3 METODE
3.4 Analisis
Analisis-analisis dalam penelitian ini dilakukan untuk mengamati karakteristik kimia yang meliputi analisis proksimat dan uji stabilitas produk, uji mikrobiologi, mutu organoleptik, uji kandungan vitamin C dan uji asam amino pada produk serbuk minuman, dan uji aktivitas antioksidan dari bahan baku dan produk jadi.
3.4.1 Analisis proksimat (AOAC 2005) (a) Kadar air
Penentuan kadar air didasarkan pada berat contoh sebelum dan sesudah dikeringkan. Cawan kosong dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu 105oC, lalu dimasukkan ke dalam desikator selama 15 menit kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 1 gram dimasukkan ke dalam cawan lalu dikeringkan di dalam oven pada suhu 105oC sampai beratnya konstan (kurang lebih selama 6 jam) dan kemudian cawan dimasukkan ke dalam desikator selama 30 menit selanjutnya ditimbang kembali. Kadar air ditentukan dengan rumus:
(b) Analisis kadar abu
Cawan dibersihkan dan dikeringkan di dalam oven selama 30 menit dengan suhu 105oC, lalu dimasukkan dalam desikator kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 5 gram ditimbang lalu dimasukkan ke dalam cawan dan kemudian dibakar di atas kompor listrik sampai tidak berasap lagi dan selanjutnya dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600oC selama 7 jam. Cawan dimasukkan di dalam desikator lalu ditimbang. Kadar abu ditentukan dengan rumus:
(c) Analisis kadar lemak
Analisis kadar lemak dilakukan dengan metode sokhlet. Prosedur analisis kadar lemak sebagai berikut: labu lemak yang akan digunakan dioven selama 30 menit pada suhu 100-105oC, kemudian didinginkan dalam desikator untuk
menghilangkan uap air dan ditimbang (A). Sampel ditimbang sebanyak 2 gram (B) lalu dibungkus dengan kertas saring, ditutup dengan kapas bebas lemak dan dimasukkan ke dalam alat ekstraksi sokhlet yang telah dihubungkan dengan labu lemak yang telah dioven dan diketahui bobotnya. Pelarut heksana atau pelarut lemak lain dituangkan sampai sampel terendam dan dilakukan refluks atau ektraksi lemak selama 5-6 jam atau sampai pelarut lemak yang turun ke labu lemak berwarna jernih. Pelarut lemak yang telah digunakan, disuling dan ditampung setelah itu ekstrak lemak yang ada dalam labu lemak dikeringkan dalam oven bersuhu 100-105oC selama 1 jam, lalu labu lemak didinginkan dalam desikator dan ditimbang (C). Tahap pengeringan labu lemak diulangi sampai diperoleh bobot yang konstan. Kadar lemak dihitung dengan rumus:
(d) Analisis kadar protein
Prinsip analisis kadar protein yaitu untuk mengetahui kandungan protein kasar (crude protein) pada suatu bahan. Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis kadar protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. 1) Tahap destruksi
Sampel seberat 0,5 gram dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl. Satu butir selenium dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 3 mL H2SO4. Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 410°C ditambahkan 10 mL air. Proses destruksi dilakukan sampai larutan menjadi jernih.
2) Tahap destilasi
Larutan yang telah jernih didinginkan dan ditambahkan 50 mL akuades dan 20 mL NaOH 40%, lalu didestilasi. Hasil destilasi ditampung dalam labu Erlenmeyer 125 ml yang berisi 25 mL asam borat (H3BO3) 2% yang mengandung indikator bromcresol green 0,1% dan methyl red 0,1% dengan perbandingan 2:1. Destilasi dilakukan dengan menambahkan 50 mL larutan NaOH-Na2S2O3 ke dalam alat destilasi hingga tertampung 40 mL destilat di dalam labu Erlenmeyer dengan hasil destilat berwarna hijau kebiruan.
3) Tahap titrasi
Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan erlenmeyer berubah menjadi merah muda. Kadar protein ditentukan dengan rumus:
Kadar protein = % N x 6,25
3.4.2 Analisis logam berat Pb, Cd dan Hg (BPOM 2009 dan SNI 2009)
Spektrofotometer serapan atom (AAS) adalah salah satu teknik analisis unsur yang dapat dilakukan dengan cepat serta mempunyai tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Perangkat AAS ini telah terkomputerisasi sehingga seluruh parameter alat, yaitu kuat arus lampu katoda, slit, panjang gelombang, standardisasi, dan sebagainya dapat dilakukan langsung menggunakan program komputer secara otomatis.
Prinsip dasar analisis AAS adalah jika suatu contoh diaspirasikan ke dalam suatu sistem pembakaran, maka unsur-unsur yang ada pada senyawaan akan dikonversi menjadi atom. Apabila pada kondisi ini diberikan suatu energi radiasi yang sesuai, maka energi tersebut akan diserap oleh atom. Besar kecilnya energi yang diserap akan berbanding lurus dengan konsentrasi unsur yang dianalisis.
Analisis dilakukan menggunakan 1 gram contoh, kemudian dimasukkan ke dalam labu destruksi 100 mL, ditambahkan 15 mL HNO3 pekat dan 5 mL HClO4, kemudian didiamkan 24 jam. Selanjutnya sampel didestruksi hingga jernih, didinginkan, dan ditambahkan 10-20 mL air bebas ion, dilakukan pemanasan ±10 menit, diangkat, dan didinginkan. Larutan tersebut dipindahkan ke dalam labu takar 100 mL (labu dekstruksi dibilas dengan air bebas ion dan dimasukkan ke dalam labu takar). Larutan ditambahkan air sampai batas tanda tera, kemudian dikocok dan disaring dengan kertas saring Whatman no.4. Sampel dipreparasi dan dianalisis sesuai dengan pengujian logam berat (Cd, Pb, Hg, Cu, As) pada analisis air (APHA 3110 untuk logam Cd dan Pb dan metode 3112 untuk Hg).
Kadar logam (ppm) =Konsentrasi logam dari kurva rendah (µg/mL) x V pelarutan
3.4.3 Analisis aktivitas antioksidan (DPPH) (Molyneux 2004)
Aktivitas antioksidan yang diukur pada bubuk kering kerang pisau dilakukan dengan menimbang bahan-bahan kering tersebut masing-masing sebanyak 0,25 gram kemudian dilarutkan dalam 50 mL metanol. Larutan yang terbentuk diencerkan lagi untuk mendapatkan konsentrasi 100, 200, 400, dan 800 ppm. Larutan pereaksi DPPH yang digunakan, dibuat dengan melarutkan DPPH seberat 0,0197 gram dalam 50 mL metanol p.a. untuk memperoleh konsentrasi 1 mM. Larutan dibuat segar dan dijaga pada suhu rendah serta terlindung dari cahaya. Sebanyak 4 mL larutan uji direaksikan dengan 1 mL larutan DPPH dalam tabung reaksi. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm. Larutan standar dibuat dengan mencampur 4 mL metanol p.a dengan 1 mL DPPH. Aktivitas antioksidan masing-masing sampel dinyatakan dengan persentase penghambatan radikal bebas yang dihitung dengan rumus:
3.4.4 Uji Sensori
Uji sensori yang dilakukan adalah uji rating dan ranking hedonik terhadap tiga formula minuman fungsional kerang pisau oleh 30 panelis semi terlatih. Parameter mutu yang diuji meliputi warna, kenampakan, aroma, dan rasa minuman fungsional kerang pisau. Pemberian skor pada uji rating hedonik menggunakan sistem skala kategori yaitu sangat tidak suka (1), tidak suka (2), agak tidak suka (3), netral (4), agak suka (5), suka (6), dan sangat suka (7). Dalam uji rangking hedonik, angka satu (1) menyatakan tingkat penerimaan terendah terhadap produk dan angka selanjutya menyatakan penerimaan yang semakin tinggi. Score sheet uji sensori dapat dilihat pada Lampiran 5. Data yang diperoleh ditabulasikan dan dianalisis dengan metode nonparametrik Kruskal-Wallis dan uji lanjut BNT.
Penyajian sampel dilakukan dengan melarutkan masing-masing formula ke dalam gelas yang berisi 90 mL air yang bersuhu 80oC. Gelas berkode dan dalam kondisi hangat disajikan kepada para panelis. Panelis menuliskan kesan atau
tanggapan pribadinya mengenai sampel yang diuji dalam sehelai score sheet. Sebelumnya para panelis diberikan pengarahan mengenai tata cara melakukan pengujian.
3.4.5 Analisis vitamin C (AOAC 2001)
Contoh sebanyak 1 gram dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, ditambahkan 10 mL asam asetat 0,1 % lalu dikocok. Selanjutnya diultrasonik selama 15 menit. Setelah itu dihimpitkan sampai tanda tera dan dihomogenisasi, kemudian disaring dengan Whatman No 42 dan membran 0,45 µm, setelah itu disuntikkan ke HPLC.
Perhitungan vitamin C:
Keterangan:
Csp = konsentrasi contoh, dinyatakan dalam mg/kg Asp = luas area contoh
Slope = kemiringan kurva kalibrasi
Vsp = volume pelarutan sampel, dinyatakan dalam mL Wsp = bobot contoh, dinyatakan dalam g
Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis vitamin C: Merek : Waters Coorporation, USA
Kolom : oktadesilsilana (C18) Laju alir : 0,8 mL/menit
Fase gerak : TFA (Triflouro Acetic Acid) 0,1% Panjang gelombang : 245 nm
3.4.6 Analisis warna (Hutching 1999)
Analisis warna dilakukan dengan menggunakan alat Chromameter Minolta CR-200. Sebelum dilakukan pengukuran nilai L, a, dan b perlu dilakukan kalibrasi terlebih dahulu terhadap alat dengan menggunakan pelat standar warna putih (L=97,51; a=5,35; b=3,37). Setelah proses kalibrasi selesai, dilanjutkan dengan pengukuran warna sampel. Pengukuran dilakukan dengan tiga kali ulangan untuk masing-masing sampel. Sistem warna yang digunakan adalah sistem Lab. Sampel
diletakkan pada tempat yang tersedia, kemudian tombol start ditekan dan akan diperoleh nilai L, a, dan b dari sampel.
Hasil pengukuran dikonversi ke dalam sistem Hunter dengan L menyatakan parameter kecerahan dari hitam (0) sampai putih (100). Notasi a menyatakan warna kromatik campuran merah-hijau dengan nilai + a (positif) dari 0 sampai +100 untuk warna merah dan nilai – a (negatif) dari 0 sampai -80 untuk warna hijau. Notasi b menyatakan warna kromatik campuran biru-kuning dengan nilai + (positif) dari 0 sampai +70 untuk warna kuning dan nilai –b (negatif) dari 0 sampai -80 untuk warna biru, sedangkan L menyatakan kecerahan warna, selanjutnya dari nilai a dan b dapat dihitung ˚Hue yang menunjukkan kisaran warna sampel. Hubungan antara ˚Hue dan warna sampel dapat dilihat pada Tabel 5. Nilai ˚Hue dapat dihitung dengan persamaan :
˚Hue = tan-1
Tabel 5. Hubungan ˚Hue dengan warna sampel
˚Hue Warna Sampel
18˚- 54˚ red (R)
54˚- 90˚ yellow red (YR) 90˚-126˚ yellow (Y)
126˚-162˚ yellow green (YG) 162˚-198˚ green (G) 198˚-234˚ blue green (BG) 234˚-270˚ blue (B) 270˚-306˚ blue purple (BP) 306˚-342˚ purple (P) 342˚- 18˚ red purple (RP)
3.4.7 Analisis asam amino (AOAC 1995)
Komposisi asam amino ditentukan dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Sebelum digunakan, perangkat HPLC harus dibilas dulu dengan eluen yang akan digunakan selama 2-3 jam. Begitu pula dengan syringe yang akan digunakan juga harus dibilas dengan akuades. Analisis asam amino menggunakan HPLC terdiri atas 4 tahap, yaitu (1) tahap pembuatan hidrolisat protein; (2) tahap pengeringan; (3) tahap derivatisasi; dan (4) tahap injeksi serta analisis asam amino. Khusus untuk pengujian asam amino bebas, tidak dilakukan proses hidrolisis dengan asam dan pemanasan.
(a) Tahap pembuatan hidrolisat protein
Tahap preparasi contoh adalah pembuatan hidrolisat protein. Prosedurnya sebagai berikut: contoh ditimbang sebanyak 0,2 g dan dihancurkan. Contoh yang telah hancur ditambahkan dengan HCl 6 N sebanyak 5-10 mL, kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 100ºC selama 24 jam. Hal ini dilakukan untuk menghilangkan gas atau udara yang ada pada contoh agar tidak mengganggu kromatogram yang dihasilkan, selain itu pemanasan dilakukan untuk mempercepat reaksi hidrolisis. Setelah pemanasan selesai, hidrolisat protein disaring dengan milipore berukuran 45 mikron.
(b) Tahap pengeringan
Hasil saringan diambil sebanyak 30 μL larutan pengering. Larutan pengering dibuat dari campuran antara metanol, natrium asetat, dan trietilamim dengan perbandingan 2:2:1. Setelah ditambahkan dengan larutan pengering, dilakukan pengeringan dengan gas nitrogen untuk mempercepat pengeringan dan mencegah oksidasi.
(c) Tahap derivatisasi
Sebanyak 30 μL larutan derivatisasi ditambahkan pada hasil pengeringan. Larutan derivatisasi dibuat dari campuran antara larutan metanol, pikoiotisianat, dan trietilamin dengan perbandingan 3:3:4. Proses derivatisasi dilakukan agar detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada contoh, kemudian dilakukan pengenceran dengan cara menambahkan 10 mL asetonitil 60% atau buffer fosfat 0,1 M lalu dibiarkan selama 20 menit. Hasil pengenceran disaring kembali menggunakan milipor berukuran 0,45 mikron.
(d) Injeksi ke HPLC
Hasil saringan diambil sebanyak 20 μL untuk diinjeksikan ke dalam HPLC. Penghitungan konsentrasi asam amino dilakukan dengan cara membandingkan kromatogram contoh dengan standar, pembuatan kromatogram standar menggunakan asam amino yang mengalami perlakuan yang sama dengan contoh. Kandungan masing-masing asam amino pada bahan dapat dihitung dengan rumus:
Keterangan :
C = konsentrasi standar asam amino FP = faktor pengenceran
BM = bobot molekul dari masing-masing asam amino
Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis asam amino: Merek : Waters Coorporation, USA
Kolom : accQtag column (3,9 x 150 mm) Temperatur : 37oC
Fase gerak : acetonitril 60% - AccqTag Eluent A, sistem komposisi gradien Laju alir : 1,0 mL per menit
Detektor : fluorescense, Eksitasi = 250 nm, emisi = 395 nm Volume penyuntikan : 5 uL
Nama standar : Amino acid standard produksi Thermo Scientific
3.4.8 Uji stabilitas
Produk yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik diantara perlakuan yang diterima secara organoleptik, dilanjutkan pengujiannya untuk melihat stabilitas produk terhadap waktu penyimpanan. Pengujian masa simpan dilakukan dengan percepatan waktu atau model akselerasi menggunakan metode Arrhenius.
Model Arrhenius dilakukan dengan menyimpan produk pangan dengan kemasan akhir pada minimal tiga suhu penyimpanan ekstrim. Hasil pengamatan bagi setiap parameter dihitung laju penurunan mutunya per 7 hari menggunakan plot Arrhenius dalam grafik hubungan antara nilai ln k apabila mengikuti ordo reaksi satu, dan ln k nol apabila mengikuti ordo reaksi nol sebagai sumbu y dan sebagai sumbu x nya adalah suhu pada masing-masing penyimpanan (30oC, 35oC, dan 45oC), kemudian dicari nilai ln k nya atau nilai konstanta penurunan mutu per hari yang diperoleh dari kemiringan persamaan regresi grafik masing-masing suhu penyimpanan tersebut. Nilai k merupakan gradien dari regresi linier yang didapat dari ketiga suhu penyimpanan. Berdasarkan regresi linier yang diperoleh pada kurva Arrhenius ini dapat diprediksi umur simpan produk dengan menggunakan rumus:
Keterangan:
K = konstanta penurunan mutu
ko = konstanta (tidak bergantung pada suhu) E = energi aktivasi
T = suhu mutlak (oK)
R = konstanta gas (1,986 kal/mol K)
Dengan mengubah persamaan di atas menjadi: ln k = ln ko + (-Ea/R) 1/T
Dimana, ko merupakan konstanta penurunan mutu produk yang tidak tergantung suhu, sedangkan k merupakan konstanta penurunan mutu dari salah satu kondisi suhu yang digunakan (30oC, 35oC, dan 45oC) dan Ea/R merupakan gradient yang diperoleh dari plot Arrhenius. Dengan perhitungan menggunakan rumus ini, akan diperoleh nilai ko. Umur simpan merupakan ordo reaksi satu diperoleh dengan rumus:
t = ln Ao – ln At ko
Keterangan:
t = prediksi umur simpan (hari) Ao = nilai mutu awal
At = nilai mutu produk yang tersisa setelah waktu t ko = konstanta
Berdasarkan rumus diatas dapat diprediksi umur simpan dalam hari atau bulan. Sedangkan apabila mengikuti ordo reaksi nol umur simpan dapat diperoleh dengan menggunakan rumus:
t = Ao– At ko
Selama penyimpanan, produk disimpan pada tiga kondisi suhu yang berbeda yaitu 30oC, 35oC, dan 45oC. Frekuensi pengamatan dilakukan 7 hari sekali pada masing-masing suhu selama 60 hari.
(1) Derajat keasaman pH
Setiap formula minuman yang masuk dalam batas penerimaan secara organoleptik diukur nilai pH. Sebelum pengukuran, pH-meter distandarisasi menggunakan bufer standar pH 4 dan pH 7.
3.4.9 Aktivitas air (aw) (AOAC 1994)
Alat yang digunakan untuk mengukur aktivitas air adalah aw sprint Swiss Made-Novasiana TH 500. Sebelum digunakan alat ini dikalibrasi dengan menggunakan larutan garam jenuh yang nilai aw-nya sudah diketahui. Sampel dimasukkan ke dalam cawan sensor. Penutup cawan sensor dikatupkan dan tombol start ditekan untuk memulai pengukuran. Beberapa saat kemudian pada layar monitor tertera kadar aw sampel.
3.4.10 Pengujian mikrobiologi (Maturin dan Peeler 2001) (1) Uji total bakteri (Total Plate Count)
Sebanyak 1 mL sampel diambil dan dimasukkan ke dalam 9 mL larutan pengencer. Selanjutnya dilakukan pengocokan hingga homogen dengan vorteks. Pengenceran dan pemupukan dilakukan hingga tingkat pengenceran 10-2. Tiap-tiap pengenceran, dipipet secara aseptis 1 mL untuk dimasukkan ke dalam cawan petri steril (pemupukan) secara duplo dan ditambahkan media PCA steril sebanyak 15-20 mL.
Cawan petri yang berisi sampel segera digerakkan di atas meja secara hati- hati untuk menyebarkan sel-sel mikroba secara merata, yaitu dengan gerakan melingkar atau angka delapan, didiamkan hingga media membeku. Cawan petri selanjutnya diinkubasikan dengan posisi terbalik pada inkubator bersuhu 37oC selama 2 hari (48 jam). Perhitungan jumlah total mikroba dilakukan dengan Standard Plate Count (SPC) metode Harrigan.
(2) Uji kapang
Sebanyak 1 mL sampel diambil dan dimasukkan ke dalam 9 mL larutan pengencer. Selanjutnya dilakukan pengocokan hingga homogen dengan vorteks. Pengenceran dan pemupukan dilakukan hingga tingkat pengenceran 10-2. Tiap-tiap pengenceran, dipipet secara aseptis 1 mL untuk dimasukkan ke dalam
cawan petri steril (pemupukan) secara duplo dan ditambahkan media PDA cair yang telah ditambah asam tartarat steril 10% (b/v) sebanyak 15-20 mL.
Cawan petri yang berisi sampel segera digerakkan di atas meja secara hati- hati untuk menyebarkan sel-sel mikroba secara merata, yaitu dengan gerakan melingkar atau angka delapan. Setelah medium membeku cawan petri diinkubasikan dengan posisi terbalik pada incubator suhu 30oC selama 2 hari (48 jam). Perhitungan jumlah kapang dan khamir dilakukan dengan metode Harrigan.
