METODE PENELITIAN
D. Analisis Antosianin
Ekstraksi antosianin (dimodifikasi dari Sims dan Gamon 2002)
Sebanyak 50.0 mg bubuk sampel kering beku diekstrak dengan 4 ml larutan metanol:HCl:air dengan perbandingan 90:1:1. Campuran ini divorteks hingga rata, kemudian disentrifus dengan kecepatan 2500 rpm selama 15 menit, hingga diperoleh filtratnya. Supernatan/filtrat tersebut dipisahkan dari endapan dan dianalisis kandungan antosianinnya dengan metode AOAC (2005) (Gambar 8).
Penentuan konsentrasi total antosianin (diadaptasi dari Lee et al. 2005)
Sebanyak 0.5 ml supernatan dimasukkan ke dalam dua tabung reaksi bertutup. Ke dalam salah satu tabung ditambahkan 6.5 ml buffer pH 1, sedangkan ke dalam tabung lainnya ditambahkan 6.5 ml buffer pH 4.5, kemudian divorteks. Campuran tersebut disimpan selama 20 menit, kemudian masing-masing diukur absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm dan 700 nm.
Konsentrasi antosianin total pada sampel yang diekspresikan sebagai sianidin-3-glukosida, dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Total antosianin (ekivalen dengan sianidin-3-glukosida, mg/l)= Ket: A = (A520nm– A700nm) pH 1.0 - (A520nm– A700nm) pH 4.5 Mr = 449.2 g/mol (sianidin-3-glukosida) FP = Faktor Pengenceran Ԑ = 26900 L x mol-1 x cm-1 103 = faktor konversi g ke mg E. Analisis Flavonoid
Ekstraksi Senyawa Flavonoid dari Daun Torbangun (diadaptasi dari Hertog et al. 1992b)
Terdapat dua metode ekstraksi yang dilakukan untuk menguantifikasi jumlah flavonoid pada sampel. Menurut Hertog et al (1992a), flavonoid jenis flavonol (myricetin, quercetin, dan kaempferol) lebih optimum diperoleh apabila metode ekstraksi menggunakan HCl 1.2 M, dengan lama reaksi hidrolisis 2 jam. Flavonoid golongan flavon (luteolin dan apigenin) lebih optimum diperoleh menggunakan HCl 2.0 M, dengan waktu reaksi selama 4 jam. Berikut ini diuraikan metode untuk mengekstrak komponen flavonoid dari golongan flavonol, adapun untuk golongan flavon hanya berbeda dari segi konsentrasi HCl dan waktu reaksi.
Tahap ekstraksi sampel diawali dengan pelarutan sebanyak 0.5 gram sampel kering beku ke dalam 20 ml metanol HPLC grade 62.5 % yang telah dicampurkan dengan g/L TBHQ (selanjutnya disebut “metanol TBHQ”) sebagai antioksidan. Kemudian, ditambahkan 5 ml HCl 6 M, lalu direfluks dengan refluks berkondensor spiral (Gambar 5). Suhu reaksi dijaga stabil 90 ºC selama dua jam. Tujuan penambahan asam adalah untuk menjaga komponen agar tidak terdegradasi, sedangkan perefluksan dilakukan untuk menghidrolisis gula pada
Gambar 5 Alat refluks berkondensor spiral yang digunakan
sampel. Flavonoid terkandung dalam tanaman dan sebagian besar makanan dalam bentuk glikosida. Ikatan ini perlu diputus secara maksimal agar flavonoid dapat terdeteksi oleh instrumen pengukur (HPLC).
Setelah dua jam, larutan didinginkan, lalu ditambahkan metanol TBHQ hingga volume larutan menjadi 50 ml. Larutan tersebut diekstrak kembali menggunakan sonikator selama 5 menit untuk menyempurnakan ekstraksi flavonoid. Proses pembuatan ekstrak flavonol dan flavon dari sampel secara ringkas dapat dilihat pada Gambar 9 dan 10.
Pembuatan larutan dan kurva standar campuran (Hertog et al. 1992b)
Pembuatan larutan standar stok
Masing-masing sebanyak 1.5 mg standar myricetin, luteolin, quercetin, dan kaempferol ditimbang, lalu dilarutkan dengan 3 ml metanol TBHQ. Standar apigenin dilarutkan sebanyak dua kali lipat, yaitu 3.0 mg dalam 3 ml metanol TBHQ. Konsentrasi standar apigenin dibuat dua kali dari standar yang lainnya karena apigenin memiliki respon yang paling rendah, dilihat dari nilai limit deteksi yang paling tinggi dibanding keempat senyawa lainnya (Batari 2007 dan Rahmat 2009). Nilai LOD kelima senyawa tersebut dapat dilihat di Tabel 4. Keseluruhan wadah penimbangan standar dibilas berulang kali dengan metanol TBHQ. Kemudian, larutan tersebut dicampurkan dengan 5 ml HCl 6 M untuk menjaga agar larutan tetap asam agar komponen flavonoid tidak terdegradasi. Setelah itu, larutan ditepatkan volumenya hingga 50 ml, sehingga diperoleh larutan standar stock dengan konsentrasi 30 ppm untuk standar myricetin, luteolin, quercetin, dan kaempferol; sedangkan untuk standar apigenin sebesar 60 ppm. Secara ringkas, proses pembuatan larutan standar stok flavonoid dapat dilihat pada Gambar 11.
Tabel 4 LOD kelima senyawa flavonoid
Komponen LOD (ppm) Batari (2007) Rahmat (2009) Myricetin 0.026 0.039 Luteolin 0.038 0.056 Quercetin 0.022 0.028 Apigenin 0.190 0.220 Kaempferol 0.037 0.047
Penentuan konsentrasi larutan standar flavonoid
Sebelum membuat larutan standar, terlebih dahulu diperkirakan konsentrasi yang dapat terdeteksi oleh instrumen serta mencakup kuantitas senyawa yang dimaksud pada sampel. Oleh karena itu, konsentrasi larutan standar dapat ditentukan setelah diketahui respon instrumen untuk keseluruhan sampel. Cara ini dapat memaksimalkan efisiensi penggunaan larutan, termasuk fase gerak. Alur penentuan konsentrasi larutan standar dapat dilihat pada Gambar 12.
Setelah larutan standar stok dibuat, larutan standar stok diencerkan (minimal) menjadi dua tingkat konsentrasi berbeda (misal: 2 dan 4 ppm), sehingga
diperoleh respon gambaran (berupa area) dari instrumen pada tingkat konsentrasi tersebut. Data respon ini digunakan untuk memperkirakan respon yang akan diberikan instrumen untuk beragam tingkat konsentrasi larutan standar.
Setelah didapat range respon instrumen untuk keseluruhan sampel, range kurva standar kemudian disesuaikan sehingga didapat sedikitnya 5 tingkat konsentrasi standar bagi masing-masing komponen standar campuran. Tingkat konsentrasi yang digunakan untuk standar myricetin adalah 0.2; 0.4; 2.0; 4.0; dan 6.0 ppm. Luteolin 0.5; 2.0; 4.0; 6.0; 8.0; dan 10.0 ppm. Quercetin 0.3; 0.4; 0.5; 2.0; 4.0; 6.0; dan 8.0 ppm. Apigenin ; 0.2; 0.4; 0.6; 1.0; dan 4.0 ppm. Kaempferol 0.5; 2.0; 4.0; 6.0; dan 8.0 ppm. Jika digabungkan, maka keseluruhan konsentrasi larutan standar ada 10 tingkat, yaitu 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 2.0; 4.0; 6.0; 8.0; dan 10.0 ppm. Angka-angka ini berlaku untuk standar myricetin, luteolin, quercetin, dan kaempferol, sedangkan apigenin 2 kali lipatnya.
Pembuatan kurva standar
Setelah larutan standar campuran dari ke-10 konsentrasi tersebut dibuat, larutan tersebut diinjeksikan ke kolom HPLC C-18 phase; Develosil ODS-UG-3 yang memiliki dimensi panjang 75 mm dan diameter dalam 4.6 mm. Fase gerak yang digunakan adalah 25 % acetonitril di dalam 0.025 M KH2PO4, dengan laju
aliran 0.9 ml/menit. Komponen-komponen flavonoid dideteksi dengan panjang gelombang 370 nm, sehingga instrumen memberi respon berupa peak yang dapat diketahui luas areanya. Respon dari instrumen HPLC ditampilkan dalam suatu kromatogram. Setelah kromatogram standar campuran pada berbagai konsentrasi yang diperoleh, selanjutnya disatukan ke dalam satu grafik untuk tiap komponen standar. Kemudian, dibuat persamaan garis masing-masing kurva standar. Persamaan ini akan digunakan pada perhitungan komponen flavonoid pada sampel.
Injeksi ekstrak sampel dan larutan standar ke kolom HPLC (Hertog et al. 1992b)
Sampel yang telah selesai diekstrak, kemudian disaring dengan syringe filter selulosa berdiameter pori 0.45 μm hingga menghasilkan sedikitnya 2 mL sampel yang siap untuk diinjeksikan ke kolom HPLC. Berbeda dengan sampel, penginjeksian larutan standar dapat dilakukan tanpa harus terlebih dahulu menyaring larutan dengan syringe filter. Volume yang diinjeksikan ke dalam kolom yaitu sebanyak 20 µL.
Identifikasi flavonoid
Penentuan jenis komponen dari peak yang dihasilkan mengacu pada penelitian Hertog et al. (1992b), sedangkan waktu retensinya diklarifikasi ulang dengan penelitian Hardianzah (2009) karena menggunakan instrumen dan jenis kolom yang sama. Jenis flavonoid ditentukan dengan cara membandingkan kromatogram sampel dengan kromatogram standar, berdasarkan waktu retensi masing-masing standar. Kestabilan waktu retensi dari standar dapat ditinjau kembali dengan menginjeksikan larutan standar, minimal setiap pergantian larutan eluen lama dengan yang baru. Larutan standar yang digunakan hendaknya memiliki tingkat konsentrasi yang tidak terlalu rendah. Konsentrasi flavonoid
dihitung dengan memasukkan luas area ke dalam persamaan kurva standar campuran yang telah diperoleh.
Analisis Data
Analisis data dalam penelitian ini dilakukan dengan dua metode, yaitu: A. Analisis of Variance (ANOVA)
Analisis ragam (Analysis of variance) dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan antara variabel-variabel yang diuji, dalam hal ini yaitu perbandingan komponen bioaktif antarklonal. Jika ditemukan perbedaan yang signifikan (output Anova menunjukkan angka yang kurang dari α yang digunakan, yaitu 0,05), maka dilanjutkan dengan uji lanjut yang mengkaji seberapa besar perbedaan yang terjadi antar variabel. Uji lanjut dilakukan dengan Tukey HSD apabila dari analisis ragam diketahui adanya perbedaan signifikan antarsampel pada taraf nyata (α) 5 %. Analisis data dilakukan menggunakan software SPSS 20.0 (IBM, New York, USA).