3. METODOLOGI
3.3. Analisis Fisiko-Kimia
Gambar 6. Diagram alir pembuatan biskuit ( modifikasi Sunaryo, 1985)
3.3. Analisis Fisiko-Kimia
Analisis fisiko-kimia yang dilakukan meliputi analisis pada ikan pepetek, tepung ikan pepetek, tepung ubi jalar putih, tepung terigu dan biskuit. Analisis yang dilakukan pada ikan pepetek adalah analisis proksimat yang meliputi kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak dan kadar karbohidrat
Mixing II selama 10 menit
Pemanggangan dalam oven suhu 120 oC
selama 30 menit Adonan kalis
Pencetakan pada loyang
Biskuit Mixing I Pembentukan krim selama 15 menit Mixing III selama 10 menit Dalam 100 g: Kuning telur 0,6 g Gula halus 20,8 g Margarin 16,1 g Dalam 100 g:
Susu full cream 2,4 g Garam 0,8 g
Baking powder 1 g Vanili 1 g
Tepung terigu Tepung ikan pepetek Tepung ubi jalar putih
Formulasi B0 Formulasi B1 Formulasi B2 Formulasi B3 Formulasi B4 Air 17,8 ml
(by difference). Analisis pada tepung ikan pepetek dan tepung ubi jalar putih antara lain: analisis proksimat, kadar kalsium, derajat putih (whiteness) dan rendemen. Sedangkan analisis pada tepung terigu, yaitu analisis derajat putih, analisis proksimat dan analisis kalsium.
Sedangkan analisis fisiko-kimia pada biskuit, yaitu analisis kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, kadar karbohidrat (by difference), pH, kadar kalsium, bioavailabilitas kalsium, daya cerna protein secara in vitro, kekerasan dan organoleptik berupa uji hedonik meliputi parameter penampakan, warna, tekstur, aroma dan rasa.
3.3.1. Analisis Fisik
Analisis fisik dilakukan pada tepung ikan pepetek, tepung ubi jalar putih dan tepung terigu serta terhadap biskuit. Analisis terhadap ketiga tepung tersebut adalah analisis derajat putih. Sedangkan analisis rendemen hanya dihitung pada tepung ikan pepetek dan tepung ubi jalar putih. Analisis fisik yang dilakukan terhadap biskuit adalah analisis kekerasan.
3.3.1.1. Derajat putih
Pengujian derajat putih dapat dilakukan dengan menggunakan alat Whitenessmeter. Alat Whitenessmeter menggunakan natrium karbonat (Na2CO3) sebagai standar putih. Standar putih ini bernilai seratus.
Produk yang akan diukur derajat putihnya dicari warna dasarnya terlebih dahulu dengan cara mencocokkan warna sampel dengan atribut warna pada alat. Setelah diketahui, kemudian nilainya dibandingkan dengan warna standar putih. Semakin tinggi skala yang diperoleh maka warna yang diperoleh semakin mendekati standar.
3.3.1.2. Rendemen
Rendemen tepung ikan pepetek dan tepung ubi jalar putih dihitung dengan menggunakan timbangan analitik. Rendemen dihitung dengan membandingkan berat tepung yang dihasilkan dengan berat bahan baku masing-masing. Rendemen tepung ikan pepetek dan tepung ubi jalar dihitung dengan menggunakan perhitungan sebagai berikut :
% Rendemen = x100% utuh pepetek ikan Berat pepetek ikan tepung Berat % Rendemen = x100% utuh putih jalar ubi Berat putih jalar ubi tepung Berat 3.3.1.3. Kekerasan
Kekerasan biskuit diukur menggunakan alat Rheoner RE-3305 merk Yamaden. Kondisi operasi alat adalah load scale: 2000 g, table: 0,5 mm/s, chart speed: 80 mm/min, jarak penekanan: 1000 x 0,01 mm, ukuran probe: no. 5 (diameter 5 mm), beban yang digunakan adalah 500 g pada skala penuh. Gambar alat dapat dilihat pada lampiran 32.
Pertama, alat dinyalakan, kemudian sampel diletakkan dalam ruang dari sel Kramer, setelah itu bagian tersebut akan mendapat tekanan (pengepresan, penggesekan dan penghancuran) dari probe yang bergerak dengan kecepatan
konstan sepanjang produk melalui lubang yang ada di bawah pisau. Satu milimeter lebar kurva sepanjang kertas (chart) adalah sama dengan seberapa
dalam mata pisau berpenetrasi ke dalam produk. Ketinggian kurva menunjukkan besarnya gaya yang diperlukan untuk deformasi. Nilai resistensi atau kekerasan akan terbaca dalam recorder dan keluarannya berupa grafik.
3.3.2. Analisis Kimia
Analisis kimia dilakukan terhadap ikan pepetek, tepung ikan pepetek, tepung ubi jalar putih, tepung terigu dan biskuit. Analisis kimia terhadap ikan pepetek adalah analisis proksimat yang meliputi kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak dan kadar karbohidrat (by difference). Analisis kimia pada ketiga tepung tersebut meliputi analisis proksimat dan analisis kalsium. Sedangkan analisis kimia pada biskuit adalah analisis proksimat, analisis kalsium, analisis derajat keasaman (pH), bioavailabilitas kalsium dan daya cerna protein secara in vitro.
3.3.2.1. Kadar air (AOAC, 1995)
Prosedur penentuan kadar air dengan menggunakan metode pemanasan langsung. Sebanyak 2,5 gram sampel ditimbang dalam cawan yang bobotnya konstan dan dipanaskan dalam oven pada suhu 105 oC selama tiga jam. Setelah itu dikeluarkan dari oven dan didinginkan dalam desikator. Kemudian dilakukan penimbangan cawan beserta sampel yang telah dingin tersebut.
Kadar air (%) = 100% ) ( ) ( 1 2 3 2 x W W W W − − Keterangan:
W1 = Berat cawan kosong (gram)
W2 = Berat (cawan + sampel ) sebelum dikeringkan (gram) W3 = Berat (cawan + sampel) setelah dikeringkan (gram)
3.3.2.2. Kadar abu (AOAC, 1995)
Penentuan kadar abu dilakukan dengan menggunakan metode pemanasan langsung. Sebanyak 2,5 gram sampel ditimbang dalam cawan yang bobotnya konstan, sampel dibakar di atas bunsen dengan api kecil sampai tidak berasap. Kemudian dimasukan ke dalam tanur pada suhu 550 oC sampai menjadi abu. Cawan yang berisi abu didinginkan dalam desikator selama 15 menit, kemudian ditimbang hingga diperoleh bobot konstan.
Kadar abu (%) = 100% 1 2 1 3 x W W W W − − Keterangan:
W1 = Berat cawan kosong (gram)
W2 = Berat (cawan + sampel) sebelum dikeringkan (gram) W3 = Berat (cawan + sampel) setelah diabukan (gram)
3.3.2.3. Kadar protein (AOAC, 1995)
Penentuan kadar protein mengunakan metode Nitrogen Mikro Kjeldahl. Sampel sebanyak 0,5 – 3 gram dimasukan ke dalam labu kjeldahl dan didestruksi dengan menggunakan 20 ml asam sulfat pekat (H2SO4) dengan pemanasan sampai terjadi larutan berwarna jernih. Larutan hasil destruksi diencerkan dan didestilasi
dengan penambahan 10 ml NaOH 10 %. Destilat ditampung dalam 25 ml larutan H3BO3 3 %. Larutan H3BO3 ditritasi dengan larutan HCl standar dengan menggunakan merah metil sebagai indikator. Dari hasil titrasi ini total nitrogen dapat diketahui. Kadar protein sampel bahan dihitung dengan mengalikan total nitrogen dan faktor konversi.
% Total Nitrogen (N) = sampel berat x x HCl N x titran ml 14 100 Keterangan:
Kadar protein (%) = % N x faktor konversi (6,25), untuk ikan, ubi jalar Kadar protein (%) = % N x faktor konversi (5,7), untuk biskuit, terigu
3.3.2.4. Kadar lemak (AOAC, 1995)
Labu lemak yang ukurannya sesuai dengan alat ekstraksi soxhlet yang akan digunakan dikeringkan dalam oven. Kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang.
Sebanyak lima gram sampel dalam bentuk tepung ditimbang langsung dalam kertas saring yang sesuai ukurannya, kemudian ditutup dengan kapas wool bebas lemak. Kertas saring yang berisi sampel tersebut diletakkan dalam alat ekstraksi soxhlet, kemudian dipasang alat kondensor di atasnya dan labu lemak di bawahnya.Pelarut dietil eter dituangkan ke dalam labu lemak secukupnya sesuai dengan ukuran yang digunakan. Refluks dilakukan minimum lima jam sampai pelarut yang turun kembali ke labu lemak berwarna jernih.
Destilasi pelarut yang ada di dalam labu lemak, ditampung pelarutnya selanjutnya labu lemak yang berisi hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 105 oC. Setelah dikeringkan sampai berat tetap dan didinginkan dalam desikator, ditimbang labu beserta lemak tersebut.
Kadar lemak % = 100% ) ( ) ( x gram sampel berat gram lemak berat
3.3.2.5. Kadar Karbohidrat (Winarno, 1997)
Analisis kadar karbohidrat dilakukan secara by difference, yaitu dengan menggunakan rumus:
Kadar Karbohidrat = 100 % - (K. Air + K. Lemak + K. Abu + K. Protein)
3.3.2.6. Uji Kalsium Metode AAS (Apriyantono et al., 1989)
Sampel yang mengandung 5-10 gram padatan ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu kjeldahl. Ditambahkan 10 ml H2SO4 pekat dan 10 ml HNO3, didiamkan semalam (16 jam). Kemudian dipanaskan perlahan-lahan sampai larutan jernih dan semua asap sudah tidak tertinggal. Ditambahkan 10 ml aquades (larutan akan menjadi tidak berwarna atau menjadi kuning muda jika mengandung Fe) dan dipanaskan kembali sampai berasap. Larutan didiamkan kembali sampai dingin kemudian ditambahkan 5 ml aquades, dididihkan sampai berasap. Setelah dingin diencerkan sampai volume tertentu (aliquot, 100 ml). Kemudian disaring dengan kertas saring Whatman 42 dan dibaca dengan nyala atomasi AAS (Atomic Absorbance Spectrophotometer) pada λ = 422,7 nm.
sampel mg x blanko ppm sampel ppm x Fp x aliquaot ml Ca ( /1000) ( ) 100% % = − Keterangan: Ca (mg/100g) = % Ca x 1000 Fp = Faktor pengenceran
3.3.2.7. Analisis bioavailabilitas kalsium
Semua peralatan gelas dicuci, direndam dalam larutan HNO3 10% (v/v) selama 24 jam, dan dibilas dengan air bebas ion sebelum digunakan. Sejumlah sampel (setara dengan 2 g protein) ditimbang kemudian dihomogenisasi. Nilai pH sampel diatur menjadi dua dengan menambahkan HCl 6 N. Jumlah HCl yang ditambahkan dihitung.
Kemudian pH sampel diatur menjadi 2,0 dengan menambahkan HCl 6 N pada sampel (sama dengan 2 g protein) dan 80 g air bebas ion yang ditempatkan dalam tabung erlenmeyer berukuran 250 ml. Sebanyak 40 g aliquot sampel dipindahkan kedalam botol gelas untuk penentuan keasaman titrasi, 40 g aliquot
sampel dipindahkan ke dalam botol gelas lain untuk penentuan persen kalsium yang terdialisis (tersedia) dan 10 g untuk penentuan kadar kalsium total dengan menggunakan Atomic Absorbance Spectrophotometer (AAS).
Sebanyak 3 g larutan suspensi pepsin (1,6 g pepsin Sigma p-7000 didispersikan ke dalam 0,1 M HCl dan ditepatkan volumenya menjadi 10 ml, dibuat sewaktu akan digunakan), ditambahkan masing-masing ke dalam botol gelas dan volumenya ditepatkan menjadi 100 ml dengan air. Keduanya kemudian ditutup dengan plastik yang berlubang untuk mengeluarkan gas. Sampel diinkubasi dalam penangas air bergoyang pada suhu 30 oC dengan kecepatan 5 (120 stroke/menit) selama dua jam. Selanjutnya botol-botol tersebut disimpan dalam freezer untuk digunakan pada hari berikutnya. Sebelum digunakan sampel harus dicairkan terlebih dahulu. Sebanyak lima gram campuran pankreatin bile ditambahkan ke dalam botol gelas yang telah berisi 40 g aliquot yang digunakan untuk penentuan asam tertitrasi. Larutan ini kemudian dititrasi dengan 0,5 NaOH sampai diperoleh pH 7,5. Nilai pH ini dicek setelah 30 menit.
Sebanyak 40 g aliquot sampel dipindahkan ke dalam botol gelas yang berukuran 250 ml. Selanjutnya NaHCO3 dengan konsentrasi yang diperoleh dari hasil titrasi dengan NaOH di atas (jumlah NaHCO3 ekuivalen dengan jumlah NaOH yang digunakan untuk titrasi) dimasukkan ke dalam kantung dialisis bersama 25 g air. Botol gelas yang digunakan untuk penentuan persen yang tersedia ditempatkan dalam penangas air yang bergoyang pada suhu 37 oC dan kecepatan 5 hingga mencair. Kemudian kantung dialisis dimasukkan ke dalam setiap botol gelas dengan kedudukan sedemikian rupa sehingga kantung dialisis terendam dalam larutan sampel, ditutup dengan plastik yang telah disiapkan. Inkubasi dilakukan sampai pH 5 selama 30 menit. Setelah itu ditambahkan 5 g campuran pankreatin bile ke dalam setiap botol gelas tadi dan inkubasi dilanjutkan selama dua jam.
Setelah cukup waktu, kantung dialisis diangkat dan dibilas dengan mencelupkannya ke dalam air bebas ion. Salah satu ujungnya dipotong dengan menggunakan gunting dan isinya (dialisat) dituang ke dalam gelas ukur untuk dihitung volumenya dan dianalisis kandungan kalsium yang tersedia dengan menggunakan AAS.
Perhitungan :
3.3.2.8. Daya cerna protein in vitro
Analisis daya cerna protein in vitro yang digunakan sebagai berikut: sampel ditimbang sebanding dengan 0,2 g protein (0,2 x 100 / kadar protein sampel), kemudian dimasukkan ke dalam tabung fermentor. Ditambahkan 25 ml HCl 0,1 N dengan pH 1,5 yang mengandung pepsin 0,1 g. Kemudian diinkubasi dalam penangas air bergoyang dengan suhu 37 oC selama satu jam. Setelah itu, pH dinaikkan menjadi 7,5 dan ditambahkan pankreatin sejumlah 0,1 g dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Kemudian disaring dengan pompa vakum menggunakan kertas saring. Setelah itu, dibilas dengan air bersih dan dikeringkan.
Perhitungan: sampel protein mg x tercerna tidak protein mg sampel protein mg protein cerna Daya (%)=( − ) 100%