Serangan penyakit blas pada tanaman padi yang disebabkan oleh cendawan Pyricularia grisea dapat menurunkan hasil 1-50 % (Scardaci et al. 1997), sedangkan apabila menyerang leher malai pada fase generatif kehilangan hasil dapat mencapai 100 % (Ou 1985). Penyakit blas merupakan kendala utama pada padi gogo, tetapi dewasa ini penyakit tersebut mulai meluas pada pertanaman padi sawah (Rahamma & Hasanuddin 1993). Cendawan blas cepat berubah virulensinya, tergantung pada genotipe inang dan lingkungan sekitarnya (Utami 1999).
Penggunaan varietas tahan terhadap penyakit merupakan cara yang paling efektif dan efisien dalam menanggulangi penyakit blas sehingga dapat meningkatkan hasil. Strategi pemuliaan yang dilakukan selama ini adalah dengan merakit varietas yang tahan terhadap jenis patogen atau ras patogen tertentu, dimana yang dimanipulasi adalah gen-gen ketahanan (gen R) yang terkait dengan pertahanan tanaman yang bersifat spesifik (ketahanan vertikal). Namun demikian kelemahan dengan pendekatan tersebut adalah varietas yang berhasil dirakit ketahanannya tidak berumur panjang atau ketahanannya akan mudah patah, dikarenakan akan timbul ras patogen baru yang dapat menembus atau mengatasi ketahanan tersebut. Sehingga pendekatan pemuliaan dengan memanipulasi ketahanan secara vertikal harus dibarengi dengan pendekatan pemuliaan pembentukan ketahanan secara horisontal. Ketahanan horisontal melibatkan proses-proses fisiologis inang yang berperan sebagai mekanisme pertahanan dan berada di atas batas kapasitas patogen untuk merubahnya (Agrios 1996).
Telah diketahui bahwa faktor transkripsi dapat meregulasikan banyak gen untuk mengekspresikan sifat-sifat tertentu. Faktor transkripsi mempunyai kemampuan untuk menempel pada bagian promotor dari gen-gen target dan meningkatkan atau menekan transkripsinya. Oleh karena itu pemuliaan tanaman dengan memanfaatkan teknologi DNA untuk mendapatkan varietas tahan penyakit dapat dilakukan dengan memanipulasi pada jalur pertahanan tanaman. Manipulasi dapat dilakukan dengan memodifikasi tingkat ekspresi dari gen regulator yang meregulasikan gen-gen yang terkait dengan pertahanan tanaman. Faktor
transkripsi yang sudah diketahui terlibat dalam mekanisme pertahanan tanaman terhadap patogen diantaranya adalah WRKY, ERF, bZIP, dan MYB (Chakravarthy et. al. 2003). Saat ini dimungkinkan untuk melakukan rekayasa genetik untuk perbaikan ketahanan tanaman terhadap patogen melalui modifikasi tingkat ekspresi dari faktor transkripsi yang terlibat dalam mekanisme pertahanan. Untuk memodifikasi tingkat ekspresi dapat dilakukan dengan strategi over-ekspresi dari gen regulator yang terkait dengan sistem pertahanan tanaman. Diharapkan dari hasil modifikasi tersebut akan meningkatkan ekspresi dari gen regulator, sehingga tanaman yang rentan dapat memproduksi protein-protein protektif yang disandikan oleh gen-gen yang menjadi target dari gen regulator itu.
Pada percobaan I, yang bertujuan merakit vektor over-ekspresi gen digunakan gen faktor transkripsi OsWRKY76, dikarenakan adanya bukti bahwa gen tersebut meningkat ekspresinya setelah tanaman padi yang tahan diinokulasi dengan cendawan Pyricularia grisea (Ryu et al. 2006). Disamping itu gen tersebut telah diidentifikasi terletak pada segmen di kromosom 9 dari tanaman padi yang terkait dengan ketahanan penyakit spektrum luas (Wisser et al. 2005). Untuk melakukan over-ekspresi terhadap gen OsWRKY76 dalam kegiatan ini digunakan promotor 35SCaMV yang merupakan promotor yang kuat, diekspresikan secara terus-menerus dan diekspresikan disemua bagian jaringan. Promotor 35SCaMV telah banyak dipakai di dalam mengendalikan proses transkripsi dari gen asing yang diintroduksikan ke dalam tanaman. Namun demikian, nanti ke depan setelah diketahui keefektifan dari over-ekspresi gen OsWRKY76 dalam menanggulangi serangan patogen, penggunaan promotor yang bersifat inducible akan lebih baik apabila akan merakit suatu varietas tahan terhadap patogen. Penggunaan promotor inducible dapat mengurangi tekanan pada tanaman karena efek ekspresi yang terus-menerus dan level tinggi dari gen regulator beserta gen targetnya yang diintroduksikan di dalam tanaman dikawatirkan akan membawa dampak kompensasi pada pertumbuhan tanaman.
Vektor biner yang digunakan pada penelitian ini adalah pCAMBIA-1301 karena selain terdapat enzim restriksi yang sesuai pada daerah MCS (Multi Cloning Site) yang cocok untuk kegiatan kloning, juga pada daerah T-DNAnya
mengandung gen ketahanan terhadap antibiotik higromisin yang sesuai untuk seleksi pada kalus padi.
Pada kegiatan transformasi padi, varietas Nipponbare (Japonica) digunakan sebagai sumber eksplan untuk kegiatan transformasi. Hal tersebut dikarenakan Nipponbare mempunyai kompetensi regenerasi dan transformasi yang tinggi (Hiei et al. 1994). Penggunaan sumber eksplan yang mempunyai kompetensi regenerasi dan transformasi yang tinggi akan sangat membantu di dalam memperoleh transforman. Namun demikian, untuk kedepannya setelah diketahui keefektifan dari over-ekspresi gen OsWRKY76 dapat dilakukan transformasi pada verietas-varietas padi elit yang telah dikembangkan di Indonesia. Varietas-varietas elit biasanya dari golongan Indica, dimana pada umumnya mempunyai kompetensi regenerasi dan transformasi yang rendah. Strain bakteri A. tumefaciens yang digunakan untuk transformasi adalah Agl-1 dan EHA 105 yang merupakan jenis strain yang supervirulen. Virulensi bakteri yang tinggi diharapkan dapat menginfeksi eksplan lebih kuat dibandingkan dengan strain yang kurang virulen. Namun demikian, ternyata pada penelitian ini strain Agl-1 lebih banyak menghasilkan jumlah galur independen dibandingkan dengan strain EHA 105. Hal ini mengindikasikan bahwa strain Agl-1 lebih kompatibel dalam menginfeksi kalus padi Nipponbare. Seperti yang dikemukakan oleh Opabode (2006) bahwa strain bakteri berpengaruh terhadap efisiensi transformasi.
Kegiatan transformasi tersebut bertujuan untuk mengintroduksikan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam genom tanaman padi Nipponbare. Untuk menguji keberadaan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 di dalam jaringan tanaman dilakukan deteksi dengan teknik PCR. Hasil analisis PCR menunjukkan dari 25 galur independen generasi T0 yang diuji semuanya memperlihatkan positif mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76. Hal ini dapat mengindikasikan bahwa prosedur transformasi yang mengacu pada metode Groco et al. (2001) sangat efisien untuk tanaman padi Nipponbare.
Percobaan II dilakukan untuk menganalisis integrasi gen OsWRKY76 di dalam genom tanaman dengan menggunakan teknik hibridisasi Southern. Metode ini dapat digunakan untuk mengetahui informasi tentang integrasi dan jumlah kopi
dari transgen. Dari hasil analisis Southern diperoleh informasi dari 26 galur independen generasi T0 yang dianalisis terdapat variasi jumlah kopi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 di dalam genom tanaman transgenik, yaitu antara 1-4 kopi. Jumlah sisipan atau kopi gen di dalam genom tanaman sangat mempengaruhi ekspresi dari transgen tersebut di dalam tanaman. Semakin banyak jumlah kopi gen di dalam genom tanaman maka ekspresi gen akan kurang stabil yang diakibatkan adanya pembungkaman gen (gene silencing). Selain itu ekspresi gen juga dipengaruhi oleh lokasi masuknya gen di dalam genom tanaman yang dikenal dengan istilah efek posisi gen (positional effect).
Kegiatan selanjutnya adalah uji efek over-ekspresi gen OsWRKY76 terhadap cendawan blas (Pyricularia grisea). Kegiatan ini dilakukan untuk menguji efektifitas dari over-ekspresi gen OsWRKY76 yang telah diintroduksikan di dalam tanaman. Uji ini sangat penting dilakukan karena untuk menarik suatu kesimpulan, apakah over-ekspresi gen OsWRKY76 akan mampu mengatasi serangan cendawan blas pada tanaman padi Nipponbare. Apabila over-ekspresi gen OsWRKY76 mampu mengatasi serangan cendawan blas, maka strategi over- ekspresi gen OsWRKY76 dapat digunakan untuk memperbaiki ketahanan terhadap cendawan blas pada tanaman padi varietas elit lainnya. Dalam percobaan ini, untuk menghindari adanya efek pembungkaman gen (gene silencing), maka yang diuji adalah galur-galur yang mempunyai jumlah kopi tunggal konstruk over- ekspresi gen OsWRKY76 di dalam genom tanaman berdasar analisis Southern. Dari 6 galur independen yang diuji, terdapat 3 galur independen (NAW 1.1, NAW 36.1, dan NAW 37.2) yang memperlihatkan tingkat ketahanan lebih baik dari tanaman Nipponbare non-transgenik terhadap isolat uji 173. Namun demikian, dari percobaan ini terdapat 3 galur yang tingkat ketahanannya tidak berbeda dengan tanaman Nipponbare non-transgenik. Hal ini memperlihatkan adanya efek posisi gen over-ekspresi OsWRKY76 di dalam genom tanaman. Galur-galur yang lebih tahan dari tanaman non-transgenik menunjukkan bahwa konstruk over- ekspresi gen OsWRKY76 kemungkinan besar masuk di kromosom pada daerah eukromatin, sehingga gen dapat terekspresi dengan baik. Sebaliknya, galur tanaman transgenik yang memperlihatkan ketahanan tidak berbeda dengan tanaman non-transgenik kemungkinan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76
masuk di kromosom pada daerah heterokromatin sehingga gen tidak dapat terekspresi dengan baik. Namun demikian hal ini masih harus dikonfirmasi lebih lanjut. Dari hasil tersebut dapat mengindikasikan bahwa gen OsWRKY76 memang terkait dengan sistem pertahanan tanaman padi terhadap cendawan blas (Pyricularia grisea).