REARING OF TRANSGENIC Kappaphycus alvarezii EXPLANT AND GENE EXPRESSION ANALYSIS
5.2.3 Analisis Ekspresi Gen κ Carrageenase dengan q-PCR
Ekstraksi RNA total
RNA total diekstraksi dengan menggunakan TRIzol® Reagent (Invitrogen USA). Dua tunas transgenik dan satu tunas non-transforman (kontrol) diambil sebagai sampel, sebanyak 10-25 mg per sampel tunas. Sampel digerus dalam nitrogen cair sampai halus, kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml yang berisi 800 l trizol reagent dan diinkubasi dalam suhu ruang selama 5 menit agar sampel dapat terlisis sempurna. Sampel ditambahkan dengan β00 l kloroform kemudian dihomogenisasi dengan vorteks dan dibiarkan pada suhu ruang selama 2-3 menit. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm suhu 4 °C selama 10 menit, kemudian supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung mikro baru yang telah berisi dengan 500 L iso-propanol. Sampel dihomogenkan dengan membolak-balikkan tabung mikro secara perlahan kemudian disimpan dalam suhu ruangan selama 5-10 menit. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm suhu 4 °C selama 10 menit. Supernatan dibuang, sedangkan pelet dilarutkan dalam 500 l etanol 70% dingin dan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm suhu 4 °C selama 5 menit. Supernatan dibuang, dan selanjutnya pelet dalam tabung mikro dikering-udarakan menggunakan vacum dryer. Pelet RNA dilarutkan dengan DEPC water 0,1%, kemudian disimpan dalam oven 55-57 °C selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan pengecekan pita RNA dengan elektroforesis. Sebanyak 50 l RNA total digunakan untuk menyintesis cDNA.
Síntesis cDNA dengan RT-PCR
Sampel RNA terlebih dahulu dibersihkan dari sisa-sisa DNA dengan
menambahkan 1,γ l reaksi DNase (DNase, buffer DNase), kemudian didenaturasi pada suhu 25 °C selama 5 menit. Selanjutnya di tambahkan EDTA 1 l dan didenaturasi lagi pada suhu 65 °C selama 10 menit, kemudian disimpan di atas es selama 5 menit. Sintesis DNA komplementer (complementary DNA, cDNA) dilakukan dengan menggunakan IscriptTM cDNA synthesis kit (BIORAD
31
USA) dengan teknik reverse transcriptase PCR (RT-PCR). Cetakan RNA sebanyak 5 l ditambahkan 5x Iscript mix 2 l, Iscript-RT 0,5 l dan nuclease free water 2,5 l sehingga volume akhir menjadi 10 l. Program PCR dilakukan pada suhu 25 °C selama 5 menit, 42 °C selama 30 menit, 85 °C selama 5 menit, hold pada suhu 4 °C. Hasil cDNA diambil sebanyak 2 l untuk dikuantifikasi konsentrasinya menggunakan mesin Nanodrop-2000 (Thermo scientific).
Kuantifikasi Ekspresi Gen dengan qPCR
Kuantifikasi tingkat ekspresi gen κ-Carrageenase (κ-Car) pada rumput laut Kappaphycus alvarezii transgenik dilakukan dengan quantitative polymerase chain reaction (qPCR). cDNA gen κ-Car diamplifikasi dengan primer spesifik κ- Car-F 5’-CCA CTT GCC ATT CGA CCC AAGA-γ’ dan κ-Car-R 5’-CAC CAA CGA TTT CAC CGT CAA CG-γ’. Primer spesifik κ-Car didesain berdasarkan sekuen κ-Car dengan posisi sekuen ke 630 untuk forward dan sekuen ke 705 untuk reverse, sehingga target fragmen sekitar 98 bp. Gen aktin digunakan sebagai kontrol internal dengan primer Actin-F 5’-CCG TCC CGA TTT ACG AGG GTTA-γ’ dan Actin-R 5’-GCA TGA GGA GCT TCG CCA TCC-γ’. Primer spesifik Actin didesain berdasarkan sekuen Actin K. alvarezii (kode akses bank gen JQ013141.1) dengan posisi sekuen ke 247 untuk forward dan sekuen ke 325 untuk reverse, sehingga target fragmen sekitar 99 bp.
Analisis q-PCR dilakukan menggunakan mesin NANOBIOSYS UltraFast Real Time PCR G2-4 dan SYBR Green Real Time PCR Kit (NANOBIOSYS Korea). Komposisi reaksi qPCR untuk masing-masing pasangan primer (κ-Car dan Actin) yaitu 1 µl cDNA konsentrasi 75 ng/µl, 0,25 µl primer forward dan reverse konsentrasi 10 pmol/µl, 5 µl SYBR Green dan nuclease free water 3,5 µl, sehingga total volume menjadi 10 µl. Program qPCR yang digunakan sama untuk primer κ-Car dan Actin, yaitu pradenaturasi pada 95 °C selama 3 menit, denaturasi pada 94 °C selama 10 detik, penempelan primer dan elongasi pada 55 °C selama 40 detik. Amplifikasi diulang sebanyak 40 siklus.
Kuantifikasi tingkat ekspresi gen target dilakukan berdasarkan rasio ekspresi cDNA gen κ-Car sebagai gen target terhadap ekspresi gen Actin K. alvarezii sebagai kontrol internal jumlah mRNA digunakan dalam sintesis cDNA (Pfaffl, 2004). Perhitungan rasio ekspresi gen dilakukan dengan membandingkan nilai Cт (Cycle of Threshold) dari ekspresi gen κ-Car dan gen Actin.
5.3 Hasil dan Pembahasan
5.3.1 Pemeliharaan Lanjut Eksplan/Tunas K. alvarezii Transgenik
Hasil pemeliharaan eksplan/tunas pada wadah pembesaran semi steril, menunjukkan pertambahan ukuran panjang tunas dan jumlah tunas baru, seperti disajikan pada Tabel 3 danGambar 16. Pertumbuhan panjang telah mencapai 18 mm pada beberapa tunas, sedangkan jumlah tunas telah tumbuh 3-4 tunas baru pada beberapa eksplan. Hasil ini menunjukkan bahwa perkembangan eksplan telah mengalami pertumbuhan yang lebih baik dibandingkan pada wadah pemeliharaan steril pada botol kultur volume 200 ml dengan penggoyangan pada penelitian tahap sebelumnya (Gambar 14 dan Tabel 2).
32
Pertambahan ukuran panjang dan jumlah tunas baru dari eksplan transgenik dan kandidat transgenik pada pemeliharaan semi-steril ini, menunjukkan hasil yang relatif sama dengan eksplan pada non-transgenik sebagai kontrol (Tabel 3). Demikian pula, selama proses pembesaran secara semi steril, terjadi mortalitas pada beberapa eksplan-tunas, baik pada eksplan transgenik maupun pada eksplan non-transgenik.
Tabel 3 Pertumbuhan panjang tunas dan jumlah tunas pada eksplan transgenik, kandidat transgenik dan kontrol hasil pemeliharaan pada kultur pembesaran secara semi-steril
Jenis eksplan Jumlah eksplan Jumlah
tunas/eksplan Panjang tunas (mm) Awal Akhir Kontrol 14 6 2-3 5-15 Transgenik-1 (T1) 1 1 2 1. 10 (T1) 2. 12 * Transgenik-2 (T2) 1 1 2 1. 10 (T2) 2. 7 * Kandidat transgenik lainnya 14 5 2-4 5-18 *
Keterangan : * belum dianalisis PCR
Jumlah eksplan awal yang dipelihara pada pembesaran secara semi steril untuk transgenik sebanyak dua eksplan dan kandidat transgenik sebanyak 14 eksplan dan kontrol non-transgenik sebanyak 14 eksplan. Sampai dengan dilakukannya analisis ekspresi gen, jumlah eksplan yang masih hidup untuk transgenik sebanyak dua eksplan, dan kandidat transgenik sebanyak 5 eksplan, sedangkan kontrol non-transgenik sebanyak enam eksplan (Tabel 3). Dengan demikian, sintasan eksplan pada pemeliharaan pembesaran semi-steril, untuk eksplan transgenik sebesar 100%, dan eksplan kandidat transgenik sebesar 36%, sedangkan pada eksplan non-transgenik sebesar 43%.
Gambar 16 Morfologi perkembangan tunas Kappaphycus alvarezii pada wadah pembesaran semi steril di botol kerucut volume 1500 ml dengan aerasi: 2 tunas (A), 3 tunas (B) dan 4 tunas (C)
33
Hal ini menunjukkan bahwa penyebab terjadinya mortalitas hanya karena faktor kemampuan adaptasi eksplan pada kondisi media pemeliharaan semi-steril, dan bukan pengaruh dari perlakuan transfer gen.
Pertumbuhan tunas yang masih relatif lambat pada wadah pembesaran semi steril dibandingkan pertumbuhan di alam, hal ini disebabkan karena masih kurang sempurnahnya pergerakan eksplan pada wadah pemeliharaan. Pergerakan eksplan adalah salah satu faktor utama yang dapat menyebabkan percepatan daya tumbuh terhambat. Secara umum tumbuhan laut Eucheuma di alam mendapatkan pertumbuhan terbaiknya dalam air yang bergerak (Neish 2005b). Pergerakan air dan gaya/kekuatan hidroliknya merangsang pertumbuhan rumput laut, juga menyingkirkan sisa-sisa metabolisme, membersihkan tanaman, dan menghadirkan nutrisi yang baru. Pada batas-batas ketahanan bibit, bahwa pergerakan air yang cepat juga mempercepat pertumbuhan. Dalam air yang mengalir cepat tanaman Kappaphycus dapat tumbuh sampai mencapai panjang dua meter dan percabangan utamanya lebih dari 2 cm (Neish 2005b).