DAFTAR PUSTAKA
4 Mikroalga BTM 11 81,205 % Putri, 2011 b 5 Ekstrak rimpang temulawak
4.5. Produksi dan Purifikasi Enzim Helikase HCV 1. Ekspresi Enzim RNA Helikase HCV
4.5.2. Purifikasi Enzim RNA Helikase HCV
Purifikasi enzim RNA helikase HCV dilakukan untuk memurnikan hasil ekspresi enzim RNA helikase HCV yang telah disisipkan dalam bakteri E.coli BL21(DE3) pLySs.
Enzim dipurifikasi dengan pemecahan sel terlebih dahulu. Pemecahan sel ini berlangsung dengan menggunakan dua tahap yaitu dengan cara pengeringbekuan (freeze thawing) dan sonikasi. Pengeringbekuan menyebabkan pembentukan kristal es pada sel E.coli yang membawa gen RNA helikase HCV. Kristal es terbentuk akibat dilakukannya pengeringbekuan yang berlangsung berulang terhadap cairan intraselular dan cairan ekstraselular. Proses inilah yang memudahkan pemecahan sel (Schwen & Melling, 1985).
Pemecahan sel tahap kedua menggunakan sonikasi yang bertujuan untuk memecah dinding sel. Dengan sonikasi ini menyebabkan organel dalam sel keluar namun tidak merusak integritas fungsionalnya. Pada saat melakukan sonikasi ini pelet ditambahkan buffer B yang mengandung 10 mM Tris HCl pH 8,5 ; 100 mM NaCl dan 0,25% Tween 20. Tris HCl pH 8,5 ini berfungsi untuk mempertahankan aktivitas enzim selama proses purifikasi enzim. Tween 20 digunakan untuk menghancurkan lipid bipolar pada membran sel. Lipid bipolar ini berasosiasi dengan kompleks replikasi sehingga enzim RNA helikase melekat pada membran (metabolit intraselular). Dengan rusaknya lipid bipolar akan menyebabkan disosiasi bagian hidrofobik enzim RNA helikase dengan membran sel. Sedangkan NaCl berfungsi untuk menghilangkan asam nukleat dan kontaminan lainnya yang berikatan tidak spesifik dengan RNA helikase HCV dengan cara interaksi ionik (Vanz et al, 2008).
Setelah dilakukan sonikasi, selanjutnya dilakukan sentrifugasi dan mengambil supernatannya. Supernatan ini berisi metabolit intraselular yang perlu dimurnikan. Pemurnian ini dilakukan dengan metode kromatografi afinitas. Metode pemurnian ini menggunakan resin TALON afinitas logam (metal afinity) yang secara spesifik dapat mengikat RNA helikase yang telah dilabel dengan 6xHis-Tag pada N terminalnya. Pengikatan residu His ini dilakukan oleh logam Co2+ yang terdapat pada resin TALON. Menurut Petty (1996), histidin akan berikatan secara selektif dengan logam Co2+ resin TALON meskipun dalam resin tersebut terdapat ion metal bebas lainnya. Pengikatan ini dilakukan di rotator. RNA helikase yang telah diikat oleh resin TALON dipisahkan dengan metabolit intraseluler lainnya melalui sentrifugasi. Sentrifugasi ini menghasilkan pelet yang mengandung RNA helikase dan supernatan yang mengandung metabolit intraselular. Resin yang telah berikatan dengan enzim, dimurnikan kembali dengan pencucian menggunakan buffer B. Pencucian ini dimaksudkan untuk menghilangkan protein non target. Pemurnian berikutnya, pengikatan imidazole yang terdapat dalam buffer elusi dengan resin TALON, sehingga enzim akan terlepas dari ikatan resin. Konsentrasi imidazole lebih dari 200 mM menyebabkan protein yang memiliki residu His-tag terdisosiasi karena tidak mampu lagi bersaing untuk berikatan dengan resin.
Setiap hasil sentifugasi pada tahap pemurnian enzim dikoleksi untuk dianalisis dengan menggunakan metode SDS-PAGE. Analisis ini bertujuan untuk mengetahui kemurnian enzim. SDS-PAGE merupakan teknik yang digunakan untuk menganalisis bobot molekul suatu protein. Prinsip kerjanya adalah pemisahan berdasarkan migrasi protein pada media penyangga. Komposisi SDS-PAGE ini adalah akrilamid, Tris HCl, H2O, tetrametina-diamina dan ammoium persulfat. Akrilamid berguna untuk pembentukkan gel, Tris HCl sebagai inisiator dalam proses polimerasi akrilamid menjadi poliakrilamid. Sedangkan tetrametina-diamina berguna sebagai katalisator reaksi polimerasi akrilamid menjadi poliakrilamid. Untuk pewarnaan hasil SDS-PAGE digunakan pereaksi warna commasie blue dan destain for
37 kDa 50 kDa 75 kDa 100 kDa 150 kDa 250 kDa
commasie sebagai pembilasnya sehingga dapat menampakkan pita protein sesuai ukuran target yang diinginkan.
Dari hasil SDS-PAGE, enzim RNA helikase HCV yang telah dipurifikasi dalam penelitian ini mempunyai ukuran protein sebesar 54 kDa yang ditunjukkan pada Gambar 7 dengan marker sebagai pembandingnya. Bobot molekul enzim ini sesuai dengan bobot enzim yang dilaporkan Utama et al (2000). Sehingga dapat disimpulkan bahwa protein dalam E1 adalah enzim RNA helikase murni. Inner volume (IV) merupakan larutan yang diambil setelah dilakukannya proses pemecahan sel, namun belum dilakukan tahap purifikasi dengan penambahan resin TALON sehingga masih terdapat metabolit intraseluar yang belum termurnikan. Untuk lajur W1 (washing 1) dan W2 (washing 2) tidak menunjukkan adanya pita protein yang artinya pada proses ini tidak terbawa enzim RNA helikase virus hepatitis C. Sedangkan untuk E1 (elution 1) dan E2 (elution 2) merupakan hasil elusi enzim yang dilakukan dua kali. Pada Gambar 7 menunjukkan 54 kDa
Gambar 7. Elektroforesis SDS-PAGE RNA Helikase. (M : Marker, E : Enzim, IV : Inner Volume, W : Washing)
bahwa E1 dan E2 memiliki pita protein yang sama ukurannya, hanya pada E1 pita tampak lebih tebal dikarenakan konsentrasi enzim yang lebih tinggi pada proses elusi yang pertama.
4.6. Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kental Jintan Hitam terhadap Enzim RNA Helikase HCV
Ekstrak kental jintan hitam dari hasil maserasi menggunakan n-heksan, etil asetat dan metanol digunakan sebagai sampel dalam pengujian aktivitas inhibisi enzim RNA helikase HCV ini. Masing-masing ekstrak dibuat dalam berbagai konsentrasi yaitu 500 ppm, 1000 ppm, 2000 ppm, 4000 ppm, 8000 ppm, 16000 ppm dan 32000 ppm. Pengujian aktivitas inhibisi dilakukan dengan metode ATPase kolorimetrik. Uji kolorimetrik melibatkan pengukuran serapan senyawa anorganik yang dilepaskan dalam hidrolisis ATP oleh enzim RNA helikase.
Larutan master mix diperlukan pada uji kolorimetrik ATPase. Asam 4-morfolinopropanafosfat sulfonat (MOPS) digunakan sebagai buffer dalam master mix. Buffer ini bertujuan untuk menjaga stabilitas enzim. ATP yang ditambahkan berperan sebagai substrat untuk RNA helikase. Keberadaan Mg2+ diperlukan sebagai kofaktor RNA helikase sehingga MgCl2 berfungsi sebagai donor kofaktor dalam master mix (Utama et al.2000).
Aktivitas enzim RNA helikase bergantung pada ATP sebagai donor energi. Oleh karena itu, uji ATPase dapat digunakan untuk uji aktivitas inhibisi RNA helikase HCV oleh sampel. Prinsip ujinya adalah pengukuran fosfat bebas yang terbentuk dari hasil reaksi antara RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan ADP dan Pi (fosfat anorganik). Pi bebas akan membentuk kompleks warna dengan pereaksi ammonium molibdat membentuk fosfomolibdat. Fosfomolibdat dapat bereaksi dengan enzim RNA helikase dan enzim akan mengendap dan menimbulkan kekeruhan. Polivinil alkohol akan melarutkan kembali enzim yang terendapkan sehingga tidak menimbulkan kekeruhan. Warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi Pi yang dihasilkan dari reaksi RNA helikase dan ATP
(Chan et al, 1986). Na sitrat digunakan untuk menghentikan reaksi enzimatik yang mengakibatkan terjadinya warna yang berlebih.
Tahap berikutnya dilakukan pengukuran absorbansi menggunakan multiscan EX dengan panjang gelombang 620 nm dan 405 nm. Panjang gelombang 620 nm adalah serapan optimum warna hijau kebiruan yang merupakan kompleks warna yang dibentuk dari hasil reaksi larutan pewarna dengan fosfat bebas hasil hidrolisis ATP. Sedangkan warna kuning merupakan warna yang dihasilkan oleh larutan pewarna yang tidak berikatan dengan Pi. Penggunaan dua panjang gelombang bertujuan agar perhitungan reaksi antara enzim dengan substrat lebih akurat. Perhitungan konsentrasi Pi dihasilkan dengan membandingkan nilai absorbansi dari pembacaan kedua panjang gelombang tersebut (Chan et al, 1986).
Data berikut merupakan hasil dari uji ATPase kolorimetrik dengan menggunakan ekstrak jintan hitam :
Konsentrasi Ekstrak
Aktivitas ekstrak sebagai inhibitor RNA helikase HCV(%) Ekstrak n-heksan Ekstrak etil asetat Ekstrak metanol 32.000 ppm 64,454 38,804 27,617 16.000 ppm 60,598 33,782 21,933 8.000 ppm 52,915 29,327 18,915 4.000 ppm 33,513 21,674 16,056 2.000 ppm 22,152 11,958 12,331 1.000 ppm 19,522 9,566 10,405 500 ppm 14,469 8,789 7,450
Data diatas menunjukkan bahwa jintan hitam berpotensi sebagai inhibitor RNA helikase HCV. Ketiga ekstrak menunjukkan adanya aktivitas untuk menghambat proses ATPase dari uji kolorimetri. Pada data tersebut menyatakan bahwa dengan kenaikan konsentrasi sampel maka persentase ekstrak sebagai inhibitor juga meningkat. Data diatas memperlihatkan dari ketiga ekstrak, ekstrak n-heksan memiliki aktivitas yang lebih besar dibandingkan ekstrak etil asetat maupun metanol. Persentase yang ditunjukkan diduga menyatakan besarnya aktivitas penghambatan yang dilakukan oleh ekstrak jintan hitam tersebut, namun untuk mengetahui kepastian apakah masing-masing ekstrak tersebut menginhibisi atau tidak belum adanya batas/nilai persentase yang dapat menyatakan bahwa ekstrak tersebut dapat menginhibisi RNA helikase virus hepatitis C.
Pengujian inhibitor RNA helikase ini diilihat berdasarkan aktivitas ATPase dalam uji kolorimetrik ATPase. Aktivitas ATPase pada enzim helikase yang dipakai untuk n-heksan adalah sebesar 524,987 pmol fosfat/ml/menit/pmol protein. Dengan penambahan ekstrak n-heksan pada uji tersebut terlihat bahwa aktivitas ATPase menurun (Lampiran 19).
Pada saat pengujian sampel/masing-masing ekstrak jintan hitam ditambahkan ke dalam satu well sebanyak 5 µl untuk masing-masing konsentrasi. Volume akhir dalam satu well tersebut setelah penambahan master mix adalah 50 µl. Pada konsentrasi terendah yaitu 500 ppm, dinyatakan bahwa konsentrasi ekstrak yang berikatan dengan RNA helikase virus hepatitis C adalah sebesar 0,05 µg/µl, untuk konsentrasi yang berikatan pada masing-masing konsentrasi dapat dilihat pada Lampiran 16.
Ekstrak n-heksan jintan hitam ini berbentuk cairan kental seperti cairan minyak pada umumnya. Senyawa thymoquinone merupakan senyawa non polar yang terdapat dalam jintan hitam. Thymoquinone telah diketahui mempunyai aktivitas sebagai antioksidan (Burits M & F. Bucar, 2000). Penelitian–penelitian sebelumnya telah memaparkan beberapa potensi dari minyak jintan hitam ini, salah satunya telah diungkapkan oleh Salem dan Hossain (2000) bahwa minyak jintan hitam mampu berperan sebagai agen antivirus dari MCMV (Murine Cytomegalovirus). Penelitian ini sudah
dilakukan secara invivo dengan menggunakan tikus yang diberi 100 µg BSO (black seed oil) per mencit. Dari penelitian tersebut Salem dan Hossain menyatakan bahwa ada kemungkinan minyak jintan hitam mampu untuk melawan kanker, AIDS dan penyakit parasit lainnya yang berhubungan dengan kekebalan tubuh. Selain itu, Kawther, Ahmed dan Sakina (2008) mengatakan bahwa jintan hitam memiliki potensi antivirus terhadap Infectious Laryngotrachietis Virus (ILTV) dengan nilai EC50 sebesar 32 µM. Adanya potensi ekstrak jintan hitam sebagai inhibitor RNA helikase HCV ini memperpanjang daftar potensi jintan hitam sebagai antivirus.
Pengujian sampel pada uji kolorimetri ATPase, sampel dilarutkan dengan menggunakan metanol p.a. Metanol yang secara kimia merupakan zat denaturan enzim. Namun selama masih dalam konsentrasi kecil (5µl) maka metanol tidak menganggu kerja ekstrak dalam menginhibisi enzim RNA helikase HCV. Konsentrasi metanol dalam menganggu proses kerja dapat dikontrol dengan cara menjadikan metanol sebagai kontrol negatif. Pengujian ini tidak menggunakan kontrol positif dikarenakan belum ditemukannya obat atau vaksin HCV yang sesuai dengan mekasisme inhibisi RNA helikase HCV.
Hasil penapisan fitokimia didapatkan bahwa ekstrak n-heksan jintan hitam mengandung steroid/terpenoid dan minyak atsiri. Hal ini sesuai yang dilaporkan Erika (2010) bahwa ekstrak n-heksan jintan hitam mengandung steroid/triterpenoid dan minyak atisiri. Dari hasil penapisan fitokimia tersebut maka dapat diperkirakan bahwa yang berpotensi sebagai inhibitor RNA helikase HCV adalah senyawa steroid/triterpenoid, dan minyak atsiri.
Pada penelitian sebelumnya, betulinic acid yang merupakan senyawa dari triterpenoid diketahui mempunyai aktivitas sebagai antiviral HIV-1 (David et al, 2008). Fungus Ganoderma pfeifferi. diidentifikasi juga mengandung senyawa triterpenoid (ganodermadiol, lucidadiol dan applanoxidic acid) yang memperlihatkan adanya aktivitas sebagai agen antivirus pada influenza virus type A dan herpes virus symplex-type 1 (Mothana, 2003). Pada jintan hitam, senyawa terpenoid (sabinene hydrate
methyl ether) mempunyai potensi sebagai antioksidan (Borgou, Pichette, Lavoie, Marzouk & Legault, 2011). Tidak menuntut kemungkinan bahwa senyawa yang berpotensi sebagai inhibitor RNA helikase HCV ini merupakan senyawa terpenoid yang berada dalam ekstrak jintan hitam.
Ada beberapa kemungkinan mekanisme inhibisi RNA helikase. Kemungkinan mekanisme pertama, inhibitor menempel pada RNA helikase bukan pada sisi aktifnya, namun terjadi perubahan konformasi bentuk enzim yang mengakibatkan berkurangnya interaksi enzim dengan substrat (Borowski, Heising, Miranda, Liao, Choe & Baier, 2008). Mekanisme kedua, inhibitor menyerupai substrat dan bersaing menempati sisi aktif RNA helikase, sehingga ATP tidak dapat berikatan dengan enzim yang menyebabkan enzim tidak memiliki energi untuk membuka untai ganda RNA (Reece & Mitchell, 2002).