BAB I. PENDAHULUAN
F. Analisis gen 16S rRNA
Analisis tahap akhir dari identifikasi bakteri penghasil fitase ini yaitu dengan melakukan analisis gen 16S rRNA. Gen 16S rRNA merupakan gen penyandi ribosom yang ada dalam RNA. 16S rRNA merupakan salah satu penyusun subunit ribosom 30S, yang penting untuk translasi, dan terdiri dari 1542 pasangan basa. Urutan gen 16S rRNA telah banyak digunakan sebagai alat untuk mengidentifikasi bakteri yang tidak diketahui genus atau tingkat speies.
Jika derajat kesamaan urutan basa gen penyandi 16S rRNA < 97% dapat dianggap sebagai spesies baru. Analisis gen penyandi 16S rRNA praktis untuk definisi spesies, karena molekul ini bersifat ubikuitus, sehingga dapat dirancang suatu primer yang universal untuk seluruh kelompok. Data urutan basa gen penyandi 16S rRNA memungkinkan digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik yang dapat menunjukkan nenek moyang dan hubungan kekerabatan organisme, tetapi organisme yang sekerabat atau identik berdasarkan parameter ini belum tentu memiliki kesamaan secara fisiologi. Hal ini disebabkan gen penyandi 16S rRNA bukan merupakan suatu gen yang fungsional untuk kelangsungan hidup dan adaptasi pada lingkungan tertentu.
commit to user
Pada tahap ini mula-mula dilakukan ekstraksi DNA bakteri dan amplifikasi DNA dengan menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). DNA hasil dari PCR kemudian di sekuensing untuk mendapatkan susunan basa DNA bakteri tersebut, yang nantinya akan dibuat konstruksi pohon filogenetik untuk mengetahui hubungan kekerabatan antara gen bakteri yang ditemukan dengan gen bakteri yang terdapat pada gen bank.
Elektroforesis merupakan suatu teknik teknik yang umum digunakan untuk analisis DNA dan protein, yaitu dengan cara memisahkan senyawa yang bermuatan dengan meletakkannya pada suatu medan listrik. Separasi material elektroforsis didasarkan pada perbedaan dalam muatan molekul, ukuran molekul, atau kombinasi antara keduanya karena elektroforesis merupakan pergerakan dari molekul bermuatan listrik pada medan arus listrik maka molekul bermuatan negatif akan bergerak ke elektroda bermuatan positif. DNA yang bermuatan negatif akan bergerak ke arah kutub positif melalui molekul-molekul agarosa.
Hasil elektroforesis gel dari ekstraksi DNA ketiga isolat hanya terlihat smear DNAnya saja. Smear DNA yang paling tebal adalah DNA bakteri EN 6, sedangkan DNA bakteri EN 16 dan EN 10 tampak tipis sekali (Lampiran 9). Ketiga DNA tersebut kemudian di amplifikasi agar pita DNA tampak lebih jelas. Amplifikasi DNA dilakukan dengan teknik PCR, yaitu suatu teknik untuk memperbanyak suatu sekuens tertentu dari DNA, dengan cara reaksi polymerase berulang untuk memperbanyak sekuens target.
commit to user
Pita DNA hasil amplifikasi PCR berdasarkan gen pengkode 16S rRNA tampak lebih jelas, yaitu satu pita tunggal DNA yang berukuran sekitar 700bp (Gambar 26). Produk PCR tersebut kemudian disekuensing untuk mendapatkan susunan basa DNAnya. Susunan basa DNA yang telah diolah dengan menggunakan program Bio edit dan Peak Trace, menghasilkan sekuens dengan panjang sekitar 700bp. Sekuens yang dihasilkan oleh 3 isolat yaitu: isolat EN 10 menghasilkan 731bp, isolat EN 16 menghasilkan 717bp, dan isolat EN 6 menghasilkan 709bp (Lampiran 10).
Gambar 26. Gel elektroforesis gen 16S rRNA dari isolat EN 6, EN 10, dan EN 16 yang diamplifikasi dengan menggunakan primer 27f dan 765r.
commit to user
Sekuens DNA dari ketiga isolat tersebut kemudian dibandingkan dengan sekuens DNA yang terdapat pada gen bank NCBI, untuk mencari kemiripan/homologi dengan spesies bakteri tertentu, dengan menggunakan program BLAST dari NCBI (Tabel 1, Tabel 2, dan Tabel 3).
Tabel 1. Kemiripan sekuens isolat EN 10 dengan sekuens pada gen bank.
No Deskripsi Total Nilai Kemiripan
1 Bacillus sp. 1052 1312 731/732 (99%)
2 Bacillus sp. SSAL-1 1312 731/732 (99%)
3 Bacillus sp. BB61 1312 731/732 (99%)
4 Bacillus cereus FRI-35 1312 731/732 (99%)
5 Bacillus cereus strain HPCAQ4CR9 1312 731/732 (99%) 6 Bacillus cereus strain R5-339 1312 731/732 (99%) 7 Bacillus cereus strain R4-331 1312 731/732 (99%)
8 Bacillus cereus 1312 731/732 (99%)
9 Bacillus sp. B2005 1312 731/732 (99%)
10 Bacillus sp. A55 1312 731/732 (99%)
Tabel 2. Kemiripan sekuens isolat EN 16 dengan sekuens pada gen bank.
No Deskripsi Total Nilai Kemiripan
1 Bacillus sp. 1052 1287 717/718 (99%)
2 Bacillus sp. SSAL-1 1287 717/718 (99%)
3 Bacillus sp. BB612 1287 717/718 (99%)
4 Bacillus cereus FRI-35 1287 717/718 (99%)
5 Bacillus cereus 1287 717/718 (99%)
6 Bacillus cereus strain HPCAQ4CR9 1287 717/718 (99%) 7 Bacillus cereus strain R5-339 1287 717/718 (99%) 8 Bacillus cereus strain R4-331 1287 717/718 (99%)
9 Bacillus sp. TSM1 1287 717/718 (99%)
commit to user
Tabel 3. Kemiripan sekuens isolat EN 6 dengan sekuens pada gen bank.
No Deskripsi Total Nilai Kemiripan
1 Bacillus sp. 7A9S1 1189 668/668 (100%)
2 Bacillus sp. GIII 1180 665/666 (99%)
3 Bacterium GDIM-2 1231 690/699 (99%)
4 Bacillus psychrotolerans strain VKSJ-4 1213 686/691 (99%)
5 Bacillus sp. CL1 1213 685/690 (99%) 6 Bacillus sp. PU1 1195 686/691 (99%) 7 Bacillus sp. LLO 1162 658/671 (98%) 8 Bacillus sp. K3 1112 667/702 (95%) 9 Bacillus sp. CK7 1110 664/699 (95%) 10 Bacillus sp. QT14 1092 667/703 (95%)
Berdasarkan hasil kemiripan sekuens isolat terpilih dengan sekuens yang ada pada gen bank menunjukkan bahwa isolat EN 10 dan EN 16 adalah jenis bakteri Bacillus cereus, sedangkan isolat EN 6 adalah jenis bakteri Bacillus sp. Sekuens DNA dari ketiga isolat ini kemudian dibandingkan kemiripannya dengan sekuens DNA dari bakteri penghasil fitase yang lain dari gen bank, yaitu: fitase B. amiloliquefasciens AP-17 (no. akses JQ740157.1), B. subtilis strain CF92 (no. akses HQ127622.1), B.cereus (no. akses JQ993365.1), dan Bacillus sp. 1052 (no. akses JX566534.1) (Lampiran 11). Kumpulan sekuens tersebut disejajarkan dengan cara multiple sequence alignment (Gambar 27).
commit to user
B_cereus_EN_10 ---GTTT GATCCTGGC- CAGGATGAAC GCTGGCGGCG TGCCTAATAC 50
B_cereus_EN_16 ---. ...- ... ... ... 50 Bacillus_sp_EN_6 TTGAGA.... ...- ...C.... ... ... 50 Bacillus_cereus ---AGA.... ...T ... ... ... 50 Bacillus_sp._1052 ATTAGA.... ...T ... ... ... 50 B_amyloliquefaciens_AP-17 --- --- --- --- --- 50 B_subtilis_strain_CF92 --- --- --- --- -.G..GGGCG 50
B_cereus_EN_10 ATGCAA-GTC GAGCGAATGG ATTAAGAGCT TGCTCTTATG AAGTTAGCGG 100 B_cereus_EN_16 ...-... ... ... ... ... 100
Bacillus_sp_EN_6 ...-... ... CAG.G... ...C.A GAT.C... 100
Bacillus_cereus ...-... ... ... ... ... 100
Bacillus_sp._1052 ...-... ... ... ... ... 100
B_amyloliquefaciens_AP-17 --- --- --- --- --- 100
B_subtilis_strain_CF92 C.ATCTGCAG TCGA.CGGAC .GATG.GAGC .TGCTCCC.. .T... 100
B_cereus_EN_10 CGGACGGGTG AGTAACACGT GGGTAACCTG CCCATAAGAC TGGGATAACT 150 B_cereus_EN_16 ... ... ... ... ... 150 Bacillus_sp_EN_6 ... ... ...C... ...TGT...T ... 150 Bacillus_cereus ... ... ... ... ... 150 Bacillus_sp._1052 ... ... ... ... ... 150 B_amyloliquefaciens_AP-17 --- --- ---.. ..TG... ... 150 B_subtilis_strain_CF92 ... ... ... ..TG... ... 150
B_cereus_EN_10 CCGGGAAACC GGGGCTAATA CCGGATAACA TTTTGAACCG CATGGTTCGA 200 B_cereus_EN_16 ... ... ... ... ... 200 Bacillus_sp_EN_6 ... ... ...TC C..C...T ...C... 200 Bacillus_cereus ... ... ... ... ... 200 Bacillus_sp._1052 ... ... ... ... ... 200 B_amyloliquefaciens_AP-17 ... ... ...GGTT G... ...CA. 200 B_subtilis_strain_CF92 ... ... ...GGTT G... ...CA. 200
B_cereus_EN_10 AATTGAAAGG CGGCTTCGGC TGTCACTTAT GGATGGACCC GCGTCGCATT 250 B_cereus_EN_16 ... ... ... ... ... 250
Bacillus_sp_EN_6 TG... ... ...ACA ...G... ...G... 250
Bacillus_cereus ... ... ... ... ... 250
Bacillus_sp._1052 ... ... ... ... ... 250
B_amyloliquefaciens_AP-17 .C... T... .AC...C A... ...G... 250
B_subtilis_strain_CF92 .C... T... .AC...C A... ...G... 250
B_cereus_EN_10 AGCTAGTTGG TGAGGTAACG GCTCACCAAG GCAACGATGC GTAGCCGACC 300 B_cereus_EN_16 ... ... ... ... ... 300 Bacillus_sp_EN_6 ... ... ... ..C... ... 300 Bacillus_cereus ... ... ... ... ... 300 Bacillus_sp._1052 ... ... ... ... ... 300 B_amyloliquefaciens_AP-17 ... ... ... ... ... 300 B_subtilis_strain_CF92 ... ... ... ..G... ... 300
B_cereus_EN_10 TGAGAGGGTG ATCGGCCACA CTGGGACTGA GACACGGCCC AGACTCCTAC 350 B_cereus_EN_16 ... ... ... ... ... 350 Bacillus_sp_EN_6 ... ... ... ... ... 350 Bacillus_cereus ... ... ... ... ... 350 Bacillus_sp._1052 ... ... ... ... ... 350 B_amyloliquefaciens_AP-17 ... ... ... ... ... 350 B_subtilis_strain_CF92 ... ... ... ... ... 350
B_cereus_EN_10 GGGAGGCAGC AGTAGGGAAT CTTCCGCAAT GGACGAAAGT CTGACGGAGC 400 B_cereus_EN_16 ... ... ... ... ... 400 Bacillus_sp_EN_6 ... ... ... ... ....T... 400 Bacillus_cereus ... ... ... ... ... 400 Bacillus_sp._1052 ... ... ... ... ... 400 B_amyloliquefaciens_AP-17 ... ... ... ... ... 400 B_subtilis_strain_CF92 ... ... ... ... ... 400
B_cereus_EN_10 AACGCCGCGT GAGTGATGAA GGCTTTCGGG TCGTAAAACT CTGTTGTTAG 450 B_cereus_EN_16 ... ... ... ... ... 450
Bacillus_sp_EN_6 ... ...A... ..T.C....A ... ...G.. 450
Bacillus_cereus ... ... ... ... ... 450
Bacillus_sp._1052 ... ... ... ... ... 450
B_amyloliquefaciens_AP-17 ... ... ..T...A ...G.. ... 450
B_subtilis_strain_CF92 ... ... ..T...A ...G.. ... 450
commit to user
B_cereus_EN_10 GGAAGAACAA GTGCTAGTTG AATAAGCTGG CACCTTGACG GTACCTAACC 500
B_cereus_EN_16 ... ... ... ... ... 500 Bacillus_sp_EN_6 ... ..A.CG.AGT ..CT-..C.. T... ...C.TT 500 Bacillus_cereus ... ... ... ... ... 500 Bacillus_sp._1052 ... ... ... ... ... 500 B_amyloliquefaciens_AP-17 ... ..A.C... ....G.GC.. T... ... 500 B_subtilis_strain_CF92 ... ..A.C... ....G.GC.. T... ... 500
B_cereus_EN_10 AGAAAGCCAC GGCTAACTAC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGTAGGTGG 550 B_cereus_EN_16 ... ... ... ... ... 550 Bacillus_sp_EN_6 ... ... ... ... ... 550 Bacillus_cereus ... ... ... ... ... 550 Bacillus_sp._1052 ... ... ... ... ... 550 B_amyloliquefaciens_AP-17 ... ... ... ... ... 550 B_subtilis_strain_CF92 ... ... ... ... ... 550
B_cereus_EN_10 CAAGCGTTAT CCGGAATTAT TGGGCGTAAA GCGCGCGCAG GTGGTTTCTT 600 B_cereus_EN_16 ... ... ... ... ... 600 Bacillus_sp_EN_6 ...G. ...C.. ... ... .C...CC... 600 Bacillus_cereus ... ... ... ... ... 600 Bacillus_sp._1052 ... ... ... ... ... 600 B_amyloliquefaciens_AP-17 ...G. ... ... ....T... .C... 600 B_subtilis_strain_CF92 ...G. ... ... ....T... .C... 600
B_cereus_EN_10 AAGTCTGATG TGAAAGCCCA CGGCTCAACC GTGGAGGGTC ATTGGAAACT 650 B_cereus_EN_16 ... ... ... ... ... 650 Bacillus_sp_EN_6 ... ... ... ... ... 650 Bacillus_cereus ... ... ... ... ... 650 Bacillus_sp._1052 ... ... ... ... ... 650 B_amyloliquefaciens_AP-17 ... ...C ... .G... ... 650 B_subtilis_strain_CF92 ... ...C ... .G... ... 650
B_cereus_EN_10 GGGAGACTTG AGTGCAGAAG AGGAAAGTGG AATTCCATGT GTAGCGGTGA 700 B_cereus_EN_16 ... ... ... ... ... 700 Bacillus_sp_EN_6 ... ... ...C.. ...A.. ... 700 Bacillus_cereus ... ... ... ... ... 700 Bacillus_sp._1052 ... ... ... ... ... 700 B_amyloliquefaciens_AP-17 ...GA... ... ....G... ...C.. ... 700 B_subtilis_strain_CF92 ...GA... ... ....G... ...C.. ... 700
B_cereus_EN_10 AATGCGTAGA GATATGGAGG AACACCAGTG GCGAAGGCG- 740
B_cereus_EN_16 ... ... ...-- --- 740 Bacillus_sp_EN_6 ... ..--- --- --- 740 Bacillus_cereus ... ... ... ...A 740 Bacillus_sp._1052 ... ... ... ...A 740 B_amyloliquefaciens_AP-17 ... ...G... ... ...A 740 B_subtilis_strain_CF92 ... ...G... ... ...A 740
Gambar 27. Perbandingan urutan basa DNA dari B.cereus EN 10, B. cereus EN 16, Bacillus sp. EN 6, B.cereus (no. akses JQ993365.1), Bacillus sp. 1052 (no. akses JX566534.1), B. amiloliquefasciens AP-17 (no. akses JQ740157.1), dan B. subtilis strain CF92 (no. akses HQ127622.1).
(Keterangan: tanda titik ( . ) menunjukkan kesamaan basa DNA antar spesies, sedangkan tanda stip ( - ) menunjukkan adanya gap.)
commit to user
Kumpulan sekuens yang telah disejajarkan tersebut kemudian dibuat konstruksi pohon filogenetik untuk menunjukkan hubungan kekerabatan antara fitase yang dihasilkan dalam penelitian ini dengan fitase dari spesies Bacillus yang lain dan Pantoea agglomerans (no. akses DQ435815.1) (Gambar 28). B. cereus EN 10 dan B. cereus EN 16 memiliki hubungan kekerabatan yang agak jauh dengan Bacillus sp. EN 6. B. cereus EN 10 dan B. cereus EN 16 secara homologi memiliki kemiripan yang besar dengan Bacillus sp 1052 (no. akses JX566534.1) dan B. cereus (no. akses JQ993365.1), dan berdasarkan pohon filogenetik juga memiliki hubungan kekerabatan yang dekat pula. B. cereus EN 10, B. cereus EN 16, dan Bacillus sp. EN 6 masih memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan B. alimoliquefasciens AP-17 (no. akses JQ740157.1) dan B. subtilis CF92 (no. akses HQ127622.1) yang juga merupakan bakteri penghasil fitase.
Gambar 28. Pohon filogenetik berbasis gen 16S rRNA dari B. cereus EN 10, B. cereus EN 16, Bacillus sp. EN 6 dengan beberapa jenis Bacillus lain dan Pantoea agglomerans.
commit to user
Berdasarkan pohon filogenetik, B. cereus EN 10 dan B. cereus EN 16 memiliki hubungan kekerabatan yang sangat dekat, namun berdasarkan karakterisasinya memiliki suhu optimum dan pH optimum fitase yang berbeda. Sebaliknya, berdasarkan pohon filogenetik, B. cereus EN 10 dan B. cereus EN 16 memiliki hubungan kekerabatan yang agak jauh dengan Bacillus sp EN 6, namun berdasarkan karakterisasinya ada yang memiliki kesamaan suhu optimum ataupun pH optimum fitase.
Berdasarkan pohon filogenetik, B. cereus EN 10 memiliki hubungan kekerabatan yang agak jauh dengan Bacillus sp EN 6, namun berdasarkan karakterisasinya memiliki kesamaan suhu optimum fitase yaitu 60ºC. Sedangkan B. cereus EN 16 berdasarkan pohon filogenetiknya memiliki hubungan kekerabatan yang agak jauh dengan Bacillus sp EN 6 tetapi memiliki kesamaan karakteristik pH optimum fitase yaitu pH 6.
Bacillus sp EN 6, B. cereus EN 10, dan B. cereus EN 16 juga memiliki kesamaan karakteristik dengan B.subtilis CF92 (no. akses HQ127622.1) dan B. amyloliquefaciens AP-17 (no. akses JQ740157.1). Bacillus sp EN 6 dan B. cereus EN 10 memiliki kesamaan karakteristik suhu optimum fitase dengan B.subtilis CF92 (no. akses HQ127622.1) yang juga memiliki suhu optimum fitase 60ºC. Sedangkan Bacillus sp EN 6 dan dan B. cereus EN 16 memiliki kesamaan karakteristik pH optimum fitase dengan B. amyloliquefaciens AP-17 (no. akses JQ740157.1) yang juga memiliki pH optimum fitase 6.
commit to user Fitase Bacillus
Hasil identifikasi bakteri menunjukkan bahwa ketiga isolat yang memiliki aktivitas fitase tertinggi adalah Bacillus cereus EN 10, B. cereus EN 16, dan Bacillus sp. EN 6. Ketiga bakteri tersebut memiliki genus yang sama yaitu Bacillus. Fitase dari kelompok Bacillus memiliki karakteristik suhu optimum dan pH optimum yang berbeda-beda. Dari data suhu optimum dan pH optimum fitase dari beberapa jenis Bacillus menunjukkan bahwa fitase yang dihasilkan oleh Bacillus memiliki kisaran suhu optimum dan pH optimum yang luas, yaitu dengan suhu optimum antara 40-75ºC, dan pH optimum antara 4-8 (Tabel 4).
Tabel 4. Suhu optimum dan pH optimum dari beberapa spesies Bacillus.
Spesies Suhu
optimum
pH
optimum Pustaka
B. subtilis N-77 60ºC 6 – 6,5 Shimizu, 1992 B. amyloliquefaciens DS11 70ºC 7 – 8 Kim et al., 1998 Bacillus sp KHU-10 60ºC 6 – 8 Choi et al., 2001 Bacillus sp 55ºC 4,5 – 6 Pandey et al., 2001 B. amyloliquefaciens AP-17 75ºC 6 Kusumadjaja et al., 2009 B. subtilis HG 41ºC 6,5 - 7 Yuanita et al., 2010 B. subtilis CF92 60ºC 7 Hong et al., 2011 B. cereus RW SM A 50ºC 5 Wulandari, 2011 B. aryabhattai RW SM C 60ºC 6 Wulandari, 2011 B. cereus RW SL 5 50ºC 5 Wulandari, 2011 Bacillus sp EN 6 60ºC 6 Penelitian ini Bacillus cereus EN 10 60ºC 4 Penelitian ini Bacillus cereus EN 16 50ºC 6 Penelitian ini
commit to user
Kelompok bakteri Bacillus merupakan mikroorganisme yang disebut
sebagai GRAS “generally recognized as safe” oleh American Food and Drug Administration karena mikroorganisme ini digunakan secara luas sebagai suplemen pangan yang aman (Hong et al., 2011). Fitase dari kelompok Bacillus ini sangat cocok dimanfaatkan pada suplemen pakan ternak karena memiliki suhu optimum yang tinggi sehingga tidak mudah terdenaturasi selama proses pengolahan. Adanya penambahan fitase pada pakan ternak dapat meningkatkan kecernaan fosfat dan menurunkan polusi fosfat pada area sekitar peternakan.
commit to user
V. KESIMPULAN DAN SARAN