(RAPD) dan RANDOMLY AMPLIFIED FINGGERPRINT DNA (RAF)
ABSTRAK
Embrio somatik (ES) globular normal dan abnormal, ES kotiledon normal dan abnormal, daun planlet dan daun tanaman induk normal dengan menggunakan teknik RAPD dan RAF bertujuan untuk melihat perubahan sekuen DNA genom. Informasi yang diperoleh dengan teknik RAPD pada ES kotiledon normal dan abnormal dapat dibedakan dengan primer OPE14,OPC9, W15, AP20 dan SC10-19 pada klon MK638, sedangkan ES kotiledon MK558 normal dan abnormal dapat dibedakan dengan OPE14, W15 dan AP20. Primer OPE14, W15 dan AP20 menunjukkan perbedaan antara ES kotiledon normal dan abnormal pada pita yang spesifik sekitar 1750 pb. Dengan deteksi RAF terdapat enam primer yang dapat membedakan antara ES kotiledon normal dan abnormal, planlet dan daun tanaman induk normal. Dengan Teknik RAF terjadi perubahan sekuen DNA genom pada 90 – 358 pb. Primer AO12, BB18, dan W15 yang menunjukkan perubahan sekuens DNA genom pada fragmen spesifik disekitar 150 pb. Dengan primer AB16 dapat mendeteksi perubahan sekuens DNA ES kotiledon normal dan abnormal hingga satu pasang basa pada lokasi 95 pb. Teknik RAPD dan RAF dengan primer W15 dan AP20 dapat membedakan perubahan sekuen DNA genom kotiledon normal dan abnormal, planlet dan tanaman induk normal.
---Kata Kunci:Kelapa sawit, embrio somatik, abnormalitas- embrio somatik, RAPD,
RAF. PENDAHULUAN
Kelapa sawit adalah tanaman menyerbuk silang sehingga akan menghasilkan keturunuan yang heterogen . Dengan metode perbanyakan vegetatif secara kultur jaringan, besar kemungkinan untuk memperoleh material tanaman yang berkualitas sekaligus homogen. Keunggulan teknik kultur jaringan di antaranya adalah dapat digunakan untuk menyediakan bibit kelapa sawit unggul secara massal, seragam dalam waktu yang relatif singkat dibandingkan dengan teknik konvensional. Perbanyakan bibit kelapa sawit melalui kultur jaringan dapat dilakukan melalui pembentukan embrio somatik. Akan tetapi beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa embrio somatik yang dihasilkan melalui kultur jaringan menunjukkan keragaman somaklonal yang tinggi. Keragaman
somaklonal pada embrio somatik yang ditunjukkan oleh adanya abnormalitas secara sitologi, mutasi genotip, perubahan karyotipe dan perubahan sekuens DNA
(Duncan 1997 ; Kaeppler et al., 2000). Variasi somaklonal disebabkan oleh proses
kultur jaringan yang diinduksi oleh pemberian 2,4-D dengan konsentrasi tinggi (Deambrogio & Dale 1980).
Keragaman somaklonal adalah keragaman genetik tanaman yang dihasilkan melalui kultur jaringan (Larkin & Scowcroft 1981). Keragaman genetik yang terjadi didalam kultur jaringan disebabkan oleh penggandaan jumlah kromosom (fusi, endomitosis), perubahan struktur kromosom, perubahan gen dan perubahan
sitoplasma (Griffith et al. 1993; Kumar 1995). Menurut van Harten (1998) variasi
somaklonal kemungkinan disebabkan oleh ketidakaturan mitotik yang berperan dalam terjadinya ketidakstabilan kromosom dan aplifikasi atau delesi gen.
Perubahan dalam kultur jaringan sering terjadi melalui mekanisme
stress-response. Mekanisme yang berhubungan dengan kehilangan program kontrol seluler. Ada beberapa perubahan dalam kultur jaringan yaitu perubahan susunan kromosom, metilasi DNA dan mutasi. Mutasi yang terjadi pada kultur jaringan
dengan fenomena mutasi salient yang disebut mutasi repeat-induced point (RIP)
yang terjadi saat premeotik, pertama kali ditemukan pada fungi filamentous (Selker & Steven 1985).
Abnormalitas dapat terjadi pada bunga jantan dan betina yang berkembang
menjadi buah partenokarpi dan buah mantel (bersayap) (Corley et al. 1986). Ada
beberapa pendapat mengenai terjadinya abnormalitas bersifat genetic (Rao & Danough 1990), gangguan ekspresi gen yang diakibatkan fitohormon (Jones 1991;
Paranjothy et.al. 1993), struktur kalus yaitu kalus nodular yang kompak dan kalus
yang remah dengan pertumbuhan yang cepat menghasilkan 5-10 % dan 100% tanaman abnormal (Pannetier et al. 1981; Ahee et al. 1981 ; Duran et al. 1993).
Menurut Paranjothy et al. (1993) dan Ginting dan Fatmawati (1996) abnormalitas
ada hubungannya dengan lamanya subkultur dan umur kalus. Eeuwens et al. (2002) menyatakan, bunga mantel terjadi dari kondisi kultur selama multiplikasi embrio.
Analisis genotipik dapat dilakukan dengan analisis tingkat DNA suatu tanaman. Analisis DNA atau analisis molekuler merupakan salah satu pendekatan
biologi molekuler untuk identifikasi suatu genotip dan juga pemetaan genom. Keuntungan utama analisis genotipik pada tingkat DNA adalah tercerminnya perubahan pada tingkat DNA yang menunjukkan jarak genetik yang sesungguhnya antara individu yang satu dengan yang lain daripada analisis fenotipik karena seringkali fenotip yang sama bias dimunculkan genotip yang berbeda atau sebaliknya, genotip yang sama dapat dimunculkan oleh fenotip yang berbeda (Serret et al. 1997).
Analisis DNA juga dapat mengevaluasi kemurnian klon, varietas atau hibrida dan kestabilan genetic (Toruan-Mathius & Hutabarat 1997), menganalisis tingkat homozigositas/ heterozigositas dan mengungkapkan genotip tanaman induk dalam program silang balik (Mayers et al. 1996), menetapkan karakter agronomis (Ayres et al. 1997) dan bermanfaat untuk evolusi suatu tanaman (Brown 1993). Aplikasi penanda molekuler telah berkembang dan ditunjukkan untuk mengatasi masalah atau menguatkan penanda lainnya seperti penanda morfologi, sitologi, histology, isoenzim dan biokimia (Rongwen et al. 1995; Akagi et al. 1996; Ayers et al. 1997).
Perkembangan teknologi baru telah dapat mengembangkan analisis yang dapat mempertinggi tingkat polimorfisme DNA untuk pemetaan genetic, MAS,
genom fingerprinting dan untuk menemukan hubungan genetik. Teknologi
tersebut meliputi antara lain: RFLP, RAPD, AFLP dan mikrosatelit (SSR).
Polimorfisme berdasarkan AFLP (Vos et al. 1995) dan RFLP mengungkapkan
variasi ukuran berdasarkan situs restriksi (Hulbert and Michelmore, 1988). Polimorfisme berdasarkan RAPD mencerminkan variasi sekuen DNA pada situs pelekatan primer dan dari perbedaan panjang DNA antara situs pelekatan primer. Lokus SSR berbeda pada jumlah unit ulangan secara tandem dari oligonukleotida (di tri, atau tetranukleotida ) yang ada pada DNA dan variasi panjang ini dapat dideteksi dengan PCR dan memanfaatkan sepasang primer yang mengapit SSR tersebut ( Powell et al. 1996).
Karp et al. (1997) mengelompokkan teknik menjadi tiga kategori dasar berdasarkan apakah analisa tersebut menggunakan PCR atau tidak, dan apakah primernya arbitrari/ semi-arbitrari atau spesifik dirancang berdasarkan sekuen yang diketahui terlebih dahulu : (1) tidak berdasarkan PCR (RFLP, VNTRs); (2)
Teknik berdasarkan primer arbitrari atau semi arbitrari (multiple arbitrarily amplicon profiling) (MAAF) misalnya: RAPD, DAF atau AFLP dan RAF; (3)
Site-targeted PCR (STMS), SSR.
RAPD adalah suatu metode analisis DNA genom melalui pola pita DNA yang dihasilkan setelah genom tersebut diamplifikasi menggunakan suatu primer tunggal. Metode ini didasarkan pada reaksi berantai polimerase atau dikenal
dengan PCR (Polymerase Chain Reaction) dengan menggunakan polimerase
DNA yang tahan terhadap suhu tinggi. RAPD merupakan salah satu metode penanda genetik yang mempunyai beberapa kelebihan , yaitu : (1) DNA yang digunakan lebih sedikit, (2) tidak menggunakan radioisotop, (3) hasilnya diperoleh dalam waktu yang relatif singkat karena tidak memerlukan banyak tahapan, dan (4) primer acak digunakan untuk analisis genom semua organisme tanpa mengetahui latar belakang genmnya (Wells & McClelland 1990).
Analisis RAPD mempunyai keterbatasan, yaitu sangat sensitif terhadap kondisi reaksi dan profil suhu. Selain itu, penanda RAPD tidak dapat membedakan individu homozigot dominant dan heterozigot karena keduanya sama-sama menghasilkan pita DNA pada pola pita yang dihasilkan (Ronning
et al. 1995). Analisis DNA dengan RAPD dapat digunakan untuk penciri gen atau kromosom dan sidik jari genom dan juga dapat digunakan untuk membuat peta
genom (Miklas et al. 1996). Teknik RAPD dilakukan berdasarkan adanya suatu
sekuens DNA yang homolog dengan sekuen primer oligonukleotida. Sekuen tersebut akan berada pada situs yang berbeda pada dua utas DNA cetakan. Setiap primer secara terus-menerus membentuk beberapa produk amplifikasi yang berbeda dan fragmen tersebut dianggap berasal dari lokus-lokus genetic yang berbeda (Waugh 1997).
Penelitian dengan pemanfaatkan tehnik RAPD telah banyak digunakan untuk membantu kegiatan pemuliaan tanaman, antara lain analisis variasi genetik, mengetahui hubungan kekerabatan pada tanaman dengan melihat jarak kemiripan genetiknya. Penelitian yang dilakukan oleh Wilde et al. (1992) dengan menggunakan RAPD dapat membedakan antar klon-klon kelapa sawit hasil kultur jaringan, dan perbedaan klon-klon itu memberikan pita polimofik yang berbeda.
Randomly Amplified DNA Fingerprinting (RAF) yaitu teknik berdasarkan
amplifikasi primer arbitrari (Waldron et al. 2002). Teknik RAF hampir sama
dengan DAF. Teknik RAF ini lebih efisien, tegas dan sensitif dan memiliki
beberapa keunggulan, yaitu tidak membutuhkan kemurnian DNA template yang
tinggi, tahapan relative lebih sederhana dan deteksi dilakukan pelabelan primer dengan radioaktif atau fluoresen. Kunci teknik RAF adalah (i) memiliki primer oligonukleotida 10-mer dengan konsentrasi yang tinggi, suhu penempelan (annealing) yang tinggi pada 53 – 59 oC dan menggunakan fragmen DNA polymerase Soffel; (ii) primer dilabel dengan radioaktif atau fluoresens; (iii) pemisahan fragmen dan deteksi hasil amplifikasi dengan sekuensing gel
poliakrilamid atau mesin DNA sekuensing (Waldron et al. 2002).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perubahan sekuens DNA genom antara ES globular normal dan abnormal, ES kotiledon normal dan abnormal, daun plantlet dan daun tanaman induk normal dengan teknik RAPD dan RAF.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan tanaman yang digunakan adalah ES yang sudah dikarakterisasi normal dan abnormal, daun planlet dan daun muda ortet klon MK638 serta MK558 yang berasal dari Balai Penelitian Marihat (Tabel 3).
Tabel 3. Pengambilan Contoh Untuk Isolasi DNA
Keterangan : Normal (N), Abnormal (Ab)
Klon E.S E.S E.S. E.S. Daun Daun
Globular Globular Kotiledon Kotiledon Plantlet Induk
638 N Ab N Ab N N
Metode
Isolasi DNA
DNA diisolasi dari kalus, ES, daun planlet dan daun induk dengan menggunakan metode Doyle dan Doyle (1987) dengan memodifkasi beberapa komponen dalam proses awal ekstrasi DNA. Sebanyak 2,5 g masing-masing contoh dibersihkan dan dikeringkan dengan tissue kemudian di masukkan ke dalam mortar yang telah didinginkan. Ke dalam lumpang ditambahkan 0.1% PVP dan digerus dengan menambahkan Nitrogen cair sampai diperoleh serbuk halus. Serbuk di masukkan ke dalam tabung Eppendorf berisi 2 ml buffer ektrasi [CTAB 10% b/v]; EDTA 0.5 M pH 8.0; Tris HCl 1M pH 8.0; NaCl 5M] 10 ul merkaptoetanol 1% (b/v). Campuran dikocok kuat menggunakan vorteks,
dipanaskan 20 menit pada suhu 60oC, kemudian didinginkan sampai suhu kamar
dan ditambahkan 750 ul larutan kloroform : isoamil alkohol (24:1) dan divorteks. Campuran disentrifus selama 10 menit pada 11.000 rpm. Bagian atas dipipet ke dalam tabung Eppendorf lain dan diekstrak kembali dengan 1 ml larutan kloroform : isoamilalkohol (24:1), disentrifus selama 10 menit pada 11.000 rpm. Cairan bagian atas dipipet ke tabung Eppendorf lain, kemudian ditambahkan 750 ul isopropanol dingin, dikocok perlahan hingga homogen dan disimpan dalam -20oC semalam, kemudian disentrifus selama 10 menit pada 11.000 rpm. Cairan ditabung dan endapan dikeringkan dengan vakum selama 1 jam. DNA kering dilarutkan dalam 200 ul bufer TE (Tris-HCl 1M pH 8.0; EDTA 0.5M pH 8.0).
Untuk meghilangkan RNA, ke dalam 200 ul larutan DNA ditambahkan 20 ul RNase (10 mg/ml) dan campuran tersebut diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC, kemudian diinkubasi dalam lemari es (4oC) semalam. Larutan DNA
disimpan pada suhu -20oC.
Uji kualitas dan kuantitas DNA
Kualitas dan kuantitas sampel DNA ditentukan menggunakan teknik elektroforesis 1% gel agarose. Gel agarose 1 % dibuat dengan melarutkan 0.4 g
agarose dalam 40 ml bufer TAE 1x (Tris base, asam asetat glasial, 0.5 M EDTA, pH 8.0) dipanaskan hingga mendidih. Larutan agarose dituang ke dalam cetakan elektroforesis yang di dalamnya telah diletakkan sisir sebagai cetakan sumur, dibiarkan sampai gel memadat. Kemudian gel diletakkan ke dalam bak elektroforesis yang telah diisi larutan TAE 1x sampai terendam. Sampel DNA di masukkan ke dalam sumur gel dan dirunning secara elektrik kurang lebih satu jam pada voltase 60 V. Selanjutnya dilakukan dokumentasi gel dengan alat Kodak Gel Logic dengan soft ware. Ketebalan pita DNA menunjukkan kuantitas contoh DNA dibandingkan dengan tebalnya pita DNA lambda yang telah diketahui konsentrasinya. Sedangkan kualitas DNA ditetapkan berdasarkan keutuhan pita DNA bewarna putih tebal tanpa ada pita yang smear.
A. Metode Analisis RAPD
DNA masing-masing contoh selanjutnya digunakan untuk analisis PCR menggunakan 10 primer 10-mer dengan susunan sekuens terdapat pada lampiran 5. Komposisi reaksi PCR disajikan dalam Tabel 4. Reaksi amplifikasi dilakukan menggunakan alat Thermal Cycler Gene PCR (ABI 9700) dengan siklus termal sebanyak 45 kali dengan tahapan sebagai berikut : untuk 1 menit
pada suhu 94oC, 1 menit pada suhu 36oC, 2 menit pada 72 oC dan 4 menit pada
72oC, setelah mencapai 45 siklus terdapat tahap extention time selama 4 menit
pada suhu tetap 72oC. Hasil PCR dapat difraksinasi dengan menggunakan gel agarose 1,4% (b/v) dalam larutan TAE 1X 40 ml. Elektroforesis dijalankan pada 75 volt selama 1,5 jam. Hasil elektroforesis didokumentasi dengan Kodak Logic dott dengan software.
Tabel.4. Komposisi reaksi PCR dengan primer RAPD
Pereaksi Konsentrasi Volume akhir (ul) 1X
DNA Template (5 ng/ul) 5.0
dNTP (10mm) 0.2 mm 0.2
PCR Buffer (10X) + MgC12 (promega) 1x 2.5
Primer (10 pmol/ul) 10 pmol 1.0
Taq Polymerase (5U/ul) 1U 0.2
ddH2O 16.1
Total 25.0
Penelitian dilakukan di laboratorium Biotechnology & Plant Breeding SEAMEO BIOTROP, Bogor dan laboratorium Bioteknologi PT. BISI International, Kediri.
Bahan tanaman yang digunakan adalah ES dan daun tanaman ortet klon MK638, sedang ekstraksi DNA dilakukan menurut metode Doyle dan Doyle (1987) yang telah dimodifikasi. Amplifikasi DNA dengan PCR berdasarkan
metode Waldron et al. (2002) menggunakan delapan primer 10-mer (lampiran 5).
Amplifikasi DNA menggunakan menggunakan alat Thermal cycler Gene
PCR (ABI 9700) dengan siklus termal sebanyak 30 kali dengan tahapan sebagai
berikut : untuk denaturasi selama 5 menit pada suhu 94oC kemudian 0,5 menit
pada suhu 94oC ; untuk penempelan (annealing) yaitu 1 menit pada suhu 57 oC, 1
menit pada suhu 56 oC, 1 menit pada suhu 55oC, 1 menit suhu 54oC, 1 menit 53oC dan extension time (tahap ramping) 5 menit pada suhu tetap 72oC. Hasil PCR
diencerkan 10 kali denga TE bufer dan disimpan pada suhu -20 oC.
Untuk mendapatkan fragmen DNA digunakan DNA analyzer,
menggunakan standarisasi Gene ScanTM -500 LIZ. Untuk menjalankan
elektroforesis kapiler digunakan hasil PCR, 2 µL sampel ditambah dengan 0,2
ul Gene ScanTM -500 LIZ dan 7,8µL HiDi formamid, campuran didenaturasi pada
Tabel 5. Komposisi reaksi PCR dengan primer RAF
suhu 95o C selama 5 menit dan didinginkan dalam es selama 10 menit. Kemudian
diloading ke dalam alat kapiler yang panjangnya 50 cm dan akan bekerja secara
Pereaksi Konsentrasi Volume akhir (µl)
1 x Reaksi DNA Template (10 ng/(µl) 5.0 dNTP (10mM) 0.2 mM 0.4 PCR Buffer (10 x) 1 x 2.0 MgCl 2 (100mM) 3.5 mMl 0.7
Primer (5 pmol/ul) 10 pmol 2.0
Taq Polimerase Soffel (5U/µl) 1U 0.2
ddH2O 9.7
otomatis pada 3130 DNA Analyzer (Applied Biosystems). Analisis loading dalam ABI 3130 DNA Analyzer (Ampplied Biosystems) selama 32 menit untuk empat contoh dan data disimpan dalam perangkat lunak ABI 3130. Fragmen RAF diperlihatkan dalam bentuk elektroferogram.
HASIL DAN PEMBAHASAN