BAB III METODOLOGI PENELITIAN
D. Alat yang Digunakan
1. Neraca analitik (Mettler PM 4600, Delta Range®)
2. Perkolator
22
4. Seperangkat alat gelas seperti beaker glass, labu ukur, gelas ukur, pipet
tetes, pipet ukur, cawan petri, pengaduk, erlenmeyer, corong.
5. Vacuum rotary evaporator (Merk IKA Labor Tehnik)
6. Oven (Memmert)
7. Jarum dan alat suntik 1ml
8. Jarum suntik peroral (p.o)
9. Steroform berdiameter +/- 15 cm sebagai alas tidur subjek uji
10.Stopwatch
E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman krokot (Portulaca oleraceae Linn.) dilakukan
menurut Backer (1973). Determinasi ini dimaksudkan untuk memastikan bahwa
tanaman tersebut adalah benar-benar krokot (Portulaca oleraceae Linn.).
2. Pemanenan
Daun krokot (Portulaca oleraceae Linn.) dipanen di Kaliurang,
Kabupaten Sleman, Yogyakarta, pada waktu siang hari.
3. Pengeringan
Daun krokot (Portulaca oleraceae Linn.) yang dipeoleh kemudian
dibersihkan di bawah air yang mengalir agar bersih dari debu dan kotoran yang
menempel pada daun. Setelah bersih, daun dikeringkan di bawah sinar matahari
benar-benar kering. Hal ini dapat dipastikan dengan mematahkan daun dengan tangan.
Bila daun mudah dipatahkan berarti daun sudah benar-benar kering.
4. Pembuatan serbuk
Setelah daun krokot (Portulaca oleraceae Linn.) benar-benar kering
kemudian diserbuk dengan menggunakan blender sampai halus dan diayak dengan
ayakan tepung.
5. Pembuatan ekstrak etanol daun krokot
Ekstrak dibuat dengan menyari daun krokot dengan pelarut etanol 70%
secara perkolasi. Cara pembuatan ekstrak etanol daun krokot adalah sebagai
berikut. Sebanyak 160 gram serbuk daun dimasukkan ke dalam perkolator yang
sudah diberi kertas saring dan kapas pada bagian bawah dan dinding perkolator.
Kemudian tambahkan etanol 70% sampai seluruh bagian serbuk terbasahi dengan
pelarut etanol tersebut. Biarkan serbuk terendam pelarut etanol selama 24 jam
agar zat aktif dapat larut lebih dulu. Setelah itu buka keran perkolator sehingga
perkolat dapat menetes keluar dengan kecepatan 1 ml (20-30 tetes) per menit.
Tambahkan berulang-ulang pelarut etanol sehingga selalu terdapat selapis pelarut
etanol di atas simplisia. Ekstraksi terus dilakukan sampai senyawa-senyawa yang
terlarut dalam etanol sudah terekstraksi semua. Hal ini ditandakan oleh tetesan
terakhir perkolat tidak berwarna lagi. Hasil ekstraksi yang diperoleh kembali
disaring lebih dulu sebelum diuapkan dengan tekanan rendah dengan suhu tidak
lebih dari 50°C menggunakan vakum rotaevaporator untuk mendapatkan ekstrak yang kental. Kemudian ekstrak kental dikeringkan dalam oven dengan suhu tidak
24
6. Penetapan dosis natrium tiopental
Dosis terapi natrium tiopental adalah 4-5 mg/kgBB (Dollery,1999).
Setelah dilakukan orientasi dosis natrium tiopental untuk mendapatkan waktu
induksi tidur yang singkat, ditetapkan dosis 5 mg/kgBB sebagai dosis yang akan
dipakai pada penelitian ini. Kemudian dilakukan konversi dosis antara manusia
dengan berat badan 70 kg ke mencit 20 g yang menurut Laurence & Bacharach
(cit.,Anonim, 2007c) yaitu 0,0026, sehingga didapatkan dosis natrium tiopental
yaitu 5 mg x 70 kg x 0,0026 = 0,91 mg/20 g mencit, yaitu 45,5 mg/kgBB mencit.
7. Penetapan dosis diazepam
Dosis terapi diazepam adalah 2-10 mg (Dollery, 1999). Dosis diazepam
sebagai kontrol positif dibagi menjadi 4, yaitu dengan rumus:
1 − =n dah dosisteren nggi dosisterti I 1 4 2 10 − = 3 5 = 7099 , 1 = I
Setelah itu dilakukan konversi dosis antara manusia dengan berat badan 70 kg ke
mencit 20 g, sehingga pembagian dosis kontrol positif, yaitu:
Dosis I : 2,00 mg x 0,0026 x 1000/20 = 0, 260 mg/kgBB mencit
Dosis II : 2,00 mg x 1,7099 x 0,0026 x 1000/20 = 0,445 mg/kgBB mencit
Dosis III : 3,42 mg x 1,7099 x 0,0026 x 1000/20 = 0,760 mg/kgBB mencit
8. Penetapan dosis ekstrak etanol daun krokot
Karena ekstrak etanol daun krokot tidak larut dalam air, maka ekstrak
dilarutkan dalam CMC 1% agar didapatkan suspensi ekstrak etanol daun krokot
dalam CMC 1%. Penetapan dosis ekstrak etanol daun krokot dilakukan dengan
orientasi terlebih dahulu. Dicari dosis terendah ekstrak etanol daun krokot yang
mampu memberikan perpanjangan waktu tidur mencit dibandingkan waktu tidur
mencit pada kontrol negatif. Kemudian dosis dinaikan sedikit demi sedikit untuk
mencari dosis tertingginya, yaitu dosis yang masih memberikan efek tanpa
menyebabkan kematian dari 1 atau lebih subjek uji.
Ekstrak etanol daun krokot diberikan dalam 4 dosis. Dosis terendah dan
tertinggi yang didapatkan adalah 1000 mg/kgBB dan 3500 mg/kgBB mencit.
Sama seperti cara pembagian dosis pada diazepam, pembagian dosis perlakuan
ekstrak etanol daun krokot yaitu:
1 − =n dah dosisteren nggi dosisterti I 3 1 4 3,5 1000 3500 = = − 51829 , 1 = I Dosis I : 1000,00 mg/kgBB Dosis II : 1000,00 mg/kgBB x 1,51829 = 1518,29 mg/kgBB Dosis III : 1518,29 mg/kgBB x 1,51829 = 2305,21 mg/kgBB Dosis IV : 2305,21 mg/kgBB x 1,51829 = 3500,00 mg/kgBB
26
9. Perlakuan subyek uji
Subyek uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan
galur Swiss, umur 2-3 bulan dengan berat badan 20-30 gram. Subyek uji yang
digunakan sebanyak 54 ekor dibagi dalam 9 kelompok. Sebelum digunakan
mencit dipuasakan selama satu hari dengan diberi air minum.
Sebelum diberi obat, semua mencit ditimbang. Pada waktu pemberian
obat atau pada waktu t = 0 , sediaan uji diberikan per oral kepada mencit
kelompok uji. Pembagian kelompok perlakuan hewan uji, yaitu :
Kelompok I : diberi aquadest sebagai kontrol negatif dengan dosis 16,667
mg/kg BB mencit secara oral
Kelompok II : diberi larutan diazepam sebagai kontrol positif dengan dosis
0,260 mg/kg BB mencit secara oral
Kelompok III : diberi larutan diazepam sebagai kontrol positif dengan dosis
0,445 mg/kg BB mencit secara oral
Kelompok IV : diberi larutan diazepam sebagai kontrol positif dengan dosis
0,760 mg/kg BB mencit secara oral
Kelompok V : diberi larutan diazepam sebagai kontrol positif dengan dosis
1,300 mg/kg BB mencit secara oral
Kelompok VI : diberi ekstrak etanol daun krokot dengan dosis perlakuan
1000,000 mg/kg BB mencit secara oral
Kelompok VII : diberi ekstrak etanol daun krokot dengan dosis perlakuan
Kelompok VIII: diberi ekstrak etanol daun krokot dengan dosis perlakuan
2305,210 mg/kg BB mencit secara oral
Kelompok IX : diberi ekstrak etanol daun krokot dengan dosis perlakuan
3500,000 mg/kg BB mencit secara oral
Pada t = 45 menit setelah pemberian diatas, semua mencit diberikan obat natrium
tiopental dengan dosis 45,5mg/kgBB secara i.p.
10. Penentuan daya antistres
Selesai penyuntikan, diamati saat masing-masing mencit mulai tidur,
yaitu hilangnya reflek pemulihan posisi tubuh yang dicatat sebagai waktu tidur
untuk tiap mencit (waktu induksi yaitu waktu yang berlangsung sejak penyuntikan
hipnotik hingga saat mencit mulai tidur). Pada saat ini mencit dites. Telentangkan
mencit dalam bejana pengamatan tepat ditengahnya yang telah diberi alas
steroform. Dicatat kemudian waktu dalam detik saat muncul kembali reflek
pemulihan posisi tubuh bergerak meninggalkan pusat bejana. Lama tidur mencit
adalah sejak saat terjadi induksi tidur sampai saat munculnya kembali reflek
pemulihan posisi tubuh normal