DAFTAR PUSTAKA
4 Mikroalga BTM 11 81,205 % Putri, 2011 b 5 Ekstrak rimpang temulawak
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
3.3.7. Analisa angka kapang
3.3.7.1. Pembuatan Media Pembenihan
Sebanyak 39 gram serbuk Potato Dextrose Agar dilarutkan dengan 1 liter air suling dalam erlenmeyer menggunakan hotplate dan magnetic stirer hingga diperoleh larutan yang jernih. Media ini kemudian disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121oC tekanan 15 lbs selama 15 menit (Hadiotomo, 1990).
3.3.7.2. Pebuatan Sampel Uji dan Analisa Angka Kapang
Sebanyak 1 gram serbuk simplisia dilarutkan dalam 10 ml aquades steril sehinga didapatkan konsentrasi suspensi sebasar 10%. Dari stock yang ada diambil 1 ml pengenceran 10-1 ke dalam tabung yang berisi pengenceran aquadest steril hingga diperoleh pengenceran 10-2 lalu dibuat hingga pengenceran 10-4. Dari masing–masing pengenceran diambil 0,5 ml, dituangkan pada permukaan PDA, segera digoyang sambil diputar, agar suspensi tersebar merata. Seluruh cawan diinkubasi pada suhu 20 – 25o C selama 3 - 4 hari. Sesudah 3 hari inkubasi, dicatat jumlah koloni jamur yang tumbuh, pengamatan terakhir pada inkubasi hari ke- 4. Koloni ragi dapat dibedakan dengan koloni kapang dari bentuknya yang bulat kecil berwarna putih hampir menyerupai bakteri. Lempeng agar yang diamati adalah lempeng dimana terdapat 40 – 60 koloni kapang (Hadiotomo, 1990).
3.3.8. Produksi enzim helikase HCV
3.3.8.1. Pembuatan Media
Media LB (Luria-Bertani) cair dibuat sebagai medaia untuk pertumbuhan E.coli BL21 (DE3) pLysS-RNA helikase HCV rekombinan. Media LB dibuat sebanyak 10 ml untuk prekultur dan 400 ml untuk kultur. Semua disterilisasi pada suhu 121o C selama 15 menit (Utama et al, 2000).
3.3.8.2. Pembuatan larutan dapar
Pembuatan dapar dibuat dengan komposisi Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM, dan Tween 20 0,25%. Dicampur menjadi satu dan diaduk hingga homogen.
3.3.8.3. Ekspresi dan purifikasi RNA helikase HCV .
a. Media LB 10 ml diberi ampisilin (100µg/ml) sebanyak 10 µl dan dihomogenkan. Lalu dimasukkan bakteri E.Coli BL21 (DE3) pLsS yang membawa gen RNA helikase HCV, kemudian diinkubasi selama satu malam dalam inkubator goyang pada suhu 37o C dengan kecepatan 200 rpm.
b. Hasil prekultur tersebut diinokulasi ke dalam 400 ml LB yang telah diberi ampisilin dan ditambahkan IPTG 0,3 mM. Lalu diinkubasi dalam inkubator goyang pada suhu 37o C dengan kecepatan 200 rpm. c. Hasil kultur E.coli BL21 (DE3) pLysS yang dinkubasi selama 3 jam dalam inkubator goyang, pada suhu 37o C, dipindahkan ke dalam tabung-tabung sentrifus ukuran 50 ml, disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm, selama 10 menit. Endapan dicuci dengan media LB, disentrifugasi kembali selama 10 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Pelet diambil dan dikumpulkan peletnya kemudian disimpan selama satu malam pada suhu -20oC.
d. Purifikasi RNA Helikase. Pelet yang disimpan pada suhu -20oC dilakukan freeze thawing atau pengeringbekuan sebanyak tiga kali. Setelah itu disonikasi (pemecahan sel dengan alat sonikator) dengan amplitudo 45 %, cycle 0,5, selama 15 detik dilakukan tiga kali dengan interval masing-masing 1 menit. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 10000 rpm selama 20 menit untuk menghasilkan pelet. Kemudian pelet ditambahkan resin TALON 300 µl pada rotator pada suhu dingin selama 3 jam. Lalu disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 7 menit. Supernatan sebagai inner volume (IV) diambil 50 µl untuk di analisa dengan metode SDS-PAGE, sedangkan pelet ditambahkan larutan buffer B sebanyak 10
ml, kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil sebanyak 50 µl sebagai washing pertama (W1) untuk analisa SDS-PAGE. Pelet ditambahkan kembali buffer B sebanyak 10 ml, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil sebanyak 50 µl sebagai washing kedua (W2) untuk SDS-PAGE. Pelet dipindahkan ke dalam eppendorf tube 1,5 ml kemudian disentrifugasi 3000 rpm selama 2 menit. Pelet yang ada di dalam eppendorf tube 1,5 ml ditambahkan buffer elusi sebanyak 200 µl kemudian di rotator pada suhu dingin semalaman. Setelah di rotator semalaman, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit (supernatan dipindahkan ke dalam eppendorf tube 1,5 ml lainnya sebagai E1/elution pertama untuk analisa SDS-PAGE). Sedangkan pelet ditambahkan buffer elusi kembali sebanyak 200 µl, kemudian dilakukan sentrifugasi kembali dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit. Supernatan dipisahkan dari peletnya sebagai E2/elution kedua untuk analisa SDS-PAGE (Utama et al, 2000).
e. Analisa enzim helikase dengan SDS – PAGE
Enzim RNA helikase ini dianalisa kemurniannya dengan menggunakan SDS-PAGE. Glass plate sandwich (short plate & spacer plate) dibersihkan dengan alkohol 70%. Short plate ditempatkan di depan kaca spacer plate. Kedua kaca tersebut kemudian dimasukkan ke dalam casting frame dengan posisi bagian bawah kedua kaca sama rata lalu kunci dengan cams. Casting frame dipasang pada casting stand. Setelah peralatan siap, larutan gel separating dibuat sesuai dengan prosedur (Lampiran 6a). Larutan tersebut dimasukkan diantara celah short plate & spacer plate sampai dua per tiga bagian lalu ditambahkan aquades sampai dengan batas atas kaca, kemudian ditunggu ± 20 menit sampai terbentuk gel. Selama menunggu 20 menit, larutan gel stacking dibuat sesuai dengan prosedur (Lampiran 6b). Sebelum gel stacking dimasukkan,
air yang ada pada gel separating dibuang. Larutan gel stacking dituang sampai batas atas kaca, comb dimasukkan, kemudian ditunggu ± 20 menit sampai gel memadat.
Setelah gel memadat, gel dipindahkan dari casting frame dengan cara menekan cams pada casting frame. Gel cassette sandwich ditempatkan pada electrode assembly dengan posisi short plate menghadap ke dalam, lalu ditempatkan ke dalam clamping frame, kemudian ditutup kedua camp levers pada clamping frame. Lower inner chamber dimasukkan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan working solution (buffer elektroforesis SDS 1x pH 8.3).
Masing-masing sampel (IV, W1, W2, E1, E2) diambil 4 µl lalu dimasukkan ke dalam eppendorf tube 1,5 ml dan ditambahkan Loading dye (Lampiran 6c) kemudian didenaturasi pada suhu 95o C selama 10 menit. Marker precision plus protein standard sebanyak 4 µl dimasukkan ke dalam well. Sampel yang telah didenaturasi dimasukkan masing-masing sebanyak 5 µl/well. Kemudian gel dirunning pada 40 mA selama 90 menit. Gel diangkat lalu direndam dalam commasie Blue G–250 staining solution (Lampiran 6d) selama 1 jam sambil digoyang-goyang diatas rocker. Gel dibilas dengan commasie blue G–250 destaining solution (Lampiran 6e) ± 20 menit, dengan dua kali pengulangan. Gel dibilas dengan H2O sampai bau asamnya hilang dan disimpan pada suhu 4o C.
3.3.8.4. Uji aktivitas ATPase RNA Helikase HCV
Pengujian aktivitas ATPase RNA helikase HCV ini menggunakan enzim RNA helikase yang telah dipurifikasi. Enzim RNA helikase dibuat dengan berbagai pengenceran (5x, 10x, 20x, 40, 80x). Blanko dibuat dengan komposisi 5 µl aquabides dan 45 µl master mix (H2O, MOPS, MgCl, dan ATP). Untuk sampel uji, konsentrasi akhir reaksi sebesar 50 µl/well mengandung 45 µl master mix (H2O, MOPS, MgCl, ATP, dan RNA helikase HCV) dan 5 µl enzim. Campuran reaksi diinkubasi dalam microtiter plate 96-well, pada suhu ruang selama 45
UIN Syarif Hdayatullah Jakarta menit. Hasil reaksi divisualisasikan dengan penambahan 100 µl/well larutan pewarna (malachite green). Reaksi diinkubasi selama 5 menit, kemudian ditambahkan sodium sitrat untuk menghentikan reaksi warna. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 620 nm dengan referensi 405 nm (Utama et al,2000).
3.3.8.5. Uji Aktivitas Jintan Hitam (Nigella sativa L.) sebagai Inhibitor RNA
Helikase HCV
Pengujian inhibisi enzim helikase hepatitis C ini menggunakan sampel berupa ekstrak kental biji jintan hitam dari 3 jenis pelarut (n-heksan, etil asetat dan metanol). Pengujian ini dilakukan dengan menggunakan uji ATPase kolorimetri (Utama et al, 2000), yaitu dengan mengukur jumlah fosfat yang dilepaskan dari hidrolisis senyawa ATP menjadi ADP dan Pi.
Masing-masing ekstrak kental jintan hitam dibuat dengan berbagai konsentrasi yakni 500 ppm, 1000 ppm, 2000 ppm, 4000 ppm, 8000 ppm, 16000 ppm dan 32000 ppm. Ekstrak kental jintan hitam ini dilarutkan dengan menggunakan metanol p.a.
Blanko dibuat dengan komposisi 5 µl aquabides dan 45 µl master mix (H2O, MOPS, MgCl, ATP dan RNA helikase) dan untuk sampel konsentrasi akhir reaksi sebesar 50 µl/well menggandung 45 µl master mix (H2O, MOPS, MgCl, ATP, dan RNA helikase HCV) dan 5 µl ekstrak. Campuran reaksi diinkubasi dalam microtiter plate 96-well, pada suhu ruang selama 45 menit. Hasil reaksi divisualisasikan dengan penambahan 100 µl/well larutan pewarna (malachite green). Reaksi diinkubasi selama 5 menit, kemudian ditambahkan sodium sitrat untuk menghentikan reaksi warna. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 620 nm dengan referensi 405 nm (Utama et al, 2000). Persentase inhibisi dapat dihitung dengan rumus :
Keterangan :
A = Absorbansi enzim RNA helikase tanpa penambahan sampel % Inhibisi = A – I x 100 %