Upaya peningkatan kandungan kappa( )-karagenan pada rumput laut Kappaphycus alvarezii dapat dilakukan salah satunya dengan teknologi transgenesis. Gen target yang ditransformasi pada penelitian ini adalah gen kappa(κ)-Carrageenase, dimana gen ini menyandikan enzim yang berperan dalam sintesis κ-karagenan. Rumput laut K. alvarezii transgenik dapat mengekspresikan gen κ-Carrageenase sehingga memiliki kandungan karagenan lebih tinggi (over ekspresi). Kebaruan dari penelitian ini adalah menghasilkan rumput laut Kappaphycus alvarezii transgenik yang mengekspresikan gen κ-Carrageenase dalam rangka perakitan rumput laut Kappaphycus alvarezii yang kandungan κ- karagenannya lebih tinggi.
Teknologi transfer gen (transgenesis) telah dikembangkan sebagai pendukung upaya yang sudah ada untuk meningkatkan kualitas dari karakter yang diinginkan pada rumput laut K. alvarezii. Prosedur transgenesis dimulai dengan melakukan identifikasi dan persiapan gen target, menemukan kesesuaian metode transfer dan promoter, serta melakukan deteksi dan pemantauan organisme transgenik (Khoo 2000). Organisme yang telah mengandung gen asing atau gen homolog yang dimasukkan secara buatan disebut transgenik (Dunham 2004). Manfaat lain dari transfer DNA (gen) asing dari luar ke inang merupakan strategi yang baik dalam mempelajari regulasi dari ekspresi gen secara in vivo (Volckaert et al. 1994).
Tahap pertama dalam penelitian ini, adalah pembuatan vektor ekspresi gen dan penyediaan bakteri transforman sebagai kendaraan/biotransport (Muladno 2002). Gen κ-Carrageenase (sekitar 1300 bp) dikonstruksi pada vektor pMSH (pMSH/κ-Car) dikendalikan oleh promoter 35S CaMV (sekitar 300 bp) di bagian depan dan terminator Nos (tNos; sekitar 400 bp) di bagian left border, sehingga total ukuran dari promoter 35S, gen κ-Car, sampai dengan tNos adalah sekitar 2.000 bp. Kesuksesan transformasi pMSH/κ-Car ke Escherchia coli DH5α (vektor kloning) dan ke Agrobacterium tumefaciens (agen transformasi), dibuktikan hasil uji pada media selektif menunjukkan koloni bakteri transforman dapat tumbuh pada media selektif, sedangkan koloni non transforman tidak dapat tumbuh. Kemampuan koloni bakteri untuk tumbuh pada media selektif menunjukkan bahwa bakteri tersebut mengandung pMSH/κ-Car (bakteri transforman). Hal tersebut sejalan dengan Muladno (2002); Tsen et al. (2002), dan Tu et al. (2005) bahwa apabila sel bakteri transforman yang membawa DNA rekombinan (DNA plasmid dan gen insersi) ditumbuhkan pada media dengan antibiotik marka seleksi, akan mampu berkembang biak membentuk koloni, sebaliknya sel bakteri yang tidak membawa plasmid gen insersi akan mati. Hasil uji dengan PCR koloni E. coli maupun A. tumefaciens transforman menggunakan primer 35S-Forward dan Tnos-Reverse menghasilkan fragmen sekitar 2.000 bp, sesuai ukuran mulai 35S, gen κ-Carrageenase, sampai tNos. Hal ini menunjukkan transformasi gen κ-Carrageenase (pMSH/κ-Car) ke biotranspor E. coli dan A. tumefaciens telah berhasil dilakukan dan siap digunakan lebih lanjut untuk transformasi pada K. alvarezii.
Tahap kedua pada penelitian ini adalah transformasi gen κ-Car ke rumput laut K. alvarezii menggunakan metode mediasi Agrobacterium tumefaciens yang membawa pMSH/κ-Car. Eksplan hasil transformasi dipelihara sampai keluarnya
37
tunas-tunas baru, dilakukan secara steril menggunakan botol kultur volume 200 ml dengan penggoyangan. Persentase eksplan hidup pascatransformasi sebesar 36% dan bertunas 88,9%, lebih tinggi dari penelitian-penelitian sebelumnya. Dari eksplan yang hidup dan bertunas, telah disampling dua tunas untuk analisis PCR. Hasil PCR dan amplifikasi DNA K. alvarezii menggunakan primer 35S-F dan tNos-R, menunjukkan produk PCR sekitar 2.000 bp pada K. alvarezii transgenik, sedangkan pada kontrol (non-transforman) tidak ada produk amplifikasi. Ukuran produk PCR tersebut sama dengan ukuran pMSH/κ-Car sebagai kontrol positif. Konfirmasi lebih lanjut, analisis PCR dilakukan menggunakan primer 35S-F dan 35S-R, menunjukkan hasil amplifikasi berukuran sekitar 300 bp pada K. alvarezii transgenik. Ukuran produk PCR tersebut sama dengan ukuran promoter 35S. Kedua hasil PCR tersebut mengindikasikan kesuksesan transformasi gen κ-Car ke K. alvarezii. Dua sampel tunas yang di PCR tersebut semuanya (100%) transgenik (T1 dan T2). Sementara itu, Handayani et al. (2014) melaporkan tiga dari enam putatif transforman (50%) positif PCR, dan Fajriah et al. (2014) melaporkan 13 dari 135 putatif transforman (9,63%) positif PCR.
Tahap ketiga penelitian ini adalah pemeliharaan lanjut eksplan/tunas K. alvarezii transgenik secara semi steril dan analisis tingkat ekspresi gen κ-Car.
Hasil pemeliharaan lanjut menunjukkan sintasan eksplan K. alvarezii transgenik sebesar 100%, eksplan kandidat transgenik lainnya sebesar 36%, dan kontrol sebesar 43%, dengan jumlah tunas 2-4 per eksplan dan panjang tunas 5-18 mm.
Selama proses pemeliharaan lanjut secara semi steril, terjadi mortalitas pada beberapa eksplan-tunas kandidat transgenik maupun pada eksplan non-transgenik (kontrol). Hal ini menunjukkan bahwa penyebab terjadinya mortalitas hanya karena faktor kemampuan adaptasi eksplan pada kondisi media pemeliharaan semi steril, dan bukan pengaruh dari perlakuan transfer gen. Pertambahan ukuran panjang serta jumlah tunas baru dari eksplan transgenik dan kandidat transgenik, menunjukkan hasil yang relatif sama dengan eksplan non-transgenik sebagai kontrol.
Analisis PCR cDNA menggunakan pasangan primer gen κ-Car-F dan κ- Car-R, menghasilkan amplifikasi berukuran sekitar 98 bp, sama dengan ukuran fragmen pada plasmid pMSH/κ-Car sebagai kontrol positif. Kontrol internal menggunakan pasangan primer gen Actin-F dan Actin-R, menunjukkan hasil amplifikasi dengan ukuran sekitar 99 bp pada non-transgenik (NT) maupun pada transgenik (T1 dan T2), sesuai target amplifikasi primer. Hasil analisis ekspresi menunjukkan Kappaphycus alvarezii transgenik menghasilkan tingkat ekspresi gen κ-Carrageenase yang relatif sama, yang dinormalisasi dengan gen Actin dengan rasio masing-masing untuk transgenik T1 sebesar 0,983 dan transgenik T2 sebesar 0,962.
Hasil ini juga menunjukkan bahwa peran promoter CaMV 35S merupakan bagian penting dalam mengaktifkan gen κ-Carrageenase pada rumput laut K. alvarezii. Hasil penelitian Rajamuddin et al. (2014) menunjukkan promoter CaMV 35S dapat bekerja mengaktifkan gen pada rumput laut K. alvarezii. Promoter ini merupakan promoter konstitutif dan bisa aktif di semua organ. Hasil penelitian Rogers et al. (1985) menunjukkan peningkatan ekspresi gen sampai 40 kali dengan menggunakan promoter 35S. Selanjutnya, hasil analisis ekspresi ini menunjukkan potensi besar dalam meningkatkan kandungan karagenan rumput laut K. alvarezii dengan transfer gen yang menyandikan enzim κ-Carrageenase.
38
Hasil penelitian tahap pertama sampai tahap ketiga yang telah dilaksanakan menunjukkan bahwa peluang besar peningkatan kandungan κ-karagenan dapat tercapai, pada rumput laut K. alvarezii dengan transfer gen κ-Car. Untuk mencapai tujuan akhir perakitan K. alvarezii transgenik tersebut, tahap regenerasi dan perkembangbiakan eksplan-tunas transgenik masih perlu dilakukan, untuk mendapatkan talus K. alvarezii yang lebih banyak dan generasi stabil.
Transformasi gen menggunakan jaringan rumput laut seperti eksplan, menunjukkan pertumbuhan eksplan pada skala laboratorium relatif lambat, sehingga diperlukan modifikasi pemeliharaan yang lebih mendekati keadaan umum syarat pertumbuhan K. alvarezii di alam. Strategi lain yang dapat dilakukan agar regenerasi dan pertumbuhan rumput laut transgenik lebih cepat yaitu transformasi gen dilakukan pada fase embrio somatik hasil induksi kalus. Regenerasi embrio somatik menjadi mikropropagul dan menjadi planlet (rumput laut muda) relatif lebih cepat dibandingkan regenerasi jaringan dewasa seperti eksplan (Sulistiani et al. 2011).
Merujuk pada perkembangan produk transgenik pada komoditas tanaman, maka peluang pengembangan komoditas perikanan transgenik di Indonesia juga berpotensi untuk dikembangkan, termasuk pada rumput laut K. alvarezii. Serangan penyakit ice-ice akibat kondisi lingkungan yang labil, merupakan salah satu permasalahan pada budidaya K. alvarezii, yang dapat diatasi melalui perbaikan kualitas genetik dengan transgenesis.
Aplikasi transgenesis pada rumput laut (alga) sudah mulai dikembangkan dan telah memperlihatkan potensi yang besar di masa mendatang (Hallmann 2007; Walker et al. 2005). Penelitian transgenesis pada rumput laut Kappaphycus alvarezii menggunakan metode mediasi Agrobacterium tumefaciens juga telah sukses dilakukan (Fajriah et al. 2014; Handayani et al. 2014; Daud et al. 2013).
Regulasi yang mengatur tentang syarat rilis dan peredaran produk transgenik di Indonesia juga telah diatur dengan Peraturan Presiden Republik Indonesia Nomor 39 tahun 2010 dan diperbaharui menjadi Peraturan Presiden No. 53 tahun 2014 tentang Komisi Keamanan Hayati Produk Rekasaya Genetik (KKH-PRG). Dengan kekhasan pada rumput laut, maka beberapa penyesuaian diperlukan agar memenuhi syarat yang ada dalam peraturan tersebut.
39
7
SIMPULAN UMUM DAN SARAN
7.1Simpulan Umum
Konstruksi gen κ-Carrageenase berupa plasmid biner pMSH/κ-Car telah berhasil dibuat dan Agrobacterium tumefaciens yang membawa konstruksi gen tersebut telah berhasil diperoleh.
Gen κ-Carrageenase telah berhasil ditransformasi ke rumput laut Kappaphycus alvarezii menggunakan metode mediasi Agrobacterium tumefaciens. Persentase eksplan hidup pascatransformasi sebesar 36% dan bertunas sebesar 88,9%, dengan persentase transgenik sebesar 100%.
Sintasan eksplan K. alvarezii pada pemeliharaan lanjut, untuk transgenik sebesar 100%, eksplan kandidat transgenik lainnya sebesar 36%, dan kontrol sebesar 43%, dengan jumlah tunas 2-4 per eksplan dan panjang tunas 5-18 mm.
Analisis ekspresi menggunakan metode qrt-PCR menunjukkan bahwa gen κ- Carrageenase dapat diekspresikan dengan tingkat ekspresi relatif sama pada Kappaphycus alvarezii transgenik yang diuji.
7.2Saran
Diperlukan pemeliharaan eksplan Kappaphycus alvarezii transgenik pada wadah volume 1-2 ton secara terkontrol untuk mendapatkan ukuran talus yang memenuhi ukuran (200-300 gram) untuk analisis kandungan karagenan dan perbanyakan talus transgenik.
Pada pembuatan rumput laut K. alvarezii transgenik, sebaiknya perlakuan transformasi gen target dilakukan pada fase embrio somatik dengan induksi kalus. Hal ini terkait dengan percepatan proses pembesaran dan regenerasi eksplan transgenik.