TUMEFACIENS PADA TANAMAN PADI NIPPONBARE
ABSTRAK
ANIVERSARI APRIANA. Konstruksi dan Introduksi Konstruk Over- ekspresi Gen OsWRKY76 melalui Agrobacterium tumefaciens pada Tanaman Padi Nipponbare. Dibimbing oleh SUDARSONO, NURUL KHUMAIDA, dan KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO.
Perbaikan sifat tanaman dapat dilakukan dengan pemuliaan tanaman klasik atau dengan rekayasa genetik. WRKY merupakan protein faktor transkripsi yang terlibat dalam regulasi jalur respon pertahanan tanaman. Gen OsWRKY76 terletak pada segmen di kromosom 9 tanaman padi yang sebelumnya diidentifikasi terkait dengan ketahanan berspektrum luas.
Penelitian ini bertujuan untuk merakit dan mengintroduksikan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam tanaman padi Nipponbare melalui bantuan A. tumefaciens. Konstruk pCAMBIA-1301::35S::OsWRKY76 telah berhasil dirakit dan telah ditransformasikan ke dalam kalus embriogenik tanaman padi cv. Nipponbare melalui bantuan A. tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105. Dari transformasi tersebut dihasilkan 126 galur independen dan strain Agl-1 lebih efisien dalam menghasilkan galur independen dibandingkan dengan strain EHA 105. Analisis PCR dari 25 galur independen yang diuji secara acak menunjukkan semua positif mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76.
ABSTRACT
ANIVERSARI APRIANA. Development and Introduction of Over- expression Construct of OsWRKY76 Gene through Agrobacterium tumefaciens in Rice. Guided by SUDARSONO, NURUL KHUMAIDA, and KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO.
Plant genetic improvement can be done through classical breeding or genetic engineering. WRKY is a transcription factor involved in regulating plant defense responses. OsWRKY76 gene is located in a narrow segment of chromosome 9 which is identified previously to be related to wide spectrum resistance in rice.
The aim of this research was to assemble an over-expression construct of OsWRKY76 gene and introduce it into rice through Agrobacterium-mediated transformation. A construct of pCAMBIA-1301::35S::OsWRKY76 has been successfully assembled and transformed into embryogenic calli of rice cv. Nipponbare using A. tumefaciens strain Agl-1 and EHA 105. A number of 126 independent lines has been produced, in which Agl-1 showed higher efficiency than EHA 105. PCR analysis of randomly selected 25 independent lines showed that all of them positively contained the over-expression construct of the OsWRKY76 gene.
PENDAHULUAN
Perbaikan suatu sifat tanaman dapat dilakukan melalui modifikasi genetik baik dengan pemuliaan secara konvensional maupun dengan bioteknologi khususnya teknologi rekayasa genetik (Herman 2002). Pemuliaan secara konvensional memperbaiki sifat tanaman dengan cara menyilangkan antara kultivar. Dengan cara ini gen yang berpindah bukan hanya yang mengontrol sifat yang diinginkan saja, namun juga gen-gen lain (yang tidak diiginkan), sehingga hasil yang diperoleh sering tidak sesuai dengan yang diharapkan. Selain itu, untuk mendapatkan sifat yang diinginkan dari proses persilangan tersebut memakan waktu yang cukup lama, karena membutuhkan seleksi terus menerus yang memakan waktu, biaya, dan tempat yang tidak sedikit. Teknologi rekayasa genetik tanaman bekerja pada tingkat DNA, sehingga melalui teknik ini memungkinkan untuk mentransfer gen spesifik yang diinginkan ke dalam genom tanaman. Dengan teknik ini kendala yang dihadapi dari sistem konvensional dapat dipecahkan, misalnya adanya hambatan seksual, karena dengan teknik ini dapat diintroduksikan gen dari spesies tanaman maupun gen dari organisme lain ke dalam genom tanaman.
Teknologi untuk mentransfer suatu gen dibedakan menjadi dua, yaitu secara langsung dan tidak langsung. Transfer gen secara langsung dapat dilakukan dengan penembakan partikel, elektroporasi, atau dengan PEG (Herman 2002). Sedangkan transfer gen secara tidak langsung paling banyak dilakukan dengan bantuan Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium mampu mentransfer gen ke dalam genom tanaman. Gen yang ditransfer tersebut terletak pada bagian T-DNA (transfer DNA) dari plasmid Ti (tumor inducing).
Keberhasilan teknologi rekayasa genetik tanaman tergantung dari 3 hal, yaitu gen yang akan diintroduksikan, metode transformasi dan regenerasi tanaman, ekspresi transgen di dalam sel tanaman target. Gen yang diintroduksikan ke dalam genom tanaman harus dapat diinsersikan ke genom tanaman, diekspresikan, dan tetap terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel berikutnya (Herman 1999). Sel atau jaringan yang ditransformasi harus dapat
diregenerasikan menjadi tanaman utuh. Regenerasi tanaman dapat dilakukan baik secara orgnogenesis ataupun embriogenesis (Sticklen 1991; Zhong et al. 1991).
Dengan telah selesainya pengurutan DNA dari genom tanaman padi memungkinkan untuk mengetahui keberadaan, macam dan sifat dari gen-gen yang ada pada tanaman padi termasuk gen-gen penyandi ketahanan. Sampai saat ini masih sebagian kecil dari gen-gen yang ada pada tanaman padi tersebut diketahui fungsinya. Saat ini telah dikembangkan metode analisis fungsi dari gen berdasar urutan informasi pengurutan genom padi. Salah satu metode analisis fungsi gen tersebut adalah dengan cara yang dikenal dengan istilah Revers Genetic (Bouches and Hofte 1998). Metode ini berawal dari pengetahuan tentang sekuen gen kandidat, yang dilanjutkan dengan identifikasi mutan untuk gen tersebut dan analisis fungsi dari gen-gen dengan menggunakan mutan tersebut.
Faktor transkripsi yang juga biasa dikenal dengan istilah sequence-specific DNA binding factor adalah merupakan suatu protein yang melekat secara spesifik pada DNA dengan menggunakan daerah yang disebut dengan DNA binding domain yang merupakan bagian dari sistem yang mengontrol transfer transkripsi. Faktor transkripsi dalam menjalankan fungsinya secara tunggal atau bersama- sama dengan protein-protein yang lain yang bergabung secara kompleks, bersama RNA polimerase dapat meningkatkan (bertindak sebagai activator) atau menekan (bertindak sebagai repressor) transkripsi. Faktor transkripsi mempunyai fungsi di dalam pengaturan pada basal transkripsi, perkembangan sel dan jaringan, memberi respon terhadap sinyal-sinyal interseluler, lingkungan dan siklus sel.
Regulasi (pengaturan) dari ekspresi gen diperantarai oleh adanya pengenalan yang spesifik atas cis-acting element yang ada pada bagian promotor dari gen target terhadap trans acting specific sequent DNA-binding factor dari gen regulator (Schwechheimer and Bevan 1998). Beberapa kelas dari faktor transkripsi terkait dengan respon pertahanan (Chen 2004). Faktor transkripsi dapat meregulasikan banyak gen untuk mengekspresikan sifat-sifat tertentu. Faktor transkripsi mempunyai kemampuan untuk menempel pada bagian promotor dari gen-gen target dan meningkatkan atau menekan transkripsinya.
Saat ini dimungkinkan untuk melakukan rekayasa genetik untuk perbaikan ketahanan tanaman terhadap patogen melalui modifikasi tingkat ekspresi dari
faktor transkripsi yang terlibat dalam mekanisme pertahanan. Untuk memodifikasi tingkat ekspresi dapat dilakukan dengan strategi over-ekspresi dari gen regulator yang terkait dengan sistem pertahanan tanaman.
Beberapa penelitian telah menunjukkan keberhasilan dalam mendapatkan tanaman padi tahan penyakit dengan menggunakan teknik transformasi dengan strategi overekspresi. Penelitian overekspresi dari gen penyandi protein regulator Mitogen-activated protein kinase-1 (MK1) dari Capsicum annuum dan OsMAPK5 meningkatkan ketahanan terhadap cendawan blas pada padi. Overekspresi dari gen MK1 dan OsMAPK5 ini menyebabkan peningkatan ekspresi dari gen-gen yang terkait dengan patogenisitas yaitu PR1a, PR1b, dan PR10 yang mungkin bertanggung jawab terhadap peningkatan ketahanan terhadap blas (Xiong dan Yang 2003; Lee et al. 2004). Sedangkan penelitian overekspresi gen OsWRKY13 yang dilakukan oleh Qiu et al. (2007) menunjukkan hasil peningkatan ketahanan tanaman padi terhadap patogen blas dan blb. Penelitian selanjutnya (Qiu et al. 2007) menunjukkan bahwa OsWRKY13 bertindak sebagai activator dari jalur persinyalan asam salisilat dan bertindak sebagai repressor (penekan) dari jalur persinyalan asam jasmonat. OsWRKY13 dapat secara langsung maupun tidak langsung mengatur ekspresi dari gen-gen-gen upstream maupun downstream dari asam salisilat dan asam jasmonat. Asam salisilat dan asam jasmonat merupakan molekul yang telah diketahui terlibat dalam persinyalan untuk mengaktifkan gen- gen yang terlibat dalam pertahanan terhadap berbagai serangan patogen pada tanaman (Ryu et al. 2006; Qiu et al. 2007).
WRKY merupakan suatu protein faktor transkripsi yang terlibat dalam regulasi jalur respon pertahanan tanaman. Famili atau keluarga faktor transkripsi WRKY banyak berperan di dalam merespon stres biotik dan abiotik, proses penuaan, perkecambahan biji, dan perkembangan trikoma (Zhang et al. 2004; Chen 2004; Franzisca et. al. 2004). Banyak protein WRKY yang terlibat dalam pertahanan terhadap serangan patogen tanaman (Ryu et al. 2006). Protein WRKY adalah protein yang terdiri dari ± 60 asam amino yang mengandung N-terminal heptapeptida WRKYGQK (secara berurutan adalah asam amino: Triptopan, Arginin, Lisin, Tirosin, Glisin, Glutamin, dan Lisin) dan satu C-terminal yang berupa struktur yang menyerupai “zinc-finger”. Untuk dapat mengatur ekspresi
gen, protein WRKY mengikat secara spesifik pada urutan DNA (T)(T)TGACC(C/T) yang dikenal dengan “W-box” yang terdapat pada daerah promotor dari gen-gen target. Sejumlah gen yang berhubungan dengan pertahanan, termasuk gen PR (pathogenesis releted), mengandung “W-box” pada daerah promotornya. Dengan kemampuan menempel pada bagian promoter dari gen target tersebut, protein WRKY akan mampu menekan atau meningkatkan transkripsi dari gen target (Zang and Wang 2005; Ryu et al. 2006).
Pada tanaman padi diperkirakan terdapat 109 gen yang termasuk dalam famili OsWRKY, tetapi banyak dari gen-gen tersebut belum diketahui fungsinya (Zhang and Wang 2005; Qiu et al. 2007). Gen OsWRKY76 terletak pada segmen di kromosom 9 tanaman padi yang sebelumnya diidentifikasi terkait dengan ketahanan berspektrum luas (Wisser et al. 2005).
Untuk mendukung kegiatan rekayasa genetik tanaman, teknologi kloning gen yang bertujuan untuk mendapatkan konstruk dari kandidat gen adalah salah satu kegiatan yang penting dilakukan. Suatu gen dapat berfungsi dengan baik (dapat melakukan fungsi gennya) apabila mempunyai bagian-bagian yang disebut promotor, unit transkripsional, dan terminator. Promotor adalah suatu bagian dari gen yang berfungsi untuk mengatur proses transkripsi. Unit transkripsional adalah bagian dari gen yang ditranskripsikan sehingga menghasilkan produk protein. Terminator adalah bagian dari gen yang mengakhiri proses transkripsi.
Ada beberapa tahapan yang harus dilakukan dalam kegiatan kloning gen, yaitu : isolasi DNA (gen), penyisipan DNA ke dalam sistem vektor untuk membentuk vektor rekombinan dan introduksi vektor rekombinan yang membawa sisipan ke dalam sel inang. Sedangkan perangkat yang diperlukan dalam kloning ini adalah vektor (biotransport) yaitu molekul pembawa DNA, enzim restriksi dan enzim ligase (Campbell et al. 2002).
Kegiatan perakitan tanaman transgenik yang melibatkan transfer DNA asing dari luar ke dalam tanaman target keberhasilannya selain tergantung pada gen yang dimasukkan ke dalam tanaman target, sistem transformasi dan regenerasi tanaman transgenik, juga sangat tergantung pada tingkat ekspresi dari gen yang dimasukkan di dalam tanaman target. Teknik transfer gen melalui Agrobacterium telah banyak dilakukan untuk pengembangan tanaman tahan
terhadap hama dan penyakit. A tumefaciens menginfeksi tanaman dan mengintroduksikan sebagian dari plasmid-Ti (tumor inducing) yang disebut dengan T-DNA (transfer DNA) ke dalam genom tanaman. Fragmen T-DNA yang berpindah dari sel bakteri ke dalam sel tanaman akan terintegrasi secara stabil dalam genom inti. Proses integrasi T-DNA ke dalam genom tanaman diatur dan dikontrol oleh beberapa gen yang dikenal dengan gen Vir pada plasmid Ti.
Menurut Opabode (2006) efisiensi transformasi menggunakan Agrobacterium tumefaciens dalam pembentukan tanaman transgenik sangat tergantung dari beberapa hal diantaranya adalah genotipe tanaman, strain Agrobacterium, vektor plasmid biner, senyawa penginduksi gen Vir, komposisi medium transformasi, dan suhu lingkungan.
Pada penelitian ini dilakukan konstruksi dan introduksi konstruk over- ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam tanaman padi Nipponbare melalui A. tumefaciens. Adapun tujuan dari kegiatan ini adalah merakit (mengkonstruksi) dan mengintroduksikan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam tanaman padi Nipponbare melalui A. tumefaciens.