HASIL DAN PEMBAHASAN
D. Partial Least Square – Discrimination Analysis (PLS-DA) untuk diferensiasi profil senyawa flavonoid tiga klon torbangun
PLS-DA dilakukan untuk mengidentifikasi data secara komprehensif sehingga dapat membedakan karakteristik senyawa dari suatu sampel dengan sampel lain. Analisis data multivariat ini bertujuan untuk memudahkan memperoleh model yang dapat membuat separasi antarkelas yang diamati, berdasarkan variabel X-nya. Model analisis ini dikembangkan dari set pengamatan berdasarkan keanggotaan kelas yang telah ditentukan sebelumnya (Umetrics 2006). Dengan kapabilitasnya untuk mendiskriminasi data antarkelas, PLS-DA cocok digunakan dalam menganalisis data multivariat dari spektrum HPLC klon-klon torbangun yang telah terbagi menjadi tiga kelas.
Hasil PLS-DA diolah dari data dari spektrum HPLC yang telah dikelompokkan (di-bucket) per-0.08 menit. Data dianalisis terpisah berdasarkan metode ekstraksi dan hidrolisisnya, agar dapat diketahui perubahan karakter senyawa akibat perbedaan metode yang digunakan. Metode ekstraksi dan hidrolisis selama 2 jam; [HCl] 1.2 M selanjutnya disebut metode flavonol, sedangkan metode ekstraksi dan hidrolisis selama 4 jam; [HCl] 2.0 M selanjutnya disebut metode flavon.
Terdapat dua jenis output PLS-DA yang digunakan, yaitu score scatter plot (Score SP) dan loading scatter plot (Loading SP) (Gambar 23-24). Dari gambar tersebut terlihat bahwa score SP yang dihasilkan dari metode flavonol dan flavon memiliki posisi titik sampel klon A, B, dan C yang tidak jauh berbeda. Namun, jika dibandingkan loading SP-nya, hasil metode flavon memiliki lebih banyak senyawa dibanding metode flavonol. Hal ini terjadi karena pada metode flavon, hidrolisis dilakukan lebih lama sehingga lebih memungkinkan komponen bioaktif untuk lepas dari glukosidanya dan terdeteksi oleh instrumen. Senyawa-senyawa yang belum diberi label unknown peak (UP) 1-9. Namun, hanya senyawa yang memiliki luas area yang cukup signifikan yang disertakan dalam penentuan senyawa marker dengan metode PLS-DA ini, yaitu UP4, UP6, dan UP9. Karena UP9 terdapat berdekatan dengan titik acuan di seluruh klon, maka senyawa tersebut tidak dimasukkan dalam senyawa marker.
Dari loading SP (Gambar 23b dan 24b) dapat diketahui waktu retensi (ditandai dengan titik hijau) yang menjadi marker pada suatu sampel, dengan melihat kedekatannya dengan titik sampel dalam kuadran (ditandai dengan titik biru). Semakin dekat titik waktu retensi dengan titik sampel, maka semakin banyak pula senyawa dengan waktu retensi tersebut terdapat dalam sampel. Berikut merupakan rangkuman senyawa marker dari masing-masing klon dan metode:
Tabel 10 Senyawa marker dari tiap klon dan metode Metode Klon Senyawa marker
Flavonol A UP 4, UP6 B Myricetin, Quercetin C Kaempferol Flavon A Apigenin, UP 4, UP6 B Myricetin, Luteolin C Kaempferol
PLS-DA Profil Senyawa Flavonoid untuk Ekstraksi dan Hidrolisis Senyawa Flavonol
Score SP PLS-DA untuk metode ekstraksi dan hidrolisis flavonol ditampilkan pada Gambar 23a. Metode ini menghasilkan respon PLS-DA dengan persentase variabel yang dapat dijelaskan dari data yaitu sebesar 75.7 %. Angka ini diperoleh dengan menjumlah persentase PC1 dan PC2, masing-masing 57.6 % dan 18.1 %. Score SP tersebut menunjukkan separasi yang nyata antara klon A, B, dan C. Separasi ini menunjukkan bahwa ketiganya memiliki karakteristik senyawa yang berbeda, yang dapat diamati lebih lanjut dari senyawa marker-nya.
Bagian kuadran dari loading SP yang digunakan untuk mengamati variabel yang berpengaruh pada pengelompokan data komponen utama dapat ditentukan dengan mencocokkan loading SP dengan posisi mengelompoknya titik-titik pada score SP. Contohnya, untuk sampel dengan metode ekstraksi dan hidrolisis flavonol ini, sampel A mengelompok pada kuadran atas (Gambar 23a), maka untuk mengetahui waktu retensi dominan yang mempengaruhi pengelompokan tersebut dapat dilihat pada kuadran loading SP bagian atas (Gambar 23b). Titik acuan yang digunakan adalah titik yang berwarna biru pada loading SP. Demikian pula untuk klon B dan C.
Senyawa yang muncul sebagai marker bagi suatu sampel karena konsentrasi tertingginya terdapat pada sampel yang bersangkutan. Dari loading SP (Gambar 23b) dapat diketahui bahwa waktu retensi dominan untuk sampel klon A adalah pada menit ke-5; 6.25, 6.5; 10.75 dan 11. Seluruh waktu retensi ini dimliki oleh dua jenis senyawa, yaitu UP 5 dan UP6. Bagi klon B, waktu retensi yang dominan adalah pada menit ke-4 (myricetin); 4.5, 4.25 (UP4); serta 8.5, 8.75 (quercetin). Bagi klon C, waktu retensi yang dominan adalah 18.5, 18.75 (kaempferol). Senyawa yang disebutkan merupakan senyawa marker bagi klon terkait. Waktu retensi selain yang dipaparkan merupakan noise dari data spektrum yang digunakan dalam analisis.
PLS-DA Profil Senyawa Flavonoid untuk Ekstraksi dan Hidrolisis Senyawa Flavon
Gambar 24a menunjukkan score SP PLS-DA untuk metode flavon, dimana persentase variabel yang dapat dijelaskan dari data lebih rendah dari metode sebelumnya, yaitu sebesar 57.3 %. Angka tersebut diperoleh dari jumlah persentase PC1 dan PC2, masing-masing 55.4 % dan 19.0 %. Score SP pada Gambar 24a menunjukkan separasi yang nyata antara klon A, B, dan C. Separasi ketiga klon ini menunjukkan bahwa ketiganya memiliki karakteristik senyawa yang berbeda, yang dapat dilihat dari senyawa marker-nya.
Dari loading SP metode flavon (Gambar 24b) diketahui bahwa waktu retensi dominan untuk sampel klon A adalah pada menit 4.916 (UP4); 6.33, 6.4 (UP6); dan 14.58-14.91 (apigenin). Klon B memiliki waktu retensi dominan pada menit 3.916-4 (myricetin) dan 7.916 (luteolin). Klon C memiliki waktu retensi dominan pada menit 17.08-17.58, yang merupakan senyawa waktu retensi dari senyawa kaempferol. Senyawa-senyawa tersebut merupakan senyawa marker bagi klon terkait. Waktu retensi selain yang dipaparkan merupakan noise dari data spektrum yang digunakan dalam analisis.
Gambar 23 (a) Score SP dan (b) Loading SP PLS-DA dari spektrum HPLC torbangun klon A, B, dan C dengan metode hidrolisis flavonol. Ket: Notasi 1234 (setelah notasi klon) pada score SP merupakan ulangan yang
dilakukan.
Notasi pada loading SP merupakan waktu retensi. Waktu retensi dengan tanda panah menunjukkan senyawa marker dari sampel yang paling dekat. UP: Unknown Peak
Gambar 24 (a) Score SP dan (b) Loading SP PLS-DA dari spektrum HPLC torbangun klon A, B, dan C dengan metode hidrolisis flavon. Ket: Notasi 1234 (setelah notasi klon) pada score SP merupakan ulangan yang
dilakukan.
Notasi pada loading SP merupakan waktu retensi. Waktu retensi dengan tanda panah menunjukkan senyawa marker dari sampel yang paling dekat. UP: Unknown Peak