Karakteristik Morfologi Embrio Somatik Abnormal
Berdasarkan berbagai bentuk morfologi ES klon MK558, MK636, dan MK638 yang diamati, dapat disimpulkan bahwa fase perkembangan ES kelapa sawit terdiri atas kalus, fase globular, skutelar berbentuk hati, dan kotiledon. Pada masing-masing fase juga ditemukan bentuk morfologi yang berbeda, yang dapat dikelompokkan menjadi ES yang normal dan abnormal. Berbagai bentuk dari masing-masing fase perkembangan ES disajikan dalam Tabel 1. Fase perkembangan tersebut sama dengan perkembangan ES umumnya.
Tampak bahwa tahap awal, sel kalus berkembang menjadi embriogenik somatik globular berbentuk bulat dengan bidang polarisasi yang jelas serta permukaan ES umumnya halus. Masing-masing ES globular terpisah satu dengan lainnya (Gambar 2). Namun, di samping bentuk globular yang sempurna ditemukan juga bentuk yang tidak sepenuhnya globular, namun cenderung berbentuk lonjong dan bergerombol dengan struktur permukaan yang tidak rata. Penyimpangan bentuk tersebut dikelompokkan dalam kategori ES globular abnormal. Morfologi ES normal dan abnormal pada tahap globular sangat bervariasi antar klon maupun dalam klon yang sama (Tabel 1 & Gambar 2). Hal ini mungkin dapat disebabkan sifat polaritas masing-masing kutub (apikal dan basal) berkembang tidak terarah, hal ini dapat dilihat pada bentuk-bentuk abnormal yang beragam.
Perkembangan selanjutnya dari ES fase globular adalah pembentukan bakal kotiledon pada bagian apikal sedang bagian basal berkembang menjadi calon radikula atau akar, fase ini disebut skutelar berbentuk hati. Pada fase perkembangan skutelar berbentuk hati, ciri khasnya adalah tampak
Ab 1
Ab 2
Ab 3
Klon 558
Klon 638 Klon 636
Tabel 1. Karakteristik abnormalitas embrio somatik secara morfologi
Tahapan Perkembangan Embrio Somatik Karakteristik
Globular Skutelar Berbentuk Hati Kotiledon
Normal - Bulat Simetris Monokotiledon
- Bipolar
- Permukaan rata
Abnormal - Lonjong Lebih dari satu
Klon 638 - Bergerombol Asimetris kotiledon
- Permukaan tidak rata
Abnormal - Bulat tidak beraturan Asimetris Lebih dari satu
Klon 636 - Tidak bipolar kotiledon
Abnormal - Dua bulatan tidak Asimetris Lebih dari satu
Klon 558 beraturan kotiledon
- Tidak bipolar
Gambar 2. Perbandingan morfologi normal dan abnormal embrio somatik tahap
adanya pemisahan yang jelas antar calon kotiledon dan radikula (Tabel 1 & Gambar 3). Namun ditemukan juga penyimpangan bentuk, dalam hal mana bagian apikal tampaknya berkembang lebih pesat daripada bagian basal. Hal ini menyebabkan terjadi penekanan perkembangan bagian basal, yang terlihat tidak terbentuknya bagian radikula. Sedang bagian radikula membentuk beberapa calon kotiledon yang satu dengan lainnya bergabung menjadi satu (Gambar 4). Bentuk-bentuk abnormal tersebut sangat beragam baik dalam klon yang sama maupun antar klon.
Bagian apikal ES fase skutelar bentuk hati berkembang menjadi bentuk kotiledon yang lebih jelas (Gambar 4). Sedang bagian basal akan berkembang menjadi radikula, namun belum jelas terlihat adanya bakal akar. Perakaran pada planlet kelapa sawit umumnya diinduksi setelah terbentuk daun dengan sempurna.
Ditemukan juga struktur bagian apikal yang berkembang menjadi dua atau lebih bakal kotiledon yang bersatu pada bagian basal. Terbentuknya bakal kotiledon yang lebih dari satu menyebabkan beberapa ES fase kotiledon berbentuk kipas. Perkembangan bagian apikal yang aktif menyebabkan umumnya bagian basal bakal radikula sangat tertekan. Tampak bahwa adanya keragaman bentuk abnormal di dalam klon yang sama maupun antar klon.
Karakterisasi sel embriogenik yang dipelajari pada tingkat sitologi, histokimia dan biokimia menunjukkan bahwa sel-sel embriogenik sangat unik (Natesh dan Rau, 1984; Williams dan Maheswaran,1986). Perkembangan ES kelapa sawit diinisiasi dari eksplan daun muda, menghasilkan ES melalui kalus primer. Kalus terbentuk di sekitar lidi dan sebagian muncul sepanjang pembuluh daun bekas irisan (Schwendiman et al. 1988). Kalus primer bersifat massif, berwarna kuning kecokelatan, berbentuk bulat, satu sama lainnya berhubungan secara bersambungan. Kalus embriogenik mengandung bagian sel-sel meristimatik yang dilokasikan pada permukaan kalus. Pada bagian kalus yang meristimatik akan cepat membentuk embrio somatik ke tahap globular (Kysely & Jacobsen 1990). Perkembangan embrio somatik pada tanaman dikotil melalui tahap globular, hati (heart-shaped), torpedo, dan kotiledon (Jurgens et al. 1991), sedangkan pada tanaman monokotil melalui tahap globular, hati skutelar dan kotiledon.
Persentase abnormalitas ES yang tinggi dapat disebabkan sub kultur yang berulangkali dan umur kalus (Paranjothy 1993 ; Ignacimuthu 1997). Tingkat persentase abnormalitas embrio somatik yang tinggi, juga diduga penggunaan 2,4 D, hal ini juga menyebabkan terjadinya abnormal dalam proses pembelahan sel yang menyebabkan keragaman somaklonal. 2,4-D bukan saja bersifat auksin, tetapi adalah suatu fenoksi herbisida yang membunuh gulma berdaun lebar. Perubahan ekspresi suatu karakter disebabkan oleh perubahan genetik atau epigenetik. Perubahan genetik karena perubahan set kromosom, jumlah kromosom, struktur kromosom atau gen. Ekspresi dari karakter tersebut dapat
pada tingkat morfologi, fisiologi dan biokimia. (D’Amato 1986; Griffith et al.
1993; Kumar 1995).
Teknik kultur jaringan tidak selalu menghasilkan tanaman yang identik dengan induknya, karena selama proses kultur jaringan dapat terjadi variasi fenotipik baik yang disebabkan oleh perubahan genetik maupun epigenetik yang disebut variasi somaklonal. Keragaman genetik tanaman yang dihasilkan melalui kultur jaringan dapat diturunkan pada zuriat tanaman hasil regenerasi (Larkin dan
Scowcroft 1981; Skrivin et al. 1993). Variasi somaklonal merupakan keragaman
genetik yang terjadi secara spontan hasil regenerasi sel somatik pada kultur in
vitro. Variasi somaklonal dapat juga berasal dari keragaman genetik eksplan yang disebabkan adanya sel-sel bermutasi maupun adanya sel-sel polisomik dari jaringan tertentu (Wattimena 1992).
Variasi bentuk yang sangat beragam ini dapat disebabkan penggunaan zat pengatur tumbuh 2,4 D (100 mg/l) yang tinggi sewaktu inisiasi awal dari eksplan. Zat pengatur tumbuh merupakan pengatur perkembangan tanaman. Auksin dan sitokinin adalah zat pengatur tumbuh yang utama pada tanaman untuk mengatur pembelahan sel dan diferensiasi sel. Pengaruh 2,4 D dalam menginduksi embrio
somatik sangat baik (Dudits et al. 1991; Yeung 1995). 2,4 D mempunyai peranan
sebagai pusat memediasi transduksi signal untuk ekspreasi gen. Hasil pembelahan sel yang diinduksi dari pertumbuhan kalus yang tidak terorganisasi atau awal pertumbuhan polarisasi merupakan proses pembentukan embrio somatik.
Klon 558 Klon 638 Klon 636 Ab 1 Ab 2 Ab 3 Ab 1 Ab 2 Ab 3 Klon 558 Klon 638 Klon 636
Gambar 3. Perbangan morfologi normal dan abnormal embrio somatik tahap skutelar berbentuk hati. N (Normal), Ab (Abnormal).
Gambar 4. Perbandingan morfologi normal dan abnormal embrio somatik tahap kotiledon. N (Normal), Ab (Abnormal).
Kemampuan induksi embriogenik dapat dihasilkan dengan bermacam-macam
sensitivitas dari sel (Dudits et al. 1991). Ada dua mekanisme yang penting dalam
pembentukan sel embriogenik yaitu pembelahan sel asimetrik dan kontrol
pemanjangan sel (de Jong et al. 1993 ; Emons 1994). Pembelahan sel asimetrik
didorong oleh zat pengatur tumbuh yang merubah polaritas sel melalui interferensi gradien pH (Smith & Krikorian 1990).
Perkembangan embrio somatik pada tahap kotiledon dari masing-masing klon menghasilkan bentuk, ukuran dan permukaaan kotiledon yang bervariasi.
Ada bentuk kotiledon pada bagian ujung (Shoot) mempunyai bentuk
seperti :daun, bunga, tidak beraturan, dikotiledon (Gambar 4). Morfologi embrio somatik yang dihasilkan tiga klon pada masing-masing tahapan baik tahap globular, skutelar berbentuk hati, dan kotiledon memperlihatkan bentuk yang sangat beragam (Gambar 2, 3, dan 4).
Menurut Jurgens et al. (1991) bahwa hasil pemanjangan pada vaskular
primordium dan pembelahan sel paralel yang memperbesar permukaan apikal dari bagian embrio yang berperanan penting untuk pembentukan primordia secara lateral pada kotiledon, yang ditandai pembentukan hati scutellar. Selama transisi dari tahap globular ke hati, simetri bilateral terbentuk untuk inisiasi kotiledon. Variasi fenotipik pada embrio somatik ditentukan oleh faktor genetik dan epigenetik. Variasi somaklonal didefinisikan sebagai genetik dan variasi fenotipik diantara propagasi tanaman secara klon yang berasal dari sumber satu klon (Lee and Phillips 1988; Duncan 1997; Veillux & Johnson 1998 ; Olhoft & Phillips 1999). Penyebab variasi somaklonal melalui proses kultur jaringan juga dapat dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Aspek epigenetik dari variasi somaklonal terjadi melalui mekanisme silencing gen atau aktivasi gen dan bukan karena aberasi kromosom atau perubahan sekuens DNA. Perubahan ini mungkin tidak stabil atau dapat kembali secara somatik (Patterson et al. 1993; Cubas et al. 1999).
Histologi Embrio Somatik Abnormal
Embriogenesis somatik kelapa sawit terjadi melalui tiga fase yaitu globular, skutelar berbentuk hati dan kotiledon (Gambar 2, 3 dan 4). Tahap perkembangan embrio somatik ini sama dengan tahap perkembangan embrio zigotik tumbuhan monokotil umumnya. Sebagian besar embrio globular tersusun atas jaringan parenkima, sudah terlihat adanya sekumpulan sel-sel meristematik yang diduga akan berkembang menjadi prokambium membentuk jaringan pembuluh. Lapisan protoderm yang sel-selnya tersusun rapi terlihat pada bagian terluar dari embrio (Gambar 5.).
Secara histologi, sebagian besar tubuh embrio globular tersusun atas jaringan parenkima, sudah terlihat adanya sekumpulan sel-sel meristematik yang diduga akan berkembang menjadi prokambium yang akan membentuk jaringan pembuluh. Lapisan protoderm yang sel-selnya tersusun rapi terlihat pada bagian terluar dari embrio (Gambar 5). Seperti halnya ES berbentuk globular, ES skutelar berbentuk hati dan ES berbentuk kotiledon juga tersusun atas jaringan parenkima, jaringan prokambial dan protoderm. Menurut Fahn (1990) ES akan berkembang menjadi planlet yang memiliki daun dan akar apabila memiliki tiga jenis meristem, yaitu protoderm yang berkembang menjadi epidermis. Jaringan prokambial yang akan berkembang menjadi sistem jaringan pembuluh, dan meristem dasar yang membentuk korteks dan empelur.
Hasil pengamatan dilakukan menggunakan mikroskop elektron dengan perbesaran 400 kali pada sel meristimetik, jaringan prokambial dan protoderm (Tabel 2). Tampak bahwa ES fase globular normal memiliki sel meristematik yang menyebar, jaringan prokambial, dan protoderm terdiri dari satu lapisan sel yang tersusun secara teratur. Struktur anatomi ES fase globular abnormal berbeda dengan yang normal. Pada klon MK638 dan MK558 ES globular abnormal memiliki sel meristimetik pada bagian basal, jaringan prokambial bercabang dan protoderm memiliki satu lapisan sel yang susunannya teratur. Namun, pada klon MK636 memiliki pertumbuhan jaringan prokambial tidak teratur (Gambar 5).
10µm Mer Ps Pro
D
Pro Ps MerB
Pro Me r Mer PsA
Ps Mer ProC
Gambar 5. Perkembangan struktur anatomi ES fase globular yang abnormal dari A (Normal), B. Klon MK638, C. MK636, D. MK558, Mer
(Meristem), Pro (Protederm), Ps (Procambial strand).
Tampak adanya perbedaan morfologi ES fase skutelar berbentuk hati antara yang normal dan abnormal, khususnya pada jaringan prokambial dan protoderm pada ketiga klon yang diamati. ES skutelar berbentuk hati yang normal memiliki susunan dan perkembangan jaringan prokambial yang teratur. Sedangkan pada yang abnormal jaringan prokambialnya bercabang dan lapisan sel protoderm tidak terlihat jelas (Gambar 6).
Ada perbedaan anatomi antara ES klon MK638 yang normal dan abnormal dari setiap fase perkembangan. Anatomi Es fase globular normal dan abnormal tidak dapat dibedakan berdasarkan jaringan prokambial dan protodermnya. Namun, pada fase skutelar berbentuk hati dan kotiledon tampak adanya perbedaan
Pro Mer Ps
C
Pro Me r PsA
Mer Ps ProD
Ps Mer ProB
10µmyang sangat jelas. ES skutelar berbentuk hati yang normal memiliki jaringan prokambial yang teratur dan protoderm terdiri dari satu lapisan sel yang susunannya teratur. Sedangkan ES skutelar berbentuk hati yang abnormal memiliki jaringan prokambial yang bercabang dan protodermnya memiliki lapisan sel yang tidak teratur (Gambar 6 dan 7).
Gambar 6. Perkembangan Struktur anatomi ES abnormal kelapa sawit fase skutelar berbentuk hati. A. Normal, B. MK638, C. MK558, D.
MK636, Mer (Meristem), Pro (Protederm), Ps (Procambial
strand)
ES kotiledon normal memiliki jaringan meristematik yang jelas. Pada
bagian basal, yaitu Root apical meristem (RAM) berkembang untuk pembentukan
akar. Sedang bagian apikal Shoot apical meristem (SAM) berkembang menjadi
yang berdediferensiasi dengan cepat sehingga menghasilkan ukuran sel tidak sama, jaringan prokambialnya tidak teratur membentuk percabangan. Lapisan sel protoderm tidak terlihat jelas. ES kotiledon klon MK636 yang secara morfologi abnormal, memiliki sel meristimatik yang ukuran dan susunan selnya sama dengan ES kotiledon yang normal (Gambar 7 dan Tabel 2).
Gambar 7. Perkembangan struktur anatomi embrio somatik abnormal pada tiga klon kelapa sawit fase Skutellar berbentuk hati. A (Normal), B (klon 638), C (Klon 558), D (klon 636), Mer (Meristem),
Pro (Protederm), Ps (Procambial strand)
10µm Mer Pro Ps
A
Mer Ps ProB
Mer Ps ProC
Mer Ps ProD
Tabel 2. Hasil karakterisasi Abnormalitas Embrio Somatik Secara Histologi Tahapan Perkembangan Embrio Somatik
Karakterisasi
Globular Skutelar Berbentuk Hati Kotiledon Normal Merismatik Ada beberapa sel Menyebar merata Menyebar merata
merismatik Inti sel Inti sel tampak jelas tampak jelas Jaringan Tidak bercabang Tidak bercabang Tidak bercabang prokambial (teratur) (teratur)
Protoderm Satu lapis, rapi Satu lapis, rapi Satu lapis, rapi dan terlihat jelas dan terlihat jelas dan terlihat jelas Abnormal Merismatik Terlihat jelas Terlihat jelas Dinding sel Klon 638 pada bagian pada bagian tidak jelas
basal basal
Jaringan Tidak bercabang Bercabang Bercabang prokambial
Protoderm Satu lapis, rapi Terlihat tidak Terlihat tidak terlihat jelas jelas jelas
Abnormal Merismatik Terlihat jelas Terlihat jelas Menyebar merata Klon 636 pada bagian pada bagian dan inti sel
bawah (akar) bawah terlihat jelas Jaringan Bercabang Bercabang Tidak bercabang prokambial (teratur) Protoderm Satu lapis, rapi Satu lapis, rapi Satu lapis, rapi
dan terlihat jelas dan terlihat jelas dan terlihat jelas Abnormal Merismatik Terlihat jelas Bercabang Menyebar
Klon 558 di bagian bawah (sel pecah)
(akar)
Jaringan Bercabang Bercabang Menyebar
Prokambial (bercabang) Protoderm Satu lapis, rapi Terlihat tidak Terlihat tidak
Mer
Pro Mer
Secara histologi menunjukkan bahwa perbedaan normal dan abnormal terlihat lebih jelas pada ES fase kotiledon, khususnya struktur sel meristem, jaringan prokambial dan protoderm. Menurut Tomaz et al (2001) beberapa abnormalitas yang diamati pada perkembangan ES fase globular tanaman jeruk, yaitu tidak adanya lapisan protoderm disebabkan terjadinya de-diferensiasi protoderm. Di samping itu tidak terdapat apikal meristem dan jaringan prokambial. Kanchanapoom & Domyoas (1999) melaporkan bahwa pada kelapa sawit, perkembangan ES fase kotiledon terbentuk sel protodermal, jaringan prokambial, meristem akar dan pucuk. ES fase kotiledon yang abnormal disebabkan terjadinya pembelahan sel yang sangat aktif dikuti dengan diferensiasi sel. Sel-sel tersebut umumnya mengandung dan menyimpan lemak dengan konsentrasi tinggi. Bellincampi & Morpurgo (1989) menyatakan bahwa pembelahan sel meristem yang sangat aktif dapat disebabkan oleh pemberian zat pengatur tumbuh pada masa kultur.
Pada kelapa sawit induksi dan inisiasi kalus dilakukan dengan penambahan 2,4 D sampai 100 mg/l. Selanjutnya untuk regenerasi kalus, konsentrasi auksin dalam medium diturunkan. Namun, inisiasi kalus pada tahap awal sangat mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan ES dari fase kalus menjadi ES fase globular, skutelar berbentuk hati, dan kotiledon. Pada wortel 2,4-D berperanan penting dalam proses pembentukan embrio somatik. 2,4-D sebagai faktor inhibitor interaksi antara embrio proper dan suspensor. Pada beberapa konifers, embriogenesis somatik terhambat ketika densitas sel sangat tinggi (Ogita
et al. 2000). Menurut Goldworty dan Mina (1991) 2,4-D dengan konsentrasi tinggi bersifat herbisida dan menyebabkan perubahan jaringan atau mutasi.
Diferensiasi embrio zigot tanaman tediri dari dua komponen yaitu embrio proper dan suspensor. Suspensor berperan menyediakan makanan dan zat
pengatur tumbuh untuk embrio proper selama tahap embriogenesis (Swartz et al.
1997; Wredle et al. 2001). Auksin adalah salah satu kunci molekul signal pada
interaksi antara embrio proper dan suspensor, untuk tujuan pembentukan apikal-basal aksis selama embriogenesis.
Liu et al. (1993) dan Hadfi (1998) menyatakan embrio Brassica juncea
sehingga polaritas sel hilang dan perkembangan kotiledon menjadi abnormal. Berdasarkan struktur anatomi, embrio somatik berbentuk kotiledon diduga dapat berkembang menjadi planlet yang memiliki tajuk dan akar apabila ditemukan faktor tumbuh yang dapat mempercepat diferensiasi jaringan. Menurut Wattimena
et al. (1992) faktor tumbuh tersebut adalah jenis dan komposisi zat pengatur tumbuh serta lingkungan tumbuh yang sesuai.
SIMPULAN
1. Perkembangan eksplan tanaman kelapa sawit dalam kultur in vitro diawali dengan pembentukan kalus yang berdiferensiasi menjadi ES. Tahapan perkembangan ES mencakup fase globular, skutelar berbentuk hati dan kotiledon.
2. ES globular berbentuk bulat dengan polarisasi bagian apikal dan basal yang jelas. ES globular normal memiliki sel meristematik, jaringan prokambial tunggal, dan protoderm terdiri dari satu lapisan sel yang tersusun secara teratur. Abnormalitas terjadi pada bagian apikal dengan lebih dari satu bentuk globular yang bergabung. Hal ini ditandai dengan jaringan prokambialnya bercabang. Sedang pertumbuhan bagian basal umumnya terhambat.
3. ES globular berkembang menjadi ES skutelar berbentuk hati yang memiliki struktur bakal kotiledon yang jelas, sedang bagian basal akan berkembang menjadi calon radikula. Jaringan prokambialnya berada dalam satu alur. Sedang pada ES yang abnormal, percabangan jaringan prokambial semakin nyata dan lebih banyak yang menyebabkan pertumbuhan bagian apikal terjadi sangat cepat dan membentuk satu atau lebih bakal kotiledon.
4. ES skutelar berbentuk hati berkembang menjadi ES fase kotiledon. Struktur kotiledon sangat jelas, sedang bagian basal membentuk calon radikula. Abnormalitas ditandai dengan percabangan jaringan prokambial yang semakin jelas dan berkembang membentuk beberapa kotiledon yang bergabung. Karakterisasi ES dari tiap fase perkembangan yang normal dan abnormal untuk masing-masing klon dan dalam satu klon adalah berbeda.
BAB 4
ANALISIS ABNORMALITAS EMBRIO SOMATIK KELAPA SAWIT