CENDAWAN PYRICULARIA GRISEA SACC.
3. Metode penelitian
1.1. Analisis Integrasi Gen OsWRKY
Untuk membuktikan apakah suatu gen yang dimasukkan ke dalam genom tanaman telah terintegrasi ke dalam genom tanaman, cara yang dilakukan adalah dengan melakukan analisis Southern blot (SB). Metode Southern blot dapat digunakan untuk mengetahui informasi tentang integrasi dan jumlah kopi dari gen target.
Pada penelitian ini analisis Southern blot dilakukan pada 26 nomor galur independen dari 126 galur independen padi transgenik generasi T0 yang diperoleh. Metode Southern blot berdasarkan protokol Panaud et al. (1993) dengan menggunakan probe hptII. Metode tersebut digunakan sebagai alternatif yang biasanya menggunakan metode berbahan radioaktif seperti 32P. Hasil analisis Southern blot pada transforman generasi T0 menunjukkan bahwa dari 26 transforman yang diuji, semuanya mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 di dalam genomnya. Ini diperlihatkan dengan adanya pita DNA yang terbentuk pada membran nilon Hybon N+ dan tidak terbentuknya pita pada sampel tanaman Nipponbare non-transgenik (Gambar 14).
Hasil analisis Southern blot menunjukkan bahwa galur-galur padi transgenik yang mengandung kopi atau sisipan tunggal konstruk gen over- ekspresi OsWRKY76 sebanyak 9 galur (34,6 %), galur dengan 2 sisipan konstruk gen over-ekspresi OsWRKY76 sebanyak 10 galur (38,5 %), galur dengan 3 sisipan konstruk gen over-ekspresi OsWRKY76 sebanyak 4 galur (15,4 %), sedangkan galur yang mempunyai 4 sisipan konstruk gen over-ekspresi OsWRKY76 sebanyak 3 galur (11,5 %) (Tabel 3). Dari hasil analisis tersebut dapat dilihat bahwa jumlah kopi gen hptII yang terintegrasi di dalam genom tanaman transgenik bervariasi, yaitu antara 1-4 kopi. Dengan terintegrasinya gen hptII di dalam genom tanaman diharapkan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 juga telah terintegrasi di dalam genom, karena kedua gen tersebut (hptII dan konstruk over-ekspresi OsWRKY76) terdapat pada daerah T-DNA yang ditransfer oleh Agrobacterium ke dalam genom tanaman.
Gambar 14. Analisis Southern blot pada 26 galur tanaman padi Nipponbare transgenik berdasar metode Panaud et. al. (1993) dengan probe hptII. DNA genom dari tanaman transgenik dipotong dengan menggunakan enzim restriksi EcoRI, diseparasi dengan elektroforesis, didenaturasi, ditransfer ke membran nilon Hybon N+, dan dihibridisasi dengan menggunakan probe hptII. Ket.:1-26 =secara berurutan sampel galur-galur NAW 1.1,NAW 2.12, NAW 3.2, NAW 4.1, NAW 5.2, NAW 6.3, NAW 7.3, NAW 8.2, NAW 11.1, NAW 12.1, NAW 13.1, NAW 14.4, NAW 15.3, NAW 16.1, NAW 17.1, NAW 18.1, NAW 22.1, NAW 23.1, NAW 25.6, NAW 26.3, NAW 29.2, NAW 30.5, NAW 34.3, NAW 35.3, NAW 36.1, NAW 37.2, = 1KB Ladder
Tabel 3. Jumlah kopi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 pada 26 galur-galur independen hasil analisis Southern Blot
No. Jumlah kopi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 Jumlah galur independen (persentase)
Nomor galur independent
1 1 9 (34,6 %)
NAW 1.1*, NAW 3.2*, NAW 8.2*, NAW 17.1, NAW 25.6, NAW 29.2, NAW 30.5*, NAW 36.1*, NAW 37.2*
2 2 10 (38,5 %)
NAW 2.12, NAW 4.1, NAW 5.2, NAW 12.1, NAW 15.3, NAW 22.1, NAW 23.1, NAW 26.3, NAW 34.3 NAW 35.3
3 3 4 (15,4 %) NAW 11.1, NAW 13.1, NAW 14.4, NAW 16.1
4 4 3 (11,5 %) NAW 6.3, NAW 7.3, NAW 18.1
Keterangan: Galur dengan tanda bintang (*) adalah galur-galur yang digunakan untuk uji efek over-ekspresi gen OsWRKY76 terhadap cendawan blas.
Jumlah sisipan atau kopi gen ini di dalam genom tanaman sangat mempengaruhi ekspresi dari gen tersebut di dalam tanaman. Semakin banyak
6 5 4 3 1612 13 15 2 1 147 268 9 10 11 17 18 1920 21 22 23 24 25 λ λ 6 5 4 3 1612 13 15 2 1 147 268 9 10 11 1718 19 20 21 22 23 24 25
jumlah kopi gen di dalam genom tanaman maka ekspresi gen akan kurang stabil yang diakibatkan adanya pembungkaman gen (gene silencing). Selain itu ekspresi gen juga dipengaruhi oleh lokasi masuknya gen di dalam genom tanaman yang dikenal dengan istilah efek posisi gen (potitional effect). Apabila masuk di daerah eukromatin di dalam kromosom, maka gen akan dapat terekspresi dengan baik, sebaliknya apabila gen masuk di daerah heterokromatin, maka gen tidak akan terekspresi (Alberts et al. 2002). Hal tersebut merupakan salah satu penyebab gen interes yang diinsersikan ke dalam genom tanaman tidak dapat terekspresi dengan baik meskipun hanya satu kopi saja di dalam genom tanaman.
Jumlah kopi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 yang terintegrasi ke dalam genom tanaman dalam analisis Southern diperlihatkan dengan terbentunya pita-pita (fragmen) di dalam membran nilon (Gambar 14). Pita-pita tersebut dapat terjadi karena DNA padi transgenik yang telah dipotong dengan enzim restriksi EcoRI dapat terhibridisasi dengan probe hptII. Enzim restriksi EcoRI tersebut akan memotong pada bagian T-DNA yang terinsersi di dalam genom tanaman dan pada bagian DNA genom tanaman. Pita-pita terbentuk dari hasil hibridisasi antara probe hptII dengan gabungan potongan bagian T-DNA yang terintegrasi dalam genom tanaman dan potongan DNA genom tanaman. Apabila konstruk over- ekspresi gen OsWRKY76 yang berada di daerah T-DNA terinsersi di dalam genom tanaman lebih dari satu, maka akan menghasilkan jumlah pita lebih dari satu pula pada individu tanaman transgenik yang sama. Masuknya konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 di dalam genom tanaman bersifat acak, sehingga pita-pita yang terbentuk pada membran hasil Southern akan mempunyai ukuran yang berbeda- beda.
3.2. Uji efek over-ekspresi gen OsWRKY76
Dalam kegiatan analisis fungsi dari gen, uji efek over-ekspresi dari gen tertentu di dalam suatu tanaman sangat dibutuhkan. Hal ini dikarenakan, dengan uji tersebut dapat digunakan untuk menarik suatu kesimpulan, apakah suatu gen tertentu memang memiliki fungsi seperti yang diperkirakan.
Dalam penelitian ini yang diuji adalah galur-galur independen yang mengandung kopi tunggal konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76, karena untuk
menghindari efek gen silencing yang dapat ditimbulkan oleh jumlah kopi gen lebih dari satu di dalam genom tanaman. Dalam uji ketahanan ini tanaman non- transgenik dan transgenik diuji masing-masing dengan 3 ulangan menggunakan 5 isolat uji yaitu 173, 033, 041, 133, dan 333. Isolat-isolat uji tersebut digunakan untuk uji ketahanan dengan alasan karena merupakan jenis isolat yang dominan di lapang (di Indonesia). Khusus untuk isolat 333 mempunyai karakter lebih virulen dari isolat 173 di lapang, tetapi tidak tersebar luas seperti isolat 173 (Nasution, komunikasi pribadi). Sampai saat ini belum ada laporan yang menyatakan bahwa isolat-isolat uji yang digunakan dalam penelitian ini pernah digunakan untuk menguji ketahanan tanaman padi Nipponbare terhadap cendawan blas (Pyricularia grisea).
Tabel 4. Tingkat ketahanan galur Nipponbare transgenik dibandingkan dengan tanaman non-transgenik
No Nomor Galur Rata-rata skor tingkat serangan
Nilai p pada uji T Transgenik vs Non-transgenik 1 NAW 1.1 1,34 0,012* 2 NAW 3.2 3,03 0,123 3 NAW 8.2 3,64 0,415 4 NAW 30.3 2,73 0,072 5 NAW 36.1 1,67 0,033* 6 NAW 37.2 2,44 0,044* 7 Nipponbare 3,8
Keterangan: *Berbeda nyata pada tingkat signifikansi 0,05
Hasil uji efek over-ekspresi gen OsWRKY76 terhadap cendawan blas (Pyricularia grisea) dengan isolat uji 173, 033, 041, 133, 333 terhadap 6 galur independen yang mempunyai jumlah kopi tunggal konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 di dalam genom tanaman menunjukkan bahwa, tanaman Nipponbare non-transgenik yang diuji ketahanannya bersama-sama dengan tanaman transgenik tidak menunjukkan adanya gejala serangan blas pada inokulasi dengan 4 isolat uji selain isolat uji 173 (data tidak ditampilkan). Dengan hasil tersebut maka kesimpulan dari hasil uji efek over-ekspresi gen OsWRKY76 hanya dapat
diambil dari galur-galur yang diinokulasi dengan isolat uji 173 saja. Oleh karena itu hasil uji ketahanan dengan 4 isolat uji yang lainnya tidak dibahas dalam tulisan ini.
Gambar 15. Daun padi Nipponbare transgenik tahan (3 galur) dan non-transgenik yang telah diinokulasi dengan cendawan blas (Pyricularia grisea) isolat uji 173. Keterangan: A: tanaman non-transgenik, B: galur NAW 1.1, C:galur NAW 36.1, D: NAW 37.2. Tanda anak panah menunjukkan adanya bercak serangan cendawan blas.
Analisis statistik dengan uji T dari 6 tanaman transgenik yang mengandung sisipan tunggal konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 dibandingkan dengan tanaman non-transgenik pada uji ketahanan terhadap cendawan blas menunjukkan tiga galur independen, yaitu NAW 1.1, NAW 36.1, dan NAW 37.2 secara nyata lebih tahan dibandingkan dengan tanaman non- transgenik pada tingkat signifikansi 5 % (Tabel 4). Sedangkan secara fenotipe, dari 6 galur independen yang diuji ketahanannya dengan isolat uji 173, 3 galur independen NAW 1.1, NAW 36.1, dan NAW 37.2 memperlihatkan tingkat ketahanan yang lebih baik dibandingkan dengan tanaman non-transgenik. Pada tanaman non-transgenik bercak serangan cendawan blas mengalami perluasan. Sedangkan pada tanaman transgenik yang tahan bercak serangan cendawan blas tidak mengalami perluasan, hanya berupa bercak coklat kemerahan yang reaksinya menyerupai reaksi hipersensitif (Gambar 15).
Dari 6 galur independen yang mempunyai jumlah kopi tunggal konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 berdasarkan analisis Southern Blot tidak selalu menunjukkan konsistensi sifat tahan terhadap cendawan blas isolat uji 173. Ada 3
A
B
C
galur yaitu NAW 3.2, NAW 8.2, dan NAW 30.3 yang mempunyai jumlah kopi tunggal dari konstruk gen over-ekspresi OsWRKY76 ternyata mempunyai ketahanan tidak berbeda dengan tanaman Nipponbare non-transgenik (Tabel 4). Hal ini memperlihatkan adanya efek posisi integrasi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 di dalam genom tanaman. Galur-galur yang lebih tahan dari tanaman non-transgenik menunjukkan bahwa konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 kemungkinan besar masuk di kromosom pada daerah eukromatin, sehingga gen dapat terekspresi dengan baik. Sebaliknya, galur tanaman transgenik yang memperlihatkan tidak berbeda ketahanannya dengan tanaman non-transgenik kemungkinan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 masuk di kromosom pada daerah heterokromatin sehingga gen tidak dapat terekspresi dengan baik. Namun demikian hal ini masih harus dikonfirmasi lebih lanjut.
KESIMPULAN
Dari 26 galur independen yang dianalisis Southern Blot menunjukkan bahwa terdapat variasi jumlah kopi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 yang terintegrasi di dalam genom tanaman yaitu antara 1-4 kopi. Hasil uji efek over- ekspresi gen OsWRKY76 terhadap cendawan Pyricularia grisea menunjukkan bahwa dari 6 galur tanaman transgenik yang mempunyai jumlah kopi tunggal terdapat 3 galur independen (NAW 1.1, NAW 36.1, dan NAW 37.2) yang ketahanannya lebih baik dibandingkan dengan tanaman padi Nipponbare non- transgenik terhadap isolat uji 173.