari, jari tiga, dan jari empat, jari dua di atas alat punch.
2. Kulit sekitar daerah yang akan dibiopsi diregangkan dengan menggunakan ibu jari dan jari dua tangan kiri dengan arah berlawanan dengan garis relaxed skin tension lines sehingga pada waktu punch
diangkat akan meninggalkan luka berbetuk oval atau elips.
3. Punch ditekan arah vertikal kulit yang akan dibiopsi sambil diputar hingga kedalaman mencapai lapisan subkutan. Lalu punch dilepas. 4. Jaringan biopsi diangkat dengan pengait dan bagian dasarnya dipotong
dengan gunting.
5. Perdarahan yang terjadi dihentikan dengan melakukan penekanan dilanjutkan dengan menjahit.
r. Pemeriksaan histopatologi dilakukan oleh dokter spesialis Patologi Anatomi dengan menggunakan pewarnaan hematoksilin eosin (HE) dan
Masson’s trichrome stain (MTS).
s. Cara melakukan pemeriksaan histopatologi:
1. Jaringan dimasukkan ke dalam gelas beaker berisi alkohol 70% dalam inkubator bersuhu 600
2. Dilakukan proses penjernihan dengan memindahkan jaringan tersebut ke dalam gelas beaker berisi larutan benzol dan diinkubasi selama 3 jam dalam inkubator bersuhu 60
C selama 45 menit
0
3. Dilakukan impregnasi, yaitu penyusupan lilin parafin ke dalam jaringan, jaringan tersebut dipindahkan ke dalam gelas beaker berisi lilin parafin, diinkubasi selama 3 jam dalam inkubator bersuhu 60
C
0
4. Jaringan dimasukkan ke dalam cetakan berisi lilin parafin panas, selanjutnya didinginkan hingga membeku dan membentuk blok parafin, proses ini disebut embedding
C
5. Blok parafin dipotong hingga ketebalan 4-6 mikron dengan menggunakan mikrotom
6. Potongan tipis jaringan ditempatkan pada gelas objek 7. Dilakukan deparafinisasi dengan cara:
- Preparat dimasukkan ke dalam xylol selama 2 menit - Dicelupkan ke dalam HCl 2% sebanyak 10 celup - Dicelupkan ke dalam alkohol 80% sebanyak 10 celup - Dibilas dengan air mengalir
32
- Preparat dimasukkan ke dalam larutan hematoksilin selama 2 menit
- Dicuci dengan air mengalir selama 2 menit
- Dicelupkan ke dalam HCl 2 % selama 10 celup, lalu dicuci dengan air mengalir selama 1 menit
- Dicelupkan ke dalam larutan amoniak 2% sebanyak 2 celup - Preparat dimasukkan ke dalam larutan eosin selama 2 menit - Dicelupkan ke dalam alkohol 96% sebanyak 10 celup
- Preparat dimasukkan ke dalam larutan carboxylol selama 1 menit
- Dimasukkan ke dalam larutan xylol selama 1 menit, sisa xylol
dibuang dan ditetesi etilen, kemudian sediaan ditutup dengan kaca penutup
9. Dilakukan pewarnaan MTS dengan cara:
- Dilakukan fiksasi dengan Bouin atau formalin buffered neutral 10%.
- Potongan parafin dipotong dengan ukuran 6 mikron. - Dilakukan deparafinisasi dan hidrasi dengaan air suling. - Dilakukan pewarnaan dengan larutan Bouin selama 1 jam
dengan suhu 56 0
- Dilakukan pendinginan dan pencucian dengan air yang mengalir sampai warna kuning menghilang.
C.
- Direndam dengan larutan Weigert’s iron hematoxylin selama 10 menit, kemudian dilakukan pencucian dengan air mengalir selama 10 menit.
- Dilakukan pencucian dengan air suling.
- Direndam dengan larutan Biebrich scarlet-acid fuchsin
selama 2 menit.
- Dilakukan pencucian dengan air suling.
- Direndam dengan larutan Phosphomolybdic-phosphotungstic acid selama 10 – 15 menit sebelum larutan anili biru. (Aqueous phosphotungstic acid 5% selama 15 menit sebelum
light green counterstain), kemudian larutan dibersihkan. - Direndam dengan larutan anilin biru selama 5 menit atau
larutan light green selama 1 menit. - Dilakukan pembilasan dengan air suling.
- Direndam dengan larutan glacial acetic selama 3 – 5 menit, kemudian larutan dibersihkan.
- Dilakukan dehidrasi dengan alkohol 95%, alkohol absolut, dan dijernihkan dengan xylene, masing-masing 2 changes.